Summary
Стереотипные проекции сенсорных афферентов в спинном мозге грызунов предлагаем легко доступны экспериментальной системы для изучения аксонального ветвления через отслеживание одного аксонов.
Abstract
Здесь мы представляем технику для обозначения траектории небольших групп нейронов DRG в эмбриональном спинного мозга диффузионного окрашивания использованием липофильных трассирующими 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (DII) 1 . Сравнение аксонального пути дикого типа с теми, мыши строки, в которых гены мутировали позволяет тестирование на функциональную роль кандидата белков в управление аксонального ветвления которых является существенным механизмом проводки нервной системы. Аксонального ветвлений позволяет отдельного нейрона, чтобы соединиться с несколькими целями, обеспечивая тем самым физическую основу для параллельной обработки информации. Ветви на промежуточных целевых регионах в рост аксонов можно отличить от терминала разветвление. Кроме того, различные режимы аксонального формирование отделения могут быть классифицированы в зависимости от того, ветвление результаты деятельности роста конуса (расщепления или задержки бюстгальтерnching) или от начинающего коллатералей от аксона вала в процессе, называемом интерстициальный ветвления 2 (рис. 1).
Центральной проекции нейронов DRG предлагаем полезную экспериментальная система для изучения обоих типов аксонального разветвления: когда их афферентные аксоны достигают спинного зоне корневой записи (DREZ) спинного мозга между эмбриональными дней от 10 до 13 (E10 - E13), они дисплей стереотипные картины Т-или У-образный бифуркации. Два полученных аксонов дочь действовать на ростральной или хвостового направлений, соответственно, на дорсолатеральной краю шнуром, и только после ожидания залогов период прорастают из этих стволовых аксонов проникнуть серого вещества (интерстициальный ветвления) и проект по релейной нейронов в специфических Пластинки спинного мозга, где они дальше ветвиться (терминал ветвления) 3. DII обводка показали рост конусами в спинной зоне корневой записи спинного мозга, который оказался в прocess расщепления предполагая, что бифуркации вызван расщеплением рост сам конус 4 (рис. 2), однако, и другие варианты были обсуждены также 5.
Это видео демонстрирует первые, как рассекают спинной мозг мышей E12.5 оставляя DRG прилагается. После фиксации образца небольшое количество DII применяются для DRG с использованием стеклянных игл вытащил из капилляров. После инкубации, помечены спинного мозга устанавливается в виде перевернутой буквы открытой книги подготовка к анализу отдельных аксонов с помощью флуоресцентной микроскопии.
Protocol
1. Препарирование процедуры
Примечание: Экспериментальное использование мыши должны следовать официально утверждены методические рекомендации по уходу и использованию лабораторных животных.
- Перед подготовкой, настроить рассекает микроскопа и выложить хирургических инструментов, необходимых для вскрытия в том числе большие и маленькие ножницы, большие зубчатые щипцы, изогнутые щипцы и четыре комплекта Дюмон № 5 рассекает щипцы (два из которых имеют внутри полированного советы) ( подробнее см. таблицу специфических реагентов и оборудования). Место лист фильтровальной бумаги в 100-мм Sylgard покрытием чашке Петри. Залить холодным ФСБ в лунки 12-луночного планшета, 100-мм чашки Петри и 12-мл трубку и выйти на лед. Внести 2 мл фиксации буфера (4% параформальдегида в PBS, рН 7,4) в каждую лунку второй 12-луночного планшета и место на льду.
- После обезболивания, жертвенность приурочен беременных плотины E12.5 (обнаружение вагинальной плагин был назначен E0.5), при наведениис его вентральной стороной вверх на трех листах бумаги полотенца и замочить брюшной области с 70% этанола.
- Открытое брюшной полости полости, изолировать двусторонних рогах матки и перенести их в один из 100-мм блюда с ледяным PBS.
- Под микроскопическим контролем, сделать продольный разрез стенки матки с небольшим, прямые ножницы и отрезать каждому амниотической оболочки от плаценты.
- Очистите от амниотической оболочки от каждого эмбриона и перерезать пуповину.
- Используя небольшие ножницы, обезглавить эмбрионов и положил голову или часть их в сторону для выделения геномной ДНК генотипирование, если требуется. Впоследствии, передача torsi к соответствующему скважин 12-луночного планшета с холодным PBS.
- Влажный бумажный фильтр в блюдо Sylgard с несколькими каплями PBS и положение эмбриональных торс с его спинной стороны на бумаге. Для лучшей стабильности, выпрямить ее хвост и конечности от тела человека.
- Рабочийпри вскрытии микроскоп с увеличением примерно 16x, тщательно ущипнуть кожу эмбрионе выше спинного мозга с двумя парами тонких наконечником пинцетом и аккуратно разорвать его на части. Начиная с середины, перейти сначала к хвосту, а затем возобновлении от середины к передней стороне.
