ザ ex vivoで隔離された骨格微小血管の準備

Summary

不定冠詞

Abstract

孤立した微小血管の準備は、このように血流抵抗が^{1から5まで}様々な要因の寄与を制御する血管径の検査を可能にするex vivoでの製剤である、と。これは、大規模な測定では、最初に内田らによって記述されていた¹⁵数十年前に古典的な実験の準備です。この最初の記述は主にバージニア^6-8の大学で博士ブライアンDulingの研究室で、広範囲に変更され、強化された技術の基礎を提供し、我々は以下のページで現在のアプローチを提示します。この準備は、特に任意の微小血管としてラットの薄筋の動脈を参照してくださいますが、基本的な準備が容易に種を^9月13日を越え、ほぼすべての他の組織または器官から分離された船舶に適用することができます。孤立した微小血管の機械的（すなわち、次元）の変更が容易に評価することができます生理の広範な配列（例えば、低酸素症、血管内の圧力、せん断）または薬理学的な課題への応答、および無傷たが、ex vivoで 、組織に統合された応答を構成する機構要素への洞察を提供することができます。また、血管内の圧力（筋）など、他のソースからの貢献の多くの制御を許可しながら、この方法の重要性は、血行動態、自律神経支配、それは微小血管径の統合された規制上の影響の容易な操作のためにできることです（例えば、せん断応力）、内皮依存性または独立した刺激、ホルモン、および実質の影響は、部分的なリストを提供します。適切な実験条件下で、適切な目標と、これは、 インビボまたは容易に広範な全身の変数の容易な制御のために許可されていない現場組織/臓器の準備、 の上の利点として機能することができます。

マこの準備のJOR制限は本質的に強みの結果である。定義により、これらの血管の動作は血管抵抗の調節に最も重要な貢献者の多くはこのように、神経体液性、代謝などを含む、削除されている、研究者が避けるために注意を促している条件の下で検討されている過この調製物を利用して収集されるデータの解釈と外挿。この準備に関して懸念の他の重要なエリアは、そのような内皮細胞ライニングや血管平滑筋などの細胞成分を損傷し、エラーの変数ソースを導入することができるような非常に簡単であるということです。それが強く、個々の治験責任医師はプロトコルのコースを通じて準備の品質を確保するための適切な測定、実験開始時と定期的に両方を利用することをお勧めします。

Protocol

1。実験に先立って

1. 実験の日に先立って、ステーションの適切な寸法のガラスキャピラリーチューブは、マイクロピペット（水平または垂直プラーを使用することができる）にプルアップされています。我々は一般に50から150ミクロンの直径範囲を使用するものの、先端径を容易に、分離されている容器に応じて調整することができます。そして、これらはブタン火炎上の加熱後に微小血管ステーションのための適切な構成に折り曲げられている。ピペットチップは物理的に問題の微小血管のおおよその直径（ファイン鉗子付）に分割してできるグラウンドや特定のアプリケーションの必要に応じて適切なコンフォメーションへの洗練されています。これらの手順の広範囲と卓越したレビューのために、読者はDavis らに送られます^16。つのマイクロピペットは、その後微小チャンバー用ピペットホルダーに反対に配置されています。これらはそのようなヒントに配向されている必要があり血管チャンバー内の同じ垂直方向と水平方向の平面にある。
   この原稿（ 図1および図2）で使用される微小血管室（ウィスコンシン医科大学の生理学教室のデービッド·Eickによって建てられたカスタムなものであるhttp://www.phys.mcw.edu/とWWW 。eicktech.com ）。しかし、微小チャンバーの他のいくつかの構成では、リビングシステムのインストルメンテーション（によって開発されたものと、容易に市販されているhttp://www.livingsys.com/ ）とIonOptix（ http://www.ionoptix.com/非常に一般的である）。これらの他のシステムを使用して、これは特定の実験と機器の要件に依存しますが、倒立顕微鏡ではなく、従来の直立つを利用することが不可欠かもしれません。倒立顕微鏡の使用は実験的な機能実装のために望ましい蛍光灯や共焦点イメージングを必要とするOLS。
2. 生理食塩水（PSS、以下に概説）を準備し、pHを特定の実験条件（7.38から7.42が典型的なもので生理的な範囲内にある）のために適切なレベルに設定されていることを確認してください。 PSS溶液は、あらかじめ、冷蔵調製することができるが、使用する前にpHを適切な温度でチェックする必要があります。これは普遍的に必須ではありませんが、実験または特定のプロトコルが、それを必要とする場合PSSは、アルブミンを含めることができます。
3. 血管径を測定するために使用されるデジタル·ビデオ·キャリパーは血球や顕微鏡ステージのマイクロメータを使用して校正する必要があります。正確なキャリブレーションのために、それはマイクロメーター、容器チャンバ内に流入/流出ピペットと同一平面に配置されることが重要である。
4. ピペットに微小血管を取り付けるためのネクタイループが準備されると、その後の使用のために容易にアクセスできる必要があります。これらは、容易に8から0または小さい眼科sから調製することができるuture。 （これが失われてからそれらを維持します）が必要になるまで、単一のネクタイループがあらかじめ準備され、顕微鏡スライドを囲む逆にテープの小片で覆われたペトリ皿に格納することができます。 （ 図3）。

