Summary
Den stereotype fremskrivninger af sensoriske afferenter i gnavere rygmarven tilbyde et lettilgængeligt eksperimentelle system for at studere aksonal forgrener sig gennem sporing af enkelte axoner.
Abstract
Her præsenterer vi en teknik til at mærke de baner af små grupper af DRG neuroner i den embryonale rygmarven ved diffusiv farvning hjælp af lipofile sporstof 1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorat (DII) 1 . En sammenligning af axonal veje af vildtype med de mus linjer, hvor generne er muteret tillader test for en funktionel rolle kandidat proteiner i kontrol af axonal forgrening, som er en væsentlig mekanisme i ledninger i nervesystemet. Aksonal forgrening gør det muligt for den enkelte neuron til at forbinde med flere mål, hvilket giver det fysiske grundlag for den parallelle behandling af oplysninger. Forgreninger ved mellemliggende mål regioner axonal vækst kan skelnes fra terminal arborization. Desuden kan forskellige former for axonal gren dannelse klassificeres afhængigt af, om branching resultaterne fra de aktiviteter af væksten kegle (opdeling eller forsinket bhnching) eller fra den spirende af sikkerhedsstillelser fra Axon akslen i en proces, der kaldes interstitiel forgrening 2 (fig. 1).
Den centrale fremskrivninger af neuroner fra DRG tilbyder en nyttig eksperimentelle system for at studere begge typer af axonal forgrening: når deres afferente axoner nå dorsale post zone (DREZ) i rygmarven mellem embryonale dage 10 til 13 (E10 - E13) de vise et stereotypt mønster af T-eller Y-formet forgrening. De to resulterende datter axoner herefter fortsætte under rostralt eller caudale retninger, henholdsvis på dorsolaterale margin på ledningen, og først efter en karensperiode soeskende spire fra disse stamceller axoner at trænge igennem den grå stof (interstitiel forgrening) og projekt til relæ neuroner i bestemte bladplader af rygmarven, hvor de yderligere arborize (terminal forgrening) 3. Dii tracings har afsløret vækst kegler på dorsale post zone i rygmarven, der syntes at være i PRocess for at splitte tyder på, at tvedeling er forårsaget af opsplitningen af væksten kegle selv 4 (fig. 2), har dog andre muligheder blevet diskuteret såvel 5.
Denne video viser første, hvordan at dissekere rygmarv fra E12.5 mus forlader DRG vedlagt. Efter fiksering af prøveemnet små mængder af Dii anvendes til DRG brug af glas nåle trukket fra kapillarrør. Efter en inkubation, er mærket rygmarven monteres som en omvendt open-bog forberedelse til at analysere de enkelte axoner ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
Protocol
1. Dissektion procedure
Bemærk: Eksperimenterende brug af mus bør følge officielt godkendt retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr.
- Før tilberedning og sæt din dissektionsmikroskop og læg den kirurgiske instrumenter er nødvendige for dissektion herunder store og små sakse, store tandede pincet, buede pincet og fire sæt Dumont nr. 5 dissekere pincet (hvoraf to har inside-poleret tips) ( for nærmere oplysninger se tabellen af specifikke reagenser og udstyr). Placer et ark filtrerpapir i en 100-mm Sylgard-belagt petriskål. Hæld koldt PBS i brøndene af en 12-brønds plade, en 100-mm petriskål og en 12-ml rør og efterlade på is. Pipetter 2 ml fiksering buffer (4% paraformaldehyd i PBS, pH 7,4) i hver brønd af et sekund 12-brønds plade og anbring på is.
- Efter anesthetization, den tidsindstillede gravide dæmningen offer på E12.5 (påvisning af vaginal stikket blev udpeget som E0.5), placere musenmed dens ventrale side op på tre ark papir håndklæder og nyd det abdominale område med 70% ethanol.
- Åbn abdominopelvic hulrum, isolere de bilaterale livmoder hornene og overføre dem til en af de 100-mm-retter med iskold PBS.
- Under mikroskopiske kontrol, lave en langsgående indsnit i livmodervæggen med små, lige saks og klippe væk hver fosterhinden fra moderkagen.
- Skræl væk fosterhinden fra hver foster og klippe navlestrengen.