- Влажные эмбриона, время от времени с двумя-тремя каплями PBS, чтобы предотвратить его от высыхания.
- Чтобы не допустить этого DRG являются развернулся от от спинного мозга, когда он удаляется из эмбриона отделить DRG и спинной мозг из окружающего хрящевой позвоночника горизонтальными скользящими движениями с лезвием тонкой щипцов с внутренней полированной советы. Начиная с середины правой стороны эмбриона, работать ваш путь к хвосту, а затем к переднему концу. Затем повторите процедуру с другой стороны. Будьте осторожны, чтобы не сорвать связанные DRG.
- Чтобы отключить полностью ослабить спинной мозг от эмбриона, забрать его cervicдр. часть с мелкими щипцов и вытащите его из одного куска к ее хвостовой конец.
- Погрузитесь изолированных спинного мозга с прикрепленными DRG в скважине 12-луночного планшета заполнены фиксации буфера и приступить к подготовке спинной мозг из оставшихся эмбрионов.
- Fix спинного мозга по крайней мере два часа на льду.
2. DII маркировки нейронов DRG
- Для каждого спинного мозга, подлежащих маркировке, подготовить две иглы стекла с съемник микропипетки. Мы используем модель Саттер Р-97 электрода съемник (программа установки: 1 ТЕПЛО = 625, VEL = 35, TIME = 175; 2 ТЕПЛО = 600, VEL = 25, ВРЕМЯ = 175, 3 ТЕПЛО = 630, VEL =... 30, TIME = 150).
- Под микроскопический контроль падения кончике иглы каждый стакан три-пять раз в 5% (вес / объем) раствор DII в этаноле. Испарение этанола создает тонкий слой кристаллов DII на игле.
- Работая под рассекает микроскоп с увеличением приблизительно 40x, место спинного мозга с его VЕНТРАЛЬНОЙ вверх на слайде. Использование весной ножницы, открытые шнур на брюшной стороне на всей своей длине, проходящем через floorplate, чтобы позже монтаж препарата в перевернутом открытой книги режиме (см. раздел С).
- Позиция спинного мозга с дорзальной стороны на слайде. Затем вручную подход шнур с DII покрытый кончик иглы под стеклом микроскопические визуализации и аккуратно проколоть каждый второй DRG на одной стороне спинного мозга. Почти никаких следов DII должны быть видны в пронзил DRG обеспечить маркировку лишь небольшое число нейронов. Возьмите вторую иглу для другой стороны мозга. Стремясь только каждый второй DRG избежать перекрытия меченых аксонального прогнозы из соседних DRG, которые могли бы осложнить дифференциации отдельных аксонов.
- Вернуться спинного мозга в буфер фиксации и инкубировать в темноте в течение не менее шести часов при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C, чтобы дать время для красителя диffuse вдоль аксона в плазматической мембране. Разрешить на более длительный инкубационный период (до двух дней при температуре 4 ° С), если анализ обеспечения роста в спинной мозг желательно.
3. Монтаж и микроскопического анализа
- После красителя диффузии, положение одного спинного мозга с его спинной стороной вниз на покровное в капле PBS. Позаботьтесь о том, прилагается DRG в правильной ориентации в стороны и не смешиваются. Аспирируйте лишней жидкости и выравниваться мозга в перевернутом открытом режиме с использованием книги щипцами.
- Горы препарат на предметное стекло микроскопа использованием PBS.
- Чтобы предотвратить увеличение нежелательного окрашивания фона флуоресценции микроскопического анализа меченых аксонального прогнозам должна осуществляться в день монтажа. До тех пор сохранить слайды в темноте при 4 ° C.
4. Представитель Результаты:
Спинного мозга мыши получает афферентные пр.ojections из 8 пар шейных, 13 пар грудных, 5 пар поясничных и 4 пары сакральное DRG на общую сумму 60 спинальных ганглиев. После некоторой тренировки спинного мозга с наиболее DRG еще привязаны может быть изолирован от эмбриона в возрасте до пяти минут. Эта процедура подходит для изоляции спинного мозга с прикрепленными DRG от E11.5 к E13.5 эмбрионов мыши. Тем не менее, наилучшие результаты достигаются от E12.5. Образцовый результаты маркировки процедуру, описанную здесь показаны на рисунке 3. Маркировка DRG по всей длине спинного мозга может быть использован для количественного аксонального ветвления поведения на разных позвоночных уровней (рис. 4).
Рисунок 1. Схема изображением двух основных режимах аксонального ветвления. (А) Ветвление деятельностью роста конус, который может привести к раздвоению - как указано здесь, - а также комплекс беседок терминала или(Б) обеспечения образования на валу аксона (интерстициальный ветвления). Последний режим является доминирующим типом ветвления проектирования корковых и таламокортикального аксонов 6,7.
