Den Ex vivo Isoleret Skeletal mikrokardannelse Forberedelse til undersøgelse af vaskulær reaktivitet
Summary
En<em> Ex vivo</em> Forberedelse er beskrevet til isolering af de største gracilis musklen modstand arterioler til forhør af både vaskulære reaktioner på vasoaktive stimuli og vurdering af de grundlæggende strukturelle egenskaber via passiv væg mekanik.
Abstract
Den isolerede mikrokardannelse Præparatet er en ex vivo-præparat, der giver mulighed for undersøgelse af de forskellige bidrag af faktorer, der styrer skibet diameter, og dermed perfusion modstand 1-5. Dette er en klassisk eksperimentel præparat, som var i stor udstrækning, først beskrevet af Uchida et al. 15 flere årtier siden. Denne indledende beskrivelse dannede grundlag for de teknikker, der blev væsentligt ændret og forbedret, primært i laboratoriet af Dr. Brian Duling ved University of Virginia 6-8, og vi præsenterer en aktuel tilgang i de følgende sider. Dette præparat vil specifikt henviser til den gracilis arteriole i en rotte, da mikrokardannelse valg, men den grundlæggende forberedelse kan let anvendes på skibe isoleret fra næsten alle andre væv eller organ på tværs af arter 9-13. Mekaniske (dvs. dimensionelle) ændringer i den isolerede mikrokarrene kan nemt blive evalueretsom reaktion på en bred vifte af fysiologisk (f.eks hypoxi, intravaskulær tryk eller forskydning) eller farmakologiske udfordringer, og kan give indsigt i mekanistiske elementer omfatter integrerede reaktioner i en intakt, selv ex vivo væv. Betydningen af denne fremgangsmåde er, at den tillader let manipulation af påvirkninger på den integrerede regulering af mikrokardannelse diameter, samtidig tillader kontrol af mange af de bidrag fra andre kilder, herunder intravaskulær tryk (myogene), autonom innervation, hæmodynamisk ( f.eks shear stress), endotelceller afhængige eller uafhængige stimuli, hormonelle og parenkym indflydelser, for at give en delvis liste. Under passende eksperimentelle betingelser og med passende mål, kan det danne en fordel i forhold til in vivo eller in situ væv / organ præparater, der ikke let giver mulighed for let styring af bredere systemiske variabler.
Det maJOR begrænsning af dette præparat er hovedsagelig en konsekvens af sine styrker. Pr. definition er den adfærd disse skibe blive undersøgt under forhold, hvor mange af de væsentligste bidragydere til regulering af vaskulær modstand er blevet fjernet, herunder neurale, humorale, metaboliske, osv. Som sådan er investigator advares for at undgå over- fortolkning og ekstrapolation af de data, der indsamles udnytte dette præparat. Den anden væsentlige område af interesse med hensyn til dette præparat er, at det kan være meget let at beskadige cellulære komponenter, såsom den endotele foring eller vaskulær glat muskulatur, kan en sådan, at variable fejlkilde indføres. Det anbefales kraftigt, at den enkelte investigator udnytte relevante målinger for at sikre kvaliteten af præparatet, både ved indledningen af forsøget, og periodisk under hele forløbet af en protokol.
Protocol
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver isoleringen, fjernelse og dobbelt kanylering af en skeletmuskel mikrokar, skønt dette generelle teknik let kan anvendes til de fleste væv. For den nuværende manuskriptet, har udtrykket "arteriole" blevet brugt af forfatterne til at beskrive en modstand fartøj på mellem 70-120 um i diameter under hvile aktiv tone, som også er en stor bidragyder til reguleringen af perfusion modstand mod et organ eller væv.
Med nogle ændringer, kan d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af American Heart Association (EIA 0740129N) og NIH T32 HL90610.
Materials
| Reagents and Equipment | Company | Comments/Catalogue # |
| Vessel Chamber | Custom | Dave Eick (MCW) |
| Heated Circulating Water Bath | PolyScience and Haake | Haake DC 10 |
| Pipets | Frederick Haer & Co. | Capillary Tubing 2.0 mm OD x 1.0 mm ID (27-33-1) |
| Pressure Monitor | World Precision Instruments | |
| Water Jacketed Reservoir | Custom | |
| External Light Source | World Precision Instruments | Novaflex |
| Pipet Puller | MicroData Instruments | PMP102 Micropipet Puller |
| Full complement of surgical tools | Fine Science Tools | Dumont |
| Ultra Fine Forceps | Fine Science Tools | Inox #5 |
| Silk Suture Thread | Ethilon | #10-0 or 9-0 |
| Stereo Microscope | Olympus | Olympus SZ-11 |
| Analog Video Calipers | Boeckeler | Via Controller (Via-100) |
| High Resolution Analog Camera | Panasonic | GP-MF 602 |
| Oxygen Tank | Regional | 21% balance nitrogen and 5% CO2 balance nitrogen |
| Tubing | Tygon | |
| Drain Pump | Cole Parmer Instrument Co. | |
| Modified Rat PSS | See recipe below | |
| Van Breemen’s Relaxant PSS | See recipe below |
Table 1. A list of the major components of isolated microvessel station setup presented in the Figures.