- Ved hjælp af en lille saks, embryoner halshugge og sætte hovederne eller en del af dem til side til isolering af genomisk DNA, hvis genotypebestemmelse bør kræves. Efterfølgende overføre torsi til de respektive brønde af 12-brønds plade med koldt PBS.
- Våd filteret papiret i Sylgard fad med et par dråber af PBS og holdning er en embryonale torso med sine dorsalsiden op på papiret. For bedre stabilitet, glatte sin hale og ekstremiteter væk fra kroppen.
- Arbejdeunder et dissektionsmikroskop med en forstørrelse på ca 16x, klemmes forsigtigt huden på embryo over rygmarven med to par fine tippet tænger og forsigtigt rive den fra hinanden. Begyndende i midten, først fortsætte mod halen, og derefter genoptage fra midten mod den forreste side.
- Våd embryonet fra tid til anden med to eller tre dråber PBS for at forhindre det i at tørre.
- For at forhindre, at DRG er teared ud fra rygmarven, når det er fjernet fra embryonet afmontere DRG og rygmarv fra de omkringliggende bruskspidserne rygsøjlen ved vandrette glidende bevægelser med kærven på en fin pincet med inde-poleret tips. Start i midten af fosterets højre side, på din måde at arbejde hen imod halen og derefter til den forreste ende. Derefter gentages proceduren på den anden side. Vær forsigtig med ikke at rip off den tilhørende DRG.
- At afmontere helt løsnet rygmarven fra embryonet, afhente sin cervical del med fine pincet og trække det ud i ét stykke mod dens caudale ende.
- Sænk den isolerede rygmarven med påsat DRG i et hul i 12-brønds plade fyldt med fiksering buffer og fortsætte med udarbejdelsen af rygmarv fra de resterende embryoner.
- Fix rygmarv mindst to timer på is.
2. Dii-mærkning af DRG neuroner
- For hver rygmarven at blive mærket, udarbejde to glas nåle med en mikropipette aftrækker. Vi bruger en Sutter model P-97 elektrode aftrækker (program indstillingen: 1 HEAT = 625, VEL = 35, TID = 175, 2 HEAT = 600, VEL = 25, TID = 175, 3 varme = 630, VEL =... 30, TIME = 150).
- Under mikroskopiske kontrol dyppe spidsen af hvert glas nål tre til fem gange i en 5% (w / v) opløsning af Dii i ethanol. Fordampning af ethanol skaber et tyndt lag af Dii krystaller på nålen.
- Arbejder under en dissektionsmikroskop med en forstørrelse på ca 40x, placere en rygmarven med dens ventral opad på et dias. Ved hjælp af foråret saks, snoren åben på den ventrale side i hele sin længde ved at skære gennem floorplate at tillade senere montering af præparatet i en omvendt åben-bog-mode (se afsnit C).
- Placer rygmarven med strækkes op på et dias. Derefter manuelt tilgang ledningen med Dii-dækkede spidsen af glasset nålen under mikroskopiske visualisering og omhyggeligt gennembore hver anden DRG på den ene side af rygmarven. Næsten ingen spor af Dii skal være synlige i gennemboret DRG til at sikre mærkning af kun et lille antal neuroner. Tag en anden nål til den anden side af ledningen. Sigter kun hver anden DRG undgår en overlapning af mærket axonal fremskrivninger fra nabolandet DRG, som kan vanskeliggøre en differentiering af de enkelte axoner.
- Retur rygmarven til optagelsen buffer og inkuber i mørke i mindst seks timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C for at give tid til farvestoffet til diffuse langs Axon i plasmamembranen. Give mulighed for en længere inkubationstid (op til to dage ved 4 ° C), hvis analyse af sikkerhed vækst ind i rygmarven ønskes.
3. Montering og mikroskopisk analyse
- Efter farvestof diffusion, placere en enkelt rygmarven med dens dorsalsiden ned på en dækglas med en dråbe af PBS. Pas på, at den vedhæftede DRG er korrekt orienteret sideværts og ikke blande sig. Aspirér overskydende væske og flade ud i ledningen i et omvendt åben-bog-tilstand med en pincet.
- Monter præparatet på et objektglas ved hjælp af PBS.
