Summary
التوقعات النمطية للafferents الحسية في الحبل الشوكي القوارض توفر نظام يمكن الوصول إليها بسهولة تجريبية لدراسة المحاور المتفرعة من خلال تتبع محاور واحد.
Abstract
هنا نقدم تقنية لتسمية المسارات من مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية DRG في النخاع الشوكي الجنينية التي تلطيخ ناشر باستخدام التتبع محبة للدهون 1،1 '- dioctadecyl - 3 ، 3،3' ، 3' - tetramethylindocarbocyanine بيركلورات (الجاذبة) 1 . المقارنة بين مسارات محواري من نوع تلك البرية مع خطوط الماوس في تحور الجينات التي تسمح للاختبار لدور وظيفي للبروتينات مرشح في السيطرة على المحاور المتفرعة وهو آلية أساسية في الأسلاك في الجهاز العصبي. المتفرعة محواري تمكن خلية عصبية الفردية للتواصل مع أهداف متعددة ، وبالتالي توفير الأساس المادي للالمعالجة المتوازية للمعلومات. ويمكن التمييز بين تشعبات في المناطق المستهدفة وسيطة من النمو محواري تشجر من المحطة. وعلاوة على ذلك ، يمكن تصنيف أنماط مختلفة من تشكيل فرع محواري اعتمادا على ما إذا كانت النتائج المتفرعة من أنشطة مخروط النمو (تقسيم أو تأخر الصدريةدعا nching) أو من الناشئين للضمانات من رمح محوار في عملية المتفرعة خلالي 2 (الشكل 1).
وسط توقعات من الخلايا العصبية من DRG تقترح نظام التجريبية مفيدة لدراسة كلا النوعين من المحاور المتفرعة : عندما تصل إلى المحاور الخاصة بهم وارد دخول منطقة الجذر الظهري (DREZ) من النخاع الشوكي بين الجنينية أيام 10-13 (E10 -- E13) أنها عرض نمط من نمطي T - Y أو التشعب الشكل. وهما ابنة المحاوير الناتجة ثم المضي قدما في اتجاهات منقاري أو الذيلية ، على التوالي ، على هامش ظهراني من الحبل ، وفقط بعد فترة انتظار الضمانات برعم من هذه المحاور العصبية الجذعية لتخترق المادة الرمادية (المتفرعة خلالي) ومشروع لخلايا عصبية معينة في التتابع صفيحة من الحبل الشوكي حيث arborize أخرى (محطة المتفرعة) 3. وقد كشفت اقتفاء الجاذبة مخاريط النمو في منطقة الجذر الظهري دخول من الحبل الشوكي التي على ما يبدو في العلاقات العامةويتسبب ocess تقسيم مما يوحي بأن التشعب من خلال تقسيم للمخروط النمو ذاته 4 (الشكل 2) ، ومع ذلك ، فقد تمت مناقشة خيارات أخرى ك 5 أيضا.
هذا الفيديو يوضح أولا كيف لتشريح النخاع الشوكي للفئران E12.5 ترك DRG المرفقة. يتم تطبيق التثبيت التالية من كميات صغيرة من عينات الجاذبة للDRG باستخدام الإبر الزجاج سحبها من الانابيب الشعرية. بعد خطوة الحضانة ، هي التي شنت على الحبل الشوكي المسمى باعتباره إعداد كتاب مفتوح مقلوب لتحليل المحاور الفردية باستخدام المجهر مضان.
Protocol
1. التشريح الداخلي
ملاحظة : استخدام التجريبي من الفئران يجب أن تتبع مبادئ توجيهية وافق رسميا لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
- قبل التحضير وإعداد مجهر تشريح الخاص ووضع الأدوات الجراحية اللازمة لتشريح بما مقص الكبيرة والصغيرة ، ملقط مسنن كبيرة ، ملقط المنحنية وأربع مجموعات من No.5 دومون تشريح ملقط (اثنان منها داخل مصقول نصائح) ( لمزيد من التفاصيل انظر جدول الكواشف محددة والمعدات). وضع ورقة تصفية في طبق بيتري 100 ملم Sylgard المغلفة. صب الباردة PBS في الآبار لوحة 12 - جيدا ، وطبق بتري 100 ملم وأنبوب 12 مل وترك على الجليد. ماصة 2ml العازلة من التثبيت (بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4) في كل جانب من لوحة ال 12 ثانية وكذلك مكان على الجليد.
- بعد التخدير والتضحية السد حامل في توقيت E12.5 (عين الكشف عن المكونات المهبلية كما E0.5) ، ضع الماوسمع ما يصل به الجانب البطنية على ثلاث ورقات من المناشف الورقية ، ونقع في منطقة البطن مع الايثانول 70 ٪.