Рисунок 2 Афферентные проекции DRG нейроны в спинном мозге эмбриональных отображения обоих типов аксонального ветвления. Аксоны первый филиал в DREZ от бифуркации (1) и из полученного дочерних ветвей залогов форму после периода ожидания междоузельными ветвления (2).
Рисунок 3. Визуализация одного аксонального траекториям эмбриональных нейронов DRG мыши. (А) спинного мозга с прикрепленными DRG приготовленный из E12.5 эмбриона мыши. (Масштаб бар, 1 мм.) (BD) Спинной видом DII меченных DRG от мышей дикого типа на повышение увеличением показаны. В B каждый второй DRG является labeleд в DII. Флуоресцентные изображения инвертируются, хвостовой находится на левой и на С и D, боковая находится на дне. В C небольшое количество аксонов обозначена и на большем увеличении присутствия Т-как ветви могут быть идентифицированы в DREZ спинного мозга. (Масштаб баров, 250 мкм (Б), 100 мкм (C) и 50 мкм (D).)
Рисунок 4. Количественное Т-образных ветвей, одна ростральной или хвостового превращается в дикого типа и C-тип натрийуретического пептида (CNP)-дефицитных мышей на E13.5. Количество аксонов одного рассчитывали в скобках приведены для различных уровней ствол для каждого генотипа. С-или R-очереди - рост только в хвостовом или ростральной направлении соответственно.
Рисунок 5. ЦГМФ сигнального пути триггеры сенсорных аксонов бифуркации в DREZ спинного мозга. (А) СхемацГМФ сигнальный путь состоит из лигандов CNP, рецептор guanylyl циклазы Npr2 и серин / треонин киназа cGKIα в эмбриональных нейронов DRG. Npr2 генерирует цГМФ из ГТФ при стимуляции CNP. (B) DII отслеживание одного аксоны нейронов DRG дикого типа и CNP-дефицитных мышей. (Масштаб бар, 25 мкм.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стереотипные проекции включающий оба типа аксонального формирование филиала вместе с простотой подготовки в сочетании с использованием основных тканей для DII маркировки делает эмбрионального спинного мозга с прикрепленными DRG благоприятной моделью для изучения аксонального ветвления. Применение незначительное количество DII использованием покрытием иглы стекла позволяет - в отличие от объемной маркировки DRG - визуализация небольших групп нейронов DRG и тем самым анализ отдельных аксонов и их ветвление узоры. Описанный метод может быть улучшено путем введения iontophoretic липофильных трассирующими что еще больше уменьшает количество меченых нейронов 8. Тем не менее, это будет более трудоемким.
DII маркировки одного аксонального траекториям в целом подготовка горе эмбрионального спинного мозга сыграл важную роль в идентификации цГМФ сигнальный каскад, включающий лиганд CNP, его рецептор Npr2, ицГМФ-зависимой киназы cGKIα - который регулирует один тип аксонального разветвления: бифуркации DRG нейроны в DREZ 4,5,9-12. В отличие от дикого типа, аксоны нейронов DRG цГМФ сигнализации мутантов свою очередь, только в одном направлении, а не на бифурцирующих DREZ (рис. 5). Эти исследования также показали, что формирование залога не была затронута в цГМФ сигнализации мутантов о том, что этот второй тип филиала образования наблюдается в нейронах DRG-разному регулируется 4.
Кроме того, ветвление поведения отдельных аксонов DRG могут быть изучены в трансгенных линий мышей выражения либо флуоресцентного белка лишь в небольшой части нейронов DRG 13 или содержащие комбинацию флуоресцентных маркеров, которые позволяют проводить различия между отдельными нейронами 14. Тем не менее, усилия по помесь мутант мышиной модели для анализа с флуоресцентной линии мыши должен быть рассмотрен. Кроме того, в связи с промотора (Thy1) использовали выражение флуоресцентных белков в трансгенных линий мышей начинается только в послеродовом этапов, что затрудняет, чтобы выяснить, наблюдается ветвление фенотип есть результат нарушения формирование филиала во время эмбрионального развития или более поздней дегенерации Процесс вместо этого. В противоположность этому, DII маркировки эмбриональных DRG имеет то преимущество, для изучения процесса аксонального ветвления и ее нарушения в соответствующих мутантов мыши в момент, когда аксонального ветвление.
Подготовка эмбрионального спинного мозга с прикрепленными DRG могут в дальнейшем использоваться для других процедур маркировки (целые горы на месте гибридизация, LacZ или AP-окрашивание трансгенных мышей), сбор спинного мозга и DRG ткани для РНК-изоляция, или с учетом адаптации в стерильных условиях на культуре ткани экспериментов и вниз по течению приложений, таких как изображения кальция или электрофизиологических измерений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Алистер Garratt (Дельбрюк центр, Берлин) за полезные комментарии. Эта работа была поддержана совместным исследовательским центром (SFB665) из Немецкого научно-исследовательского совета (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O'Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