- For at forhindre en forøgelse af uønskede baggrundsfarvning fluorescens mikroskopisk analyse af mærket axonal fremskrivninger skal udføres dagen for montering. Indtil da holder dias i mørke ved 4 ° C.
4. Repræsentative resultater:
Rygmarven på musen modtager afferente PRojections fra 8 par af livmoderhalskræft, 13 par af thorax, 5 par lænde-og 4 par sakrale DRG i alt til 60 spinal ganglier. Efter nogle uddannelse en rygmarven med de fleste DRG stadig er fastgjort kan isoleres fra et foster på under fem minutter. Denne procedure er velegnet til isolering af rygmarv med påsat DRG fra E11.5 til E13.5 musen embryoner. Der er dog det bedste resultat opnås fra E12.5. Eksemplarisk resultaterne af mærkningen her beskrevne procedure er vist i Figur 3. Mærkningen af DRG over hele længden af rygmarven kan derefter bruges til at kvantificere aksonal forgrening adfærd på forskellige vertebrale niveauer (Fig. 4).
Figur 1. Scheme skildrer de to vigtigste former for axonal forgrening. (A) Forgrening af aktiviteterne i den vækst kegle, der kunne føre til en bifurkation - som vist her - såvel som komplekse terminal holdere eller(B) sikkerhed dannelse på Axon akslen (interstitiel forgrening). Sidstnævnte funktion er den dominerende forgrening type projektering kortikal og thalamocortical axoner 6,7.
Figur 2 afferente fremskrivninger af DRG neuroner i den embryonale rygmarven vise begge typer af axonal forgrening:. Axoner første filial på DREZ ved bifurkations (1) og den resulterende datter grene soeskende form efter en karensperiode af interstitiel forgrening (2).
Figur 3. Visualisering af enkelt axonal baner af embryonale mus DRG neuroner. (A) Rygmarv med påsat DRG forberedt fra et E12.5 mus foster. (Skala bar, 1 mm.) (BD) Dorsal udsigt Dii-mærket DRG af vildtype mus ved at øge forstørrelsen vises. I B hver anden DRG er labeled fra DII. Fluorescens billeder er inverteret, caudale er til venstre og i C og D, lateral er i bunden. I C et lille antal af axoner er mærket og ved højere forstørrelse forekomsten af T-lignende brancher kan identificeres i DREZ i rygmarven. (Scale barer, 250 m (B), 100 m (C) og 50 m (D).)
Figur 4. Kvantificering af T-formede grene, enkelt rostralt eller caudal vender i vildtype-og C-type natriuretisk peptid (CNP)-mangel mus ved E13.5. Antallet af enkelt tælles axoner er angivet i parentes til forskellige trunk niveauer for hver genotype. C-eller R-vendinger - vækst kun i caudale eller rostralt retning, hhv.
Figur 5. En cGMP-signalvejen udløser sensoriske Axon bifurkation på DREZ i rygmarven. (A) Scheme ofcGMP signalvejen består af ligand CNP, receptoren guanylyl cyclase Npr2 og serin / threonin kinase cGKIα i embryonale DRG neuroner. Npr2 genererer cGMP fra GTP ved stimulering af CNP. (B) Dii sporing af enkelte axoner af DRG-neuroner i wild-type og CNP-mangel mus. (Scale bar, 25 μm.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stereotype projektion mønstre bestående af begge typer af axonal gren dannelse sammen med nem tilberedning i kombination med brug af faste væv til DII mærkning gør embryonale rygmarven med påsat DRG en positiv model for at studere aksonal forgrening. Anvendelsen af meget små mængder af Dii bruge coated glas nåle giver mulighed for - i modsætning til hovedparten mærkning af DRG - visualisering af små grupper af DRG neuroner og dermed analysen af de enkelte axoner og deres forgreninger mønstre. Den beskrevne metode kan forbedres yderligere ved Iontoforetisk injektion af lipofile sporstof, som yderligere nedsætter antallet af mærket neuroner 8. Dette vil imidlertid være mere tidskrævende.