- فتح تجويف بطني حوضي ، عزل قرون الثنائية الرحم وتحويلها الى واحدة من الأطباق 100 ملم مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني.
- تحت رقابة مجهرية ، وجعل شق طولي لجدار الرحم مع مقص ، وقطع صغيرة على التوالي بعيدا كل كيس من المشيمة الذي يحيط بالجنين.
- قشر بعيدا الكيس السلوي من كل جنين وقطع الحبل السري.
- باستخدام مقص صغير ، تقضي على الأجنة ووضع رؤساء أو جزء منها جانبا لعزل الحمض النووي الجيني إذا كان يجب أن تكون هناك حاجة التنميط الجيني. بعد ذلك ، نقل إلى torsi آبار منها في لوحة ال 12 جيدا مع PBS الباردة.
- الرطب ورقة الترشيح في صحن Sylgard مع بضع قطرات من برنامج تلفزيوني والجذع الجنينية ظل وضع مع الجانب الظهري حتى على الورق. من أجل تحسين الاستقرار ، وتصويب ذيله والأطراف بعيدا عن الجسم.
- عاملتحت المجهر تشريح مع التكبير من 16X تقريبا ، قرصة بعناية جلد الجنين فوق الحبل الشوكي مع اثنين من أزواج من الغرامة ويميل ملقط المسيل للدموع وبصرف النظر برفق. بداية في الوسط ، والمضي قدما أولى نحو الذيل ومن ثم استئناف من الوسط باتجاه الجانب الأمامي.
- الرطب الجنين من وقت لآخر مع اثنين أو ثلاث قطرات من برنامج تلفزيوني لمنعها من الجفاف.
- وteared لمنع ذلك DRG الخروج من النخاع الشوكي عند إزالته من الجنين فصل DRG والنخاع الشوكي من العمود الفقري الغضروفية المحيطة الحركات الأفقية التي تنزلق مع شفرة لملقط مع غرامة داخل مصقول النصائح. تبدأ في منتصف الجانب الأيمن للجنين ، والعمل طريقك نحو الذيل ثم إلى نهاية الأمامي. بعد ذلك ، كرر العملية على الجانب الآخر. يجب الحرص على عدم مزق قبالة DRG المرتبطة بها.
- لفصل تماما الحبل الشوكي خففت من الجنين ، والتقاط العنق والخمسينآل جزء مع ملقط الجميلة وتخلعها في قطعة واحدة نحو نهايته الذيلية.
- يغرق الحبل الشوكي معزولة مع DRG تعلق في بئر من لوحة ال 12 مليئة جيدا العازلة التثبيت والمضي قدما في إعداد النخاع الشوكي من الأجنة المتبقية.
- إصلاح الحبل الشوكي ما لا يقل عن ساعتين على الجليد.
2. الجاذبة وضع العلامات من الخلايا العصبية DRG
- لكل الحبل الشوكي التي يتم وسمها ، وإعداد الإبر الزجاج اثنين مع مجتذب micropipette. نحن نستخدم نموذج سوتر مجتذب P - 97 مسرى (إعداد البرنامج : 1 HEAT = 625 ، فيل = 35 ، TIME = 175 ؛ HEAT 2 = 600 ، فيل = 25 ، TIME = 175 ؛ 3 HEAT = 630 ، فيل =... 30 ، الوقت = 150).
- تحت رقابة مجهرية تراجع غيض من كل إبرة الزجاج 3-5 مرات في الحل (ث / ت) 5 ٪ من الجاذبة في الإيثانول. تبخر الإيثانول يخلق طبقة رقيقة من بلورات الجاذبة على الإبرة.
- تعمل تحت مجهر تشريح مع التكبير من 40X تقريبا ، وضع الحبل الشوكي مع v لهاentral الجانب حتى على شريحة. باستخدام مقص الربيع ، وفتح الحبل على الجانب البطنية على طوله كله من خلال قطع floorplate لتسمح في وقت لاحق من تزايد اعداد في وضع مقلوب كتاب مفتوح (انظر الفرع جيم).
- موقف النخاع الشوكي مع الجانب الظهري حتى على شريحة. ثم سلك نهج يدويا مع طرف الجاذبة مغطاة من الزجاج تحت التصور إبرة مجهرية وبعناية يخترق كل DRG الثاني على أحد جانبي الحبل الشوكي. وينبغي أن ما يقرب من أي آثار للالجاذبة تكون مرئية في DRG مثقوبة لضمان وضع العلامات على عدد صغير فقط من الخلايا العصبية. أخذ إبرة الثاني لفي الجانب الآخر من السلك. تهدف فقط كل DRG second يتجنب تداخل إسقاطات محواري المسمى من DRG المجاورة التي قد تعقد في التفريق بين محاور فردية.
