Summary
תחזיות סטריאוטיפית של afferents חושי אל חוט השדרה מכרסם להציע מערכת ניסיונית נגיש ללמוד axonal מסתעפת דרך התחקות של אקסונים יחיד.
Abstract
כאן אנו מציגים טכניקה התווית מסלולים של קבוצות קטנות של נוירונים DRG לתוך חוט השדרה העובר על ידי מכתים diffusive באמצעות נותב lipophilic 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3 ", 3'-tetramethylindocarbocyanine (DiI) פרכלורט 1 . ההשוואה בין המסלולים axonal של wild-type עם אלה של קווי העכבר אילו גנים שעברו מוטציה המאפשרת בדיקת תפקיד פונקציונלי של חלבונים מועמד בשליטה על הסתעפות axonal המהווה מנגנון חיוני החיווט של מערכת העצבים. הסתעפות axonal מאפשר נוירון יחיד להתחבר עם מטרות מרובות, ובכך לספק את הבסיס הפיזי של עיבוד מקבילי של מידע. השלכות על אזורים יעד ביניים של צמיחה axonal ניתן להבחין בין arborization סופנית. יתר על כן, מצבים שונים של היווצרות ענף axonal ניתן לסווג תלוי אם תוצאות מסתעפת מן הפעילויות של חרוט צמיחה (פיצול או חזייה מתעכבnching) או מפני נביטה של בטחונות מן הפיר האקסון בתהליך הנקרא הסתעפות ביניים 2 (איור 1).
תחזיות המרכזית של נוירונים של DRG להציע מערכת ניסיונית שימושי ללמוד את שני הסוגים של הסתעפות axonal: כאשר האקסונים שלהם מביא להגיע השורש הגבי כניסה לאזור (דח) של חוט השדרה העובר בין ימים 10-13 (E10 - E13) הם התצוגה דפוס סטריאוטיפי של T-Y או בצורת הסתעפות. שני אקסונים הבת וכתוצאה מכן להמשיך בכיוונים מקורי או הזנב, בהתאמה, בשוליים דורסולטרלי של חוט ורק לאחר תקופת המתנה בטחונות צומחים מתוך גזע אקסונים אלה לחדור את החומר האפור (ביניים הסתעפות) ואת פרויקט ספציפי של נוירונים ממסר רבדים של חוט השדרה שם הם עוד arborize (מסוף הסתעפות) 3. העתקים DiI חשפו קונוסים צמיחה בכל אזור הכניסה השורש הגבי של חוט השדרה זה נראה ב-PRocess של פיצול טוען כי הסתעפות נגרמת על ידי פיצול של חרוט הצמיחה עצמה 4 (איור 2), עם זאת, אפשרויות אחרות נדונו גם 5.
וידאו זה מדגים הראשונה איך לנתח את עמוד השדרה של עכברים E12.5 עוזב DRG המצורפת. קיבעון בעקבות הסכומים דגימה קטנה של DiI מוחלים DRG באמצעות מחטים זכוכית משך משפופרות נימי. לאחר שלב דגירה, חוט השדרה שכותרתו מותקן כהכנה פתוח ספר הפוך לנתח אקסונים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Protocol
1. Dissection ההליך
הערה: שימוש ניסיוני של עכברים צריך לעקוב אושרה רשמית הנחיות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה.
- לפני ההכנה, להגדיר מיקרוסקופ לנתח שלך לפרוס את מכשירי ניתוח הדרוש לנתיחה כולל מספריים גדולים וקטנים, מלקחיים שיניים גדולות, מלקחיים מעוקל ארבעה סטים של דומון No.5 לנתח מלקחיים (שתיים מהן בתוך מלוטשת טיפים) ( לפרטים ראה טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד). מניחים פיסת נייר מסנן צלחת 100 מ"מ פטרי Sylgard מצופה. יוצקים קר PBS בבארות של צלחת 12 באר, צלחת פטרי 100 מ"מ ו - צינור 12 מ"ל ולהשאיר על הקרח. פיפטה 2ml של חיץ קיבעון (paraformaldehyde 4% ב-PBS, pH 7.4) היטב כל צלחת 12 גם המקום השני על הקרח.
- לאחר הרדמה, להקריב את הסכר בהריון בעיתוי ב E12.5 (זיהוי של תוסף הנרתיק יועד E0.5), במקום את העכברעם למעלה בצד הגחון שלו על שלושה גיליונות של מגבות נייר להשרות את אזור הבטן עם אתנול 70%.