Dii mærkning af enlige axonal baner i hele montere forberedelserne af de embryonale rygmarven var medvirkende til identifikation af en cGMP signaleringskaskade-bestående af liganden CNP, dets receptor Npr2, ogcGMP-afhængig kinase cGKIα - som regulerer én type axonal forgrener sig: Den tvedeling af DRG neuroner på DREZ 4,5,9-12. I modsætning til vildtype, axoner af DRG neuroner i cGMP signalering mutanter drej kun i én retning, i stedet for bifurcating på DREZ (Fig. 5). Disse undersøgelser afslørede også, at sikkerhed, blev ikke påvirket i cGMP signalering mutanter indikerer, at denne anden form for filial dannelse observeret i DRG neuroner anderledes, er reguleret 4.
Alternativt kan den forgrening adfærd enkelt DRG axoner også blive studeret i transgene mus linjer enten giver udtryk for et fluorescerende protein i kun en lille delmængde af DRG neuroner 13 eller indeholder en kombination af fluorescerende markører, der tillader en at skelne mellem de enkelte neuroner 14. Men indsatsen på tværs af race mutant musen model, der skal analyseres med fluorescerende musen linier må betragtes. På grund af promotor (Thy1) brugte udtryk for fluorescerende proteiner i de transgene mus linjer starter kun på den postnatale faser gør det vanskeligt at finde ud af, om en observeret branching fænotype er resultatet af nedsat gren dannes under fosterudviklingen eller en nyere degeneration proces i stedet. I modsætning hertil har Dii mærkning af embryonale DRG den fordel at studere processen med axonal forgrening og dens forstyrrelser i passende mus mutanter på det tidspunkt, hvor axonal forgrening sker.
Tilberedninger af embryonale rygmarv med påsat DRG kan yderligere anvendes til andre mærkning procedurer (hele mount in situ hybridisering, LacZ-eller AP-farvning af transgene mus), indsamling af rygmarv og DRG væv til RNA-isolering, eller når tilpasset til sterile betingelser for vævskultur eksperimenter og downstream applikationer som calcium imaging eller elektrofysiologiske målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Alistair Garratt (Max Delbrück Center, Berlin) for nyttige kommentarer. Dette arbejde blev støttet af den fælles forskningscenter (SFB665) af det tyske forskningsråd (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope Stemi DRC | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Phosphate-buffered solution (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 8.18715.1000 | |
| Standard surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Toothed standard forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 fine tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 mirror finish forceps | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Filter paper | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | World Precision Instruments, Inc. | SYLG184 | |
| 100-mm Petri dishes | Greiner Bio-One | 663102 | |
| 12-ml polypropylene tube | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-well culture plate | BD Biosciences | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 1.00983.2500 | |
| Flaming/Brown micropipette puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Microscope slides SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glass cover slips | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
References
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Neurosci. 23 (11), 557-557 (2000).
- Ozaki, S., Snider, W. D. Initial trajectories of sensory axons toward laminar targets in the developing mouse spinal cord. J. Comp. Neurol. 380 (2), 215-215 (1997).
- Schmidt, H. The receptor guanylyl cyclase Npr2 is essential for sensory axon bifurcation within the spinal cord. J. Cell Biol. 179 (2), 331-331 (2007).
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-183 (2011).
- O'Leary, D. D., Terashima, T. Cortical axons branch to multiple subcortical targets by interstitial axon budding: implications for target recognition and "waiting periods". Neuron. 1 (10), 901-901 (1988).
- Portera-Cailliau, C. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS. Biol. 3 (8), e272-e272 (2005).
- Gan, W. B. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-13 (1999).
- Schmidt, H. C-type natriuretic peptide (CNP) is a bifurcation factor for sensory neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (39), 16847-16847 (2009).
- Zhao, Z. Regulate axon branching by the cyclic GMP pathway via inhibition of glycogen synthase kinase 3 in dorsal root ganglion sensory neurons. Journal of Neuroscience. 29 (5), 1350-1350 (2009).
- Zhao, Z., Ma, L. Regulation of axonal development by natriuretic peptide hormones. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (42), 18016-18016 (2009).
- Schmidt, H., Rathjen, F. G. Signalling mechanisms regulating axonal branching in vivo. Bioessays. , (2010).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).
- Livet, J. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-56 (2007).