2。実験の日

1. サポートするすべての機器がオンになっていて、適切な機能を確認する必要があります。 、すべての圧力変換器と容器室ドレンポンプ（ 図1Aおよび1B） -これはanti-vibration/floatingテーブルと循環温水浴（一般的に37°C容器浴で適切な温度を提供するように設定）が含まれています。容器チャンバーと灌流液とsuperfusate貯水池における平衡ガスをオンにします。
2. PSS溶液をリザーバ、チューブ、室のすべてを記入してください。流入ピペットにつながる灌流ラインが完全にVAを除去すると損傷する可能性があり、この行の気泡の存在を回避するために入力する必要がありますscular内皮細胞（ 図1C）。必要に応じて、静かにそれが完全にいっぱいであることを保証するためにピペットを通して、灌流液の流れを妨げる可能性の閉塞せずPSSのすべての方法をプッシュするために注射器を使用しています。流入圧力は圧力変換器の損傷を防ぐために合理的な範囲内に保たなければなりません。

3。微小血管の収穫

1. 微小血管が取られることになっているから、動物の麻酔に続いて、問題の血管が検討される血管系に最も適している手順に従って分離する必要があります。他のもので、血管が麻酔動物（例えば、筋肉）から直接削除することができながら、いくつかのケースでは、これは、臓器自体（例えば、脳または冠動脈血管）の除去が必要な場合があります。薄筋内の血管の向きの例を図4に示されています。用で除去前にin vivoでの血管の長さを推定CEPSや小さなキャリパー。動物/臓器から血管を除去する前に、それは容器室の準備ができます（代わりに、すべてのタイ·ループを含む）が正常に機能していることを確かめるための1つ、最終的なチェックを実行するために非常に役立ちます。
2. すべての船を引っ張るか、引っ張っを避けるために細心の注意を取って、細かい鉗子の一端に容器の外側をつかんで、それがフリーになるまで、船の長さに沿って切断することによって動物/臓器から血管を削除します。一度解放され、すぐにPSSで満たされた1.7 mL遠心チューブに入れてでも容器から離さない。これは、向きを覚えておくことで、お風呂のように灌流液方向は、動物の血流方向と同じになります。