- פתח את חלל abdominopelvic, לבודד את קרני הרחם דו צדדי ולהעביר אותם לתוך אחד 100 מ"מ עם מאכלים קרים כקרח PBS.
- תחת בקרה מיקרוסקופית, לעשות חתך אורכי דופן הרחם עם, מספריים קטנים ישר לחתוך כל שק השפיר של השליה.
- קלף את שק השפיר של העובר כל לחתוך את חבל הטבור.
- בעזרת מספריים קטנים, לערוף את העוברים ולשים את הראש או חלק מהם בצד הבידוד של הדנ"א הגנומי אם genotyping צריכה להיות חובה. לאחר מכן, להעביר את torsi את בארות בהתאמה של הצלחת 12-היטב עם קור PBS.
- להרטיב את נייר הסינון בצלחת Sylgard עם כמה טיפות של PBS ואת המיקום הטורסו עובריים עם הצד הגבי שלה על הנייר. כדי להשיג יציבות טובה יותר, ליישר את זנבו הגפיים מהגוף.
- עבודהתחת מיקרוסקופ לנתח עם הגדלה של כ 16x, בזהירות קמצוץ את עור העובר מעל חוט השדרה עם שני זוגות מלקחיים היטה בסדר בעדינות לקרוע אותו לגזרים. החל באמצע, המשך ראשון לקראת הזנב ואז לחדש מאמצע כלפי הצד הקדמי.
- להרטיב את העובר מעת לעת עם שתיים או שלוש טיפות של PBS כדי למנוע התייבשות.
- כדי למנוע זאת DRG הם דמעו מן חוט השדרה כאשר הוא הוסר העובר לנתק את DRG ואת חוט השדרה מהעמודה סביב השדרה סחוסי ידי תנועות החלקה אופקי עם להב של מלקחיים בסדר בתוך מלוטשת טיפים. החל באמצע הצד הימני של העובר, דרך העבודה שלך לכיוון הזנב ואז לסיים את הקדמי. לאחר מכן, לחזור על התהליך בצד השני. היזהר שלא לקרוע את DRG קשור.
- כדי לנתק לחלוטין את חוט השדרה משוחרר מן העובר, להרים cervic שלהאל חלק עם מלקחיים בסדר למשוך אותו החוצה בחתיכה אחת לקראת סוף הזנב שלה.
- להטביע את חוט השדרה מבודד עם DRG מחוברת היטב של צלחת 12-הבאר מלא חיץ קיבעון ולהמשיך עם הכנת מיתרי השדרה של העוברים הנותרים.
- תקן מיתרי השדרה לפחות שעתיים על הקרח.
2. DiI תיוג של נוירונים DRG
- במשך כל חוט השדרה כדי להיות מתויג, להכין שתי מחטים זכוכית עם חולץ micropipette. אנו משתמשים במודל סאטר חולץ P-97 אלקטרודה (הגדרת התוכנית: 1 היט = 625, לוול ךיב = 35, TIME = 175; היט 2 = 600, לוול ךיב = 25, TIME = 175; היט 3 = 630, לוול ךיב =... 30, TIME = 150).
- תחת בקרה מיקרוסקופית לטבול את קצה מחט כל כוס שלוש עד חמש פעמים בתמיסה (w / v) 5% DiI באתנול. אידוי של אתנול יוצר שכבה דקה של קריסטלים DiI על המחט.
- עבודה תחת מיקרוסקופ לנתח עם הגדלה של 40X בערך, במקום חוט השדרה שלה עם vבצד entral עד בשקופית. בעזרת מספריים באביב, פתח את חוט בצד הגחון ב אורכו על ידי חיתוך דרך floorplate כדי לאפשר לאחר מכן הרכבה של הכנת במצב ספר פתוח, הפוכה (ראה סעיף ג).
- מקם את חוט השדרה עם הצד הגבי עד בשקופית. ואז באופן ידני הגישה את כבל עם קצה DiI המכוסה של המחט תחת זכוכית להדמיה מיקרוסקופית ובזהירות לנקב כל DRG השני בצד אחד של חוט השדרה. אין כמעט עקבות של DiI צריך להיות גלוי DRG פירסינג כדי להבטיח את תיוג של מספר קטן בלבד של נוירונים. קח מחט השני בצד השני של החוט. מכוון רק כל DRG second נמנעת חפיפה של תחזיות axonal שכותרתו מ DRG שכנות אשר עלול לסבך את הבידול של אקסונים בודדים.