- عودة الحبل الشوكي إلى المخزن المؤقت التثبيت واحتضان في الظلام لمدة ست ساعات على الأقل عند درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لإعطاء الوقت للصبغة لديffuse على طول المحور العصبي داخل غشاء البلازما. السماح لفترة أطول الحضانة (ما يصل الى يومين في 4 درجات مئوية) وإذا كان المطلوب تحليل النمو الجانبية في الحبل الشوكي.
3. التركيب والتحليل المجهري
- بعد صبغ الموقف ، ونشر الحبل الشوكي واحد مع الجانب الظهري أسفل على ساترة في قطرة من برنامج تلفزيوني. تعتني أن DRG المرفقة الموجهة بشكل صحيح وأفقيا لا تختلط لا. نضح السوائل الزائدة وتتسطح بها الحبل في وضع مقلوب كتاب مفتوح باستخدام ملقط.
- جبل التحضير على شريحة المجهر باستخدام برنامج تلفزيوني.
- وينبغي لمنع زيادة غير مرغوب فيها تحليل الخلفية تلطيخ المجهري مضان من الإسقاطات محواري المسمى ستنفذ يوم المتزايدة. حتى تبقي ثم الشرائح في الظلام في 4 درجات مئوية.
4. ممثل النتائج :
الحبل الشوكي من الفأرة يستقبل الأسبوعية واردojections من 8 أزواج من عنق الرحم ، و 13 زوجا من الصدر ، و 5 أزواج من أزواج القطنية والعجزية DRG 4 من مجموعها إلى 60 العقد الشوكي. ويمكن بعد بعض التدريب يمكن عزل الحبل الشوكي مع معظم DRG لا تزال تعلق من جنين في أقل من خمس دقائق. يناسب هذا الإجراء لعزل النخاع الشوكي مع DRG المرفق من E11.5 لأجنة الفئران E13.5. ومع ذلك ، يتم تحقيق أفضل النتائج من E12.5. وتظهر النتائج المثالية لإجراء التوسيم وصفها هنا في الشكل 3. ثم قد وسم DRG على طول الحبل الشوكي يمكن استخدامها لتحديد المحاور المتفرعة السلوك على مستويات مختلفة الفقري (الشكل 4).
الشكل 1. مخطط تصور وضعي الرئيسية المتفرعة من المحاور. (أ) المتفرعة من أنشطة مخروط النمو الذي يمكن أن يؤدي إلى التشعب -- كما هو مبين هنا -- فضلا عن العرش محطة معقدة أو(ب) تشكيل الجانبي في العمود محوار (الخلالي المتفرعة). الوضع الأخير هو نوع من الهيمنة المتفرعة إسقاط المحاوير القشرية والمهادي 6،7.
الشكل 2 إسقاطات وارد من الخلايا العصبية DRG في النخاع الشوكي الجنينية عرض كلا النوعين من المتفرعة المحاور : المحاور أول فرع في DREZ بواسطة التشعب (1) وشكل من ابنة الناتجة الضمانات فروع بعد فترة الانتظار التي المتفرعة الخلالي (2).
الشكل 3. التصور مسارات محواري واحدة من الخلايا العصبية الجنينية DRG الماوس. (أ) مع الحبل الشوكي DRG المرفقة أعدت من جنين فأر E12.5. وترد (شريط المقياس ، 1 ملم.) دينار بحريني () آراء الظهرية من الجاذبة المسمى DRG البرية من نوع الفئران في زيادة التكبير. باء في كل DRG الثاني هو labeleد بواسطة الجاذبة. هي مقلوب الصور مضان ، عجزي هو في اليسار وجيم ودال ، الوحشي هو في القاع. C هو المسمى في عدد صغير من المحاور وعلى أعلى التكبير ويمكن تحديد وجود مثل T - فروع في DREZ من الحبل الشوكي. (أشرطة مقياس ، 250 ميكرون (B) ، و 100 ميكرومتر (C) و 50 ميكرون (D)).
الشكل 4. الكمي لشكل T والفروع ، واحد يتحول منقاري أو الذيلية في نوع البرية ونوع C - الناتريوتريك الببتيد (CNP) الفئران التي تعاني من نقص في E13.5. ونظرا لعدد واحد يحسب المحاوير بين قوسين لمستويات مختلفة لكل الجذع الوراثي. C - R - أو يتحول -- النمو فقط في اتجاه والذيلية أو منقاري ، على التوالي.