4。容器をCannulating

1. いっぱいお風呂に容器を置き、流入ピペットで近位端にカニューレを挿入。これが最善のカニューレを介して適度な血流速度（〜50 mmHgの圧力）で実現することができ、近位血管内腔の壁の両側を保持するために使用される微細な鉗子のペア（つまり、それぞれの手で鉗子の1ペア）。私たちの研究室では、ファイン科学ツール（から細かい鉗子を使用しhttp://www.finescience.com/Home.aspx 、任意の適切な構築鉗子が効果的に動作しますが、）。カニューレの先端に容器をスリップと2ネクタイループが血管を確保することができるポイントに先端の船を進めます。
2. さらに血管を膨らませると遠位ピペットの先端にカニュレーションを容易にするために〜75 mmHgに流入圧力を上げる。血管を通る流れは、容器の先端部流出（顕微鏡下）でsuperfusateリザーバ内の歪みとして認識されるべきである。流出ピペットで容器の先端部をカニューレを挿入し、2ネクタイループ（これらの最後のループは前のカニュレーションの場所になければなりません。 図5）で固定します。
3. needeとしてXYZ座標でまでカニューレを調整するDまでのそこに容器内で最小限の歪みであり、容器は 、in vivo の長さに近似しています。それは通常、その容器の種類別セグメント（我々の研究室では、薄筋⁸の大きな抵抗動脈の平均動脈圧の80％を利用）が経験した平均動脈圧の割合を近似されるまで流入圧力を上げる。
4. お風呂と場所のプラスチックラップまたは顕微鏡レンズをしぶきを避けるためにチャンバ上のカバーガラスに適切なガス混合物を提供する小さな気泡の石を配置します。小さいサイズも同様に効果的に動作しますが、私たちはすべてのペット/アクアリウム店で一般に利用可能で、直径約​​1cmであるバブ石を使用しています。バブリングの石の存在はすべての回で容器に適切なガスの可用性を保証し、血管の生存を延長します。この石はの歪みを防ぐために、すべての測定期間（または一時的に中断石を通る空気の流れ）の間に削除されます画像。流出ピペットでクランプを解放し、30分間容器を通る流れを可能にします。定期的に、流れは船が休息トーンを開発しているかどうかを判断するために流出配管にクランプする必要があります。全ての船舶は、この時点での圧力漏れをチェックする必要があります。リークは、流入が続く知られている容器に圧力（私達は一般に100から120 mmHgのを使用します）と流出をクランプ、ラインを導入することによって明らかであろう。管腔内圧が安定している場合は、識別可能な漏れはありません。圧力が下がり始める場合は、大幅なリークが存在し、クローズする必要があります。流入または流出ピペットのどちらかでリークが正常にピペットで容器の周りに結ば追加のループを追加することで調整することができます。容器は、漏れを許している小さな側枝を持っている場合あるいは、これは効果的に圧力を格納するための船の能力を妥協し、エラーのために追加のソースを導入することができます。このリークが識別された場合、通常はWオフ接続することができます。10から0まで眼科縫合のi番目のシングルループ。また、ネクタイのループを作るために6から0縫合糸からからかわ一本鎖でも非常に効果的です。リークを識別することができないか、または効果的に（例えば、側枝、単に血管壁の穴へのトランクがありません）から接続できない場合は、この実験の早期終結につながるとなる別の容器から使用することができます必要に応じて（これは一般的に他の足で同じ容器である - 動物 - または反対側必要な場合）。
   
   容器は、少なくとも30分の流れがない条件下で平衡化させなければなりません。すべての実験は、フロー制御なしの条件下で実施されています。容器は十分な音を開発し、問題の実験のための選択基準に応答した後、船は、その後の研究のための準備ができています。
   
   これらの選択基準は、特定の実験プロトコルと治験責任医師によって異なります。私たちの研究室では、我々は定期的にUT次のilize：
   1. > 30％（ΔDは、Ca ^{2 +}フリーPSSとDの_最大の暴露に応答して、平衡圧力の下の値から動脈内壁の直径の増加であるΔD/ D _最大値 ×100として計算された最大値であるの積極的なトーン直径は、Ca ^{2 +}フリーPSSにおける平衡圧力）で測定した。
   2. 実行可​​能な血管平滑筋層の指標としての筋活性化（の維持、または好ましくは増加した管腔内圧と動脈直径の減少）。
   3. としてアセチルコリンへの活発な拡張器応答（バスで10 ^-6 M）によって証明可能な内皮細胞ライニング、。
   4. 追加の選択基準は、例えばフェニレフリンなどのアドレナリン作動薬（10 ^-7 M）などのアデノシンなどの追加刺激（10 ^-5〜拡張器の応答に収縮応答を含む、必要に応じて特定の実験プロトコルを合わせて追加することができます2の減少）sup。
5. 次のセクションでは、 "モック実験"の一例である。必要なすべてのソリューションは、容器チャンバ内のPSSの希釈率を考慮に着目し、必要に応じて用意されています。例として、当社の機器の一部について、容器室の容積は20 mlである。容器室浴で10 ^-5 Mの有効濃度で10 ^-2 Mのストック溶液の結果のように、20μlのように。上記のように容器の除去、カニュレーション、平衡および検証に続いて、実験が開始できるようになります。このような治療のランダム化と有効性など具体的には、実験に固有のものであり、この努力のために過剰なスペースを消費するでしょう。このように、これらの詳細に含まれていません。
   