- החזר את חוט השדרה למאגר קיבעון ו דגירה בחושך במשך לפחות שש שעות בטמפרטורת הסביבה או לילה ב 4 ° C כדי לתת זמן כדי לצבוע diffuse לאורך האקסון בתוך קרום התא. אפשר לתקופת דגירה ארוכה יותר (עד יומיים ב 4 ° C) אם הניתוח של צמיחה בטחונות לתוך חוט השדרה הוא הרצוי.
3. הרכבה ואת ניתוח מיקרוסקופי
- בעקבות עמדת לצבוע דיפוזיה, חוט השדרה יחיד עם הצד הגבי שלה על coverslip לירידה של PBS. תשמרי על עצמך כי DRG המחוברים בצורה נכונה אוריינטציה רוחבית לא להתערבב. לשאוב נוזל עודף לרדד את כבל במצב פתוח ספר הפוכה באמצעות מלקחיים.
- בהר הכנה בשקופית באמצעות מיקרוסקופ PBS.
- כדי למנוע גידול של ניתוח כתמים לא רצויים ברקע מיקרוסקופיים הקרינה של תחזיות axonal שכותרתו אמור להתבצע ביום גובר. עד אז לשמור את השקופיות בחושך ב 4 ° C.
4. נציג תוצאות:
חוט השדרה של העכבר מקבל יחסי ציבור מביאojections מתוך 8 זוגות של צוואר הרחם, 13 זוגות של החזה, 5 זוגות זוגות המותני ו -4 של עצם העצה DRG בהיקף של עד 60 הגרעינים השדרה. לאחר כמה אימונים חוט שדרה עם DRG הכי מחוברת עדיין יכול להיות מבודד העובר בתוך פחות מחמש דקות. הליך זה מתאים הבידוד של מיתרי השדרה עם DRG המצורפת מתוך E11.5 כדי E13.5 עוברי עכברים. עם זאת, התוצאות הטובות ביותר מושגות מתוך E12.5. תוצאות למופת של ההליך תיוג המתואר כאן מוצגים באיור 3. תיוג של DRG על אורכו של חוט השדרה עלול לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכמת התנהגות הסתעפות axonal ברמות שונות בחוליות (איור 4).
באיור 1. תוכנית המתארת את שני המצבים העיקריים של הסתעפות axonal. (א) מסעף ידי הפעילויות של חרוט צמיחה שעלולה להוביל הסתעפות - כפי שצוין כאן - כמו גם סוכות מסוף מורכבים או(ב) בטחונות היווצרות הפיר האקסון (ביניים הסתעפות). מצב זה האחרון הוא סוג של הסתעפות שולט מקרין אקסונים הקורטיקליים thalamocortical 6,7.
איור 2 מביא תחזיות של נוירונים DRG לתוך חוט השדרה העובר להציג שני סוגים של הסתעפות axonal:. אקסונים הסניף הראשון דח על ידי הסתעפות (1) ו מן הטופס סניפים בטחונות וכתוצאה מכך הבת לאחר תקופת המתנה על ידי ביניים הסתעפות (2).
באיור 3. ויזואליזציה של מסלולי axonal יחיד של נוירונים DRG עובריים בעכבר. (א) חוט השדרה עם DRG מצורף מוכן מעובר E12.5 העכבר. (סרגל קנה מידה, 1 מ"מ.) (BD) צפיות הגבי של DRG-DiI שכותרתו של wild-type עכברים בהגדלה הגדלת מוצגים. ב 'כל DRG השני הוא labeleד על ידי DiI. תמונות הקרינה הם הפוכים, הזנב הוא בצד שמאל וב C ו-D, לרוחב הוא בתחתית. ב C מספר קטן של אקסונים הוא שכותרתו בהגדלה גבוהה נוכחות של T-כמו ענפים ניתן לזהות דח של חוט השדרה. (מוטות קנה מידה, 250 מיקרומטר (ב), 100 מיקרומטר (ג) ו - 50 מיקרומטר (ד)).