الشكل 5. مسار المركب والإشارات الحسية مشغلات محوار التشعب في DREZ من الحبل الشوكي. (أ) من نظاميشير المسار المركب يتكون من CNP يجند ، ومستقبلات غوانيليل Npr2 محلقة وسيرين / ثريونين cGKIα كيناز DRG في الخلايا العصبية الجنينية. Npr2 يولد المركب من GTP على التحفيز التي CNP. (ب) الجاذبة تتبع واحدة من محاور الخلايا العصبية في الفئران DRG من النوع البري وCNP ناقصة. (شريط قياس ، 25 ميكرون).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أنماط الإسقاط النمطية التي تضم كلا النوعين من تشكيل فرع محواري مع سهولة التحضير في تركيبة مع استخدام الأنسجة الثابتة لوصفها الجاذبة يجعل الحبل الشوكي الجنينية المرفقة مع نموذج DRG مواتية لدراسة المحاور المتفرعة. تطبيق كميات ضئيلة من الجاذبة باستخدام الإبر الزجاج المطلي يسمح -- على النقيض من معظم العلامات DRG -- التصور مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية وبالتالي DRG تحليل المحاور الفردية وأنماطها المتفرعة. ويمكن وصف طريقة تحسينها عن طريق الحقن iontophoretic من التتبع محبة للدهون مما يقلل زيادة عدد الخلايا العصبية المسماة 8. ومع ذلك ، فإن هذا سيكون أكثر استهلاكا للوقت.
وكان صلاح الغيدان وسم مسارات محواري واحد في جبل الاستعدادات كاملة من النخاع الشوكي الجنينية دورا أساسيا في التعرف على المركب الذي يشتمل على إشارة تتالي CNP يجند ، ومستقبله Npr2 ، والمركب التي تعتمد على cGKIα كيناز -- الذي ينظم نوع واحد من المحاور المتفرعة : والتشعب من الخلايا العصبية في DRG DREZ 4،5،9-12. على النقيض من المحاور والبرية من نوع من الخلايا العصبية في المركب DRG المسوخ يشير بدوره إلا في اتجاه واحد ، بدلا من bifurcating في DREZ (الشكل 5). وكشفت هذه الدراسات أيضا أنه لا يتأثر تشكيل الجانبي المركب في المسوخ إشارات تشير إلى أن ينظم بشكل مختلف عن النوع الثاني من تشكيل فرع لوحظ في الخلايا العصبية DRG 4.
بدلا من ذلك ، يمكن أيضا السلوك المتفرعة من المحاور DRG واحد يكون درس في خطوط الماوس المعدلة وراثيا إما التعبير عن بروتين فلوري في مجموعة فرعية صغيرة فقط من DRG الخلايا العصبية (13) أو التي تحتوي على مزيج من علامات الفلورسنت الذي يسمح احد للتمييز بين الخلايا العصبية الفردية 14. ومع ذلك ، فإن الجهد لعبور تولد نموذج الفأر الطافر لتحليلها مع خطوط الماوس الفلورسنت لابد من النظر. وعلاوة على ذلك ، ونظرا لpromotor (Thy1) التعبير المستخدم من البروتينات الفلورية في خطوط الماوس المعدلة وراثيا لن تبدأ إلا في مراحل ما بعد الولادة مما يجعل من الصعب معرفة ما إذا كان النمط الظاهري لاحظ المتفرعة هو نتيجة لتشكيل فرع ضعاف أثناء التطور الجنيني أو انحطاط في وقت لاحق عملية بدلا من ذلك. في المقابل ، صلاح الغيدان توسيم DRG الجنينية تتمتع بميزة لدراسة عملية المتفرعة محواري والتعطيل في المسوخ الماوس المناسبة في الوقت الذي المتفرعة محواري يحدث.
قد يكون من النخاع الشوكي الاستعدادات الجنينية مع DRG المرفقة المستخدمة لمزيد من الإجراءات الأخرى وضع العلامات (جبل بأكمله في الموقع التهجين ، أو LacZ AP - تلطيخ من الفئران المعدلة وراثيا) ، وجمع من النخاع الشوكي والأنسجة DRG عن الحمض النووي الريبي والعزل ، أو عندما تكيف لظروف معقمة للتجارب زراعة الأنسجة وتطبيقاتها المصب مثل الكالسيوم أو التصوير القياسات الكهربية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر الدكتور أليستير Garratt (دلبروك مركز برلين) للحصول على تعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل مركز البحوث التعاونية (SFB665) التابع لمجلس البحوث الألمانية (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O'Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