   最初の制御応答が決定されます。そのような筋の活性化（圧力誘起収縮）、intralumenal PRとして例生理的刺激のためにessureはランダムに所望の範囲にわたって変更され、容器（この場合は、我々は5〜7分の期間を可能にするであろう）に対応するために、適切な期間が許可されています。そのようなアセチルコリンのチャレンジ、例の薬理学的刺激のために、薬剤がランダムな順序でストック溶液からバックに追加されます。このケースでは、我々は通常、平衡径の回復として定義されるウォッシュで、お風呂で10 ^{-9〜10 -5} Mの範囲を使用します。アセチルコリンは、高速演技剤として、最大の拡張器の応答は容易にほんの数秒で達成することができます。他の薬剤（例えば、ペプチドなど）の最大反応を引き出すために時間がかかることができ、これだけが考慮され、同様に効果的な洗い出しにかかった期間。制御応答が収集された後、特定の介入は、受容体アゴニスト/アンタゴニストは、特定のイオンチャネルに作用する薬剤の扇動と容器のインキュベーションを含む、システムに課されることができます最も一般的な介入の少数を示すために管腔内圧、平衡ガスまたは特定の酵素系を対象に薬剤の違いを、変更しました。
   
   介入のための適切な時間の後に（適切にテストされる必要があります）有効にするには、データ収集の後続のラウンドが開始されます。特定の実験プロトコルに応じて、（ - 可能 - または生理学的な課題の簡単な除去のいずれウォッシュアウトによる）、その後の介入は、容器に課せられることができるか、最初のを削除することができます。容器は、その平衡状態（検証されるべきである）に戻った後に追加データの収集が必要に応じ、その後の介入を適用することができます。容器の準備の質は、以下の以前に決定されたしきい値基準を下回るまで、この一般的な手順は、実験終了まで継続するかされるでしょう（例えば、アゴニストまたは十分なアクティブなトーンを開発する能力への応答）。この時点で、実験はどちらかと結論されるか、捜査官は、分離された容器（例えば、筋の活性化と同一の手順を用いて行うことができる血管壁の力学、同様の反応性に依存しないデータを収集したい場合がありすべてのアクティブ·トーン^14）を欠いている容器である。
6. すべての機器の定期的な清掃は、塩の蓄積の除去、不要な生物学的実体の成長の防止のために不可欠です。すべての実験日の終わりに、最低でも、すべての行とチャンバーが完全に蒸留水または脱イオン多量の水でPSSからフラッシュされ、完全に乾燥するために許可されています。使用するたびに2〜3日後、エチルアルコールで洗浄も同様に実行され、機器が完全に乾燥させる。一貫した使用のそれぞれの週の終わりに、すべての行とチャンバは、0.1 M塩酸で満たされた30分間 "インキュベート"させ、次いで上記のように水で十分に洗浄される。最後に、で連続使用の2〜3週間の終わりに、チューブのすべてのセクションが新たに置き換えられ、チャンバや貯水池が1.0 M HClで洗浄され、蒸留/脱イオン水ですすぎ広範囲に続いて。チューブまたは室/貯水池の任意の要素の成長のチューブやビジュアル設立の任意の変色した場合、これらのいずれかに置き換えたり、完全に適切にクリーンアップされます。定期的なクリーニングと一般的なメンテナンスで、装置は非常に長い時間続くことができます。記事の執筆時点で、私たちの船室は⁸日、または日常的に使用9年^目にすべてであり、私たちは彼らとの有意な困難を経験していない。

5。代表的な結果

図1Aは、この図は、基本的な微小血管ステーションのセットアップを示します。容器を表示するための=テレビ、B =デジタルノギス。superfusate THRをプッシュするためのC =シリンジ必要に応じてウワーッ流入ピペット、灌流液の流入圧力を変更するためのD =静列、E =顕微鏡、F =微小チャンバー; G = superfusate貯水池、H =圧力モニター（複数は必要に応じて追加することができます）I =微小チャンバードレンポンプ用superfusate、J =平衡ガス混合タンク、K =廃棄物（superfusate用）が含まれていました。L =循環温水器、M = anti-vibration/floatingテーブル。

図1B。この図は、微小チャンバーのセットアップの緊密なビューを提供します。この図では、E =顕微鏡、F =微小チャンバー、H =圧力モニター（我々は1つだけ簡単にするためにを表示しながら、複数のは、必要に応じて別のサイトに追加することができます）I =微小チャンバードレンポンプ、に接続されたN =チューブ非常に灌流液の流入ピペット（図1Aの 'D'から継続）の先頭、O =チューブが灌流液流出ピペットに接続されている。

図1C。この図は、微小チャンバーの最も近いビューが表示されます。この図では、N =灌流ライン（すなわち、灌流液の流入ピペットに直接接続されたチューブ）灌流液流出ピペットに直接接続されているO =チューブ、P =流入ピペットのために水平方向および垂直方向の位置のコントロール、Q = superfusate貯水池からの水の風呂で、R =流入（ 図1Aの'G'に接続されている）、水浴（図1Aおよび1Bに'I'に接続されている）のためにドレイン。

図2この図は、システム内の液体やガスの流れの模式図を示します。この図では、= PSS superfusateラインの流入、流入ピペットにB = PSS灌流ライン;風呂からC = PSS superfusateドレインコンテナを無駄にし、D =流出ピペットからPSS灌流液流出、E室のジャケットに=温水入力、チャンバジャケットからF =温水を出力します。

。8から0から我々の調製に使用され、複数のネクタイループのストレージ、 図3この図では、眼科用縫合糸（パネル10倍の接眼レンズと4.5倍可変ズーム倍率の解剖顕微鏡を通して見た）から作られた個々のネクタイループを提示と覆われたペトリ皿に格納されている顕微鏡用スライドの周り逆に、テープ上の10から0縫合糸（それらを失うことを避けるために、パネルB）。

図4この図は、前の手術の分離と除去、適切な空間的定位を可能にするために薄筋の抵抗動脈の画像を（標準的な解剖顕微鏡を通して見た）を提供しています。

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図5は、この図は、カニューレ微小血管の代表的なイメージを提供します。パネル（B）ピペットと同様にネクタイループは（C）に示す流入（）と流出の両方で、容器の全体の長さを示しています。パネルBは明らかにデジタルノギス（この例では直径が112μmである）と細動脈の内径の決定を示す、高倍率で画像を表示します。

図6：この図は、カニューレ微小血管は、次の平衡化の代表画像を提示します。トップ画像は平衡圧力で、制御下にある容器から刺激を受けていない条件であり、中央の画像は、アセチルコリン（バスで10 ^-6 M）で挑戦する拡張後に同じ容器からなり、下の画像はその容器からは以下の通りですconstrictioフェニレフリン（バスで10 ^-7 M）をチャレンジしてnである。

図7は、この図では、と挑戦に応答して孤立した微小血管の反応をまとめたものです。低酸素症（パネル、〜40 mmHgに〜135 mmHgでから我々のシステムで灌流とsuperfusate PO ₂の低下）、アセチルコリンの濃度を増加させた（パネルB）、制御条件やカルシウムを含まないPSS（パネルC）の容器は、次のインキュベーション下の血管内圧の変化。

Discussion

この一般的な手法は容易にほとんどの組織に適用することができますが、提示さプロトコルは、骨格筋の微小血管の分離、除去し、ダブルカニュレーションについて説明します。現在の原稿のために、用語 "細動​​脈"はアクティブなトーンを休んで、直径70から120ミクロンの範囲の抵抗血管を記述するために著者によって使用されており、臓器にも血流抵抗の調節に主要な貢献者であるか組織。

いくつかの修正と共に、このシステムは、特定の研究者のために複数のアプリケーションに装着することができ、容易に（例えば、膜電位¹⁷の決定のための貫通電極の使用）の深さの実験の多くを提供するために追加の技術の取り込みが可能になります。基本的な準備の重要なステップは、常に明確なままで、できるように、容器をカニューレを挿入するために使用される流入量と流出量ピペットがよく一致していることを保証されてい安易な方法で維持される流量と圧力。ピペットは、破片の分の部分で目詰まりすると、その流れを復元するためのヒントを非常に小さな部分を絶つ必要があるかもしれません。捜査官が慎重であれば、彼らはどちらuncloggedできないか、または血管のカニュレーションは非常に困難になる直径が十分に大きなポイントに到達するまで、ピペットは複数回再利用することができます。しかし、この手術と実験準備、細部への注意、および具体的な条件や要件に合わせて適切な変更の習得と、調査官は、容易に生理学的および薬理学の課題無数に応答して血管反応性を決定する経路を評価することができます。この製剤はまた、捜査官は、アクティブなトーン¹⁴の条件下での血管壁の力学の変化の基本的な分析を実行することができます。これは確かに非常に強力で適応性の高い技術であり、その一つである容易に、より基本的な応答のハイスループットスクリーニングに詳細な機序の研究の範囲にまたがるアプリケーション用に使用することができます。