| Modified Rat PSS Recipe | To make two liters of PSS | 20X Salt Stock (2L) | 20X Buffer Stock (2L) |
| NaCl | 278.0 g | ||
| KCl | 14.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 11.5 g | ||
| CaCl2-H2O | 9.4 g | ||
| NaHCO3 | 80.8 g | ||
| EDTA | 0.4 g | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 2. Recipe for standard physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols.
Comments on Recipe: Make 2 L of Salt Stock and 2 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final PSS.
| Van Breemen’s Relaxant PSS | To make 2 liters of PSS | 20X Salt Stock (1L) | 20X Buffer Stock (1L) |
| NaCl | 107.4 g | ||
| KCl | 7.0 g | ||
| MgSO4-7H2O | 5.76 g | ||
| MgCl2-6H2O | 81.32 g | ||
| NaHCO3 | 40.4 g | ||
| EDTA | 0.2 g | ||
| EGTA | 15.22 | ||
| NaH2PO4 | 0.28 g | ||
| Glucose | 1.98 g | ||
| 20x Salt Stock | 100 mL | ||
| 20x Buffer Stock | 100 mL | ||
| Distilled Water | 1800 mL |
Table 3. Recipe for Van Breemen’s relaxant physiological salt solution (PSS) used in the isolated microvessel protocols under conditions of zero active tone.
Comments on Recipe: Make 1 L of Salt Stock and 1 L of Buffer Stock. These can be refrigerated when not being used, but shake them well and often before preparing PSS. The additional ingredients are added at the time of preparation of final relaxant PSS.
References
- Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. , 1-18 (2009).
- Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Increased vascular thromboxane generation impairs dilation of skeletal muscle arterioles of obese Zucker rats with reduced oxygen tension. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H1522-H1528 (2008).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, H207-H214 (2007).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Hydrogen peroxide emerges as a regulator of tone in skeletal muscle arterioles during juvenile growth. Microcirculation. 15, 151-161 (2008).
- Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Increased myogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles with juvenile growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2344-2351 (2008).
- Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 243, H598-H606 (1982).
- Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduce PO2. Am. J. Physiol. 267, H706-H715 (1994).
- Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H1024-H1033 (2010).
- LeBlanc, A. J., Cumpston, J. L., Chen, B. T., Frazer, D., Castranova, V., Nurkiewicz, T. R. Nanoparticle inhalation impairs endothelium-dependent vasodilation in subepicardial arterioles. J. Toxicol. Environ. Health A. 72, 1576-1584 (2009).
- Jernigan, N. L., LaMarca, B., Speed, J., Galmiche, L., Granger, J. P., Drummond, H. A. Dietary salt enhances benzamil-sensitive component of myogenic constriction in mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, H409-H420 (2008).
- Stapleton, P. A., Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Altered mechanisms of endothelium-dependent dilation in skeletal muscle arterioles with genetic hypercholesterolemia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293, R1110-R1119 (2007).
- Goodwill, A. G., Stapleton, P. A., James, M. E., d’Audiffret, A. C., Frisbee, J. C. Increased arachidonic acid-induced thromboxane generation impairs skeletal muscle arteriolar dilation with genetic dyslipidemia. Microcirculation. 15, 621-631 (2008).
- Baumbach, G. L., Hadju, M. A. Mechanics and composition of cerebral arterioles in renal and spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 21, 816-826 (1993).
- Uchida, E., Bohr, D. F., Hoobler, S. W. A method for studying isolated resistance vessel from rabbit mesentery and brain and their responses to drugs. Circ. Res. 4, 525-536 (1967).
- Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. I. s. o. l. a. t. e. d., Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. Chapter 23. Isolated, perfused microvessels. In: Clinically Applied Microcirculation Research. 32, 435-456 (1995).
- Lombard, J. H., Liu, Y., Fredricks, K. T., Bizub, D. M., Roman, R. J., Rusch, N. J. Electrical and mechanical responses of rat middle cerebral arterieal to reduced PO2 and prostacyclin. Am. J. Physiol. 276, H509-H516 (1994).