איור 4. כימות בצורת האות T סניפים, פונה מקורי או הזנב יחיד wild-type ו-C-type natriuretic פפטיד (CNP) מחסר עכברים בבית E13.5. המספרים של אקסונים יחיד נספר ניתנים בסוגריים רמות גזע שונה גנוטיפ של כל אחד. C-או R-הופך - צמיחה רק בכיוון הזנב או מקורי, בהתאמה.
איור 5. מסלול איתות cGMP מעורר הסתעפות האקסון חושי בשעה דח של חוט השדרה. (א) סכמתאת מסלול איתות cGMP המורכבת ליגנד CNP, הקולטן guanylyl cyclase Npr2 ואת סרין / תראונין קינאז cGKIα בנוירונים DRG עובריים. Npr2 מייצר cGMP מ GTP על ידי גירוי CNP. (ב) DiI מעקב של אקסונים יחיד של DRG נוירונים בעכברים wild-type ו-CNP לקוי. (סרגל קנה מידה, 25 מיקרומטר).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דפוסי הקרנת סטריאוטיפית הכוללת את שני הסוגים של היווצרות ענף axonal יחד עם קלות הכנה בשילוב עם שימוש ברקמת קבוע DiI תיוג הופך את חוט השדרה העובר צמוד עם DRG מודל חיובי ללמוד axonal הסתעפות. היישום של כמויות זעירות של DiI באמצעות מחטים זכוכית מצופה מאפשר - בניגוד תיוג עיקר DRG - להדמיה של קבוצות קטנות של נוירונים DRG ובכך ניתוח של אקסונים הפרט דפוסי הסתעפות שלהם. השיטה המתוארת אפשר לשפר עוד יותר על ידי הזרקת iontophoretic של נותב lipophilic אשר מקטין עוד יותר את מספר הנוירונים שכותרתו 8. עם זאת, זה יהיה עוד זמן רב.
תיוג DiI של מסלולי axonal יחיד בהכנות הר שלם של חוט השדרה העובר היה אינסטרומנטלי זיהוי של CNP cGMP האיתות מפל, המהווים ליגנד, הרצפטור שלו Npr2, ואתcGMP תלויי קינאז cGKIα - המווסת את סוג אחד של הסתעפות axonal: הסתעפות של DRG נוירונים ב דח 4,5,9-12. בניגוד wild-type, האקסונים של הנוירונים DRG מוטנטים איתות cGMP לפנות רק בכיוון אחד, במקום מתפצל ב דח (איור 5). מחקרים אלו הראו גם, כי היווצרות בטחונות לא היה מושפע מוטנטים איתות cGMP המציין כי זה הסוג השני של היווצרות ענף שנצפתה נוירונים DRG מוסדר באופן שונה 4.
לחלופין, התנהגות ההסתעפות של אקסונים DRG יחיד יכול להיות גם למד קווי עכבר מהונדס או לבטא חלבון פלואורסצנטי בתת קטן בלבד של DRG נוירונים 13 או המכיל שילוב של סמנים ניאון המאפשר אחד כדי להבחין בין נוירונים בודדים 14. עם זאת, מאמץ לחצות מסוגם במודל עכבר מוטנטי כדי להיות מנותח עם קווי עכבר פלורסנט יש לבחון. יתר על כן, בשל promotor (Thy1) ביטוי בשימוש של חלבוני ניאון בקווי עכבר מהונדס מתחיל רק בשלבים שלאחר הלידה ולכן קשה לברר אם פנוטיפ הסתעפות שנצפה הוא תוצאה של היווצרות ענף לקוי במהלך ההתפתחות העוברית או ניוון מאוחר יותר התהליך במקום. לעומת זאת, DiI תיוג של עוברי DRG יש יתרון ללמוד את התהליך של הסתעפות axonal והפרעה שלה מוטנטים העכבר המתאים בזמן הסתעפות axonal מתרחשת.
ההכנות של מיתרי השדרה עובריים עם DRG המצורף עשוי לשמש נוסף עבור הליכים תיוג אחרים (הר שלם ב-situ הכלאה, LacZ או AP-מכתים של העכברים הטרנסגניים), אוסף של חוט השדרה וברקמות DRG לבידוד-RNA, או כאשר מותאם בתנאים סטריליים לתרבות ניסויים ברקמות ואפליקציות הדמיה במורד הזרם כמו סידן או מדידות אלקטרו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר אליסטר Garratt (מקס Delbrück מרכז ברלין) על הערות מועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מרכז מחקר שיתופי (SFB665) של מועצת המחקר הגרמנית (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O'Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
