Un Ex vivo è descritto per l'isolamento delle arteriole muscolari più grandi di resistenza gracile per l'interrogatorio di entrambe le risposte vascolari a stimoli vasoattivi e la valutazione delle proprietà strutturali di base attraverso la meccanica della parete passivi.
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Articolo metodologico
Il Ex vivo Preparazione isolato microvasi scheletrico per le Indagini di reattività vascolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
La preparazione dei microvasi isolato è un preparato ex vivo che consente l'esame dei contributi di diversi fattori che diametro natante di controllo, e quindi, la resistenza perfusione 1-5. Questa è una preparazione classica sperimentale che è stato, in larga misura, inizialmente descritto da Uchida et al 15. Diversi decenni fa. Questa descrizione iniziale fornito la base per le tecniche che è stato ampiamente modificato e ampliato, principalmente nel laboratorio del Dr. Brian Duling presso la University of Virginia 6-8, e presentiamo un approccio corrente nelle pagine seguenti. Questo preparato in modo specifico riferimento alla arteriola gracilis in un topo come microvasi di scelta, ma la preparazione di base può essere facilmente applicata alle navi isolati da quasi qualsiasi altro tessuto o organo tra le specie 9-13. Meccanica (cioè, dimensionale) cambiamenti nel isolato microvasi può essere facilmente valutatain risposta ad una vasta gamma di fisiologico (ad esempio, ipossia, pressione intravascolare, o taglio) o sfide farmacologici, e può fornire informazioni sul elementi meccanici comprendenti risposte integrati in uno intatto, sebbene ex vivo, tessuto. Il significato di questo metodo è che permette la manipolazione facile delle influenze sulla regolazione integrata del diametro microvasi, consentendo anche per il controllo di molti dei contributi provenienti da altre fonti, compresa la pressione intravascolare (miogenico), innervazione autonomica, emodinamica ( ad esempio, sforzo di taglio), stimoli endoteliali dipendenti o indipendenti, e le influenze ormonali, parenchimali, per fornire una lista parziale. Sotto opportune condizioni sperimentali e con obiettivi adeguati, questo può servire come un vantaggio rispetto in vivo o in situ di tessuti / organi preparati, che non consentono facilmente per il controllo di facile ampie variabili sistemiche.
La maJor limitazione di questa preparazione è essenzialmente la conseguenza delle sue forze. Per definizione, il comportamento di questi vasi è stata studiata in condizioni in cui molti dei contributi più significativi alla regolamentazione della resistenza vascolare sono state rimosse, compresa neurale, umorale, metabolica, ecc Come tale, l'investigatore è avvertiti di evitare un eccesso di interpretazione e estrapolazione dei dati raccolti utilizzando questa preparazione. L'altro significativo di preoccupazione per questa preparazione è che può essere molto facile danneggiare componenti cellulari come il rivestimento endoteliale o al muscolo liscio vascolare, tale fonte variabile di errore può essere introdotto. Si raccomanda vivamente che il singolo ricercatore utilizzare misure appropriate per garantire la qualità della preparazione, sia durante la fase iniziale dell'esperimento e periodicamente nel corso di un protocollo.
Protocollo
1. Prima dell'esperimento
- Prima del giorno dell'esperimento, tubi di vetro capillari delle dimensioni adeguate per la stazione sono tirato in micropipette (un estrattore orizzontale o verticale possono essere utilizzate). Il diametro della punta può essere facilmente regolata a seconda che la nave abbia isolato, anche se in genere utilizzano una gamma di diametri tra 50-150 micron. Questi vengono poi piegato per la configurazione appropriata per il riscaldamento dei microvasi seguente stazione sopra una fiamma butano. Punte micropipette sono fisicamente rotti per circa il diametro (con pinze sottili) per il microcircolo in questione e può terra o l....
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Discussione
Il protocollo presentato descrive la cannulazione isolamento, rimozione e di un doppio microvasi muscolo scheletrico, sebbene questa tecnica generale può essere facilmente applicato alla maggior parte dei tessuti. Per il manoscritto attuale, il termine "arteriole" è stato utilizzato dagli autori per descrivere una nave resistenza compresa tra 70-120 micron di diametro a riposo sotto tono attivo, che è anche un importante contributo alla regolazione della resistenza perfusione ad un organo o tessuto.
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (EIA 0740129N) e NIH T32 HL90610.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti e materiale | Azienda | Commenti / Catalogo # | |
| Vessel Camera | Costume | Dave Eick (MCW) | |
| Riscaldato bagno di acqua circolante | PolyScience e Haake | Haake DC 10 | |
| Pipette | Frederick Haer & Co. | Tubo capillare 2,0 millimetri OD x 1.0 mm ID (27-33-1) | |
| Pressure Monitor | Mondo Strumenti di precisione | ||
| Water Reservoir camicia | Costume | ||
| Sorgente di luce esterna | Mondo Strumenti di precisione | Novaflex | |
| Pipettare Puller | Microdata Instruments | PMP102 Micropipette Puller | |
| Comple completozione di strumenti chirurgici | Strumenti di Scienze Belle | Dumont | |
| Ultra Pinze Belle | Strumenti di Scienze Belle | Inox # 5 | |
| Silk sutura Discussione | Ethilon | # 10-0 o 9-0 | |
| Microscopio Stereo | Olimpo | Olympus SZ-11 | |
| Calibri video analogici | BOECKELER | Via Controller (Via-100) | |
| Analogica ad alta risoluzione della fotocamera | Panasonic | GP-MF 602 | |
| Serbatoio di ossigeno | Regionale | L'equilibrio di azoto 21% e il 5% di CO 2 di azoto equilibrio | |
| Tubi | Tygon | ||
| Pompa di scarico | Cole Parmer Instrument Co. | ||
| PSS Rat modificati | Vedi ricetta qui sotto | ||
| Van Breemen del PSS rilassanti | Vedi ricetta qui sotto |
Tabella 1. Un elenco delle principali componenti della configurazione isolata stazione di microvasi presentato nelle figure.
| Modificato Rat Ricetta PSS | Per fare due litri di PSS | 20X magazzino Salt (2L) | 20X scorta (2L) |
|---|---|---|---|
| NaCl | 278,0 g | ||
| KCl | 14,0 g | ||
| MgSO 4-7H 2 O | 11,5 g | ||
| CaCl 2-H 2 O | 9,4 g | ||
| NaHCO 3 | 80,8 g | ||
| EDTA | 0,4 g | ||
| NaH 2 PO 4 | 0,28 g | ||
| Glucosio | 1,98 g | ||
| 20x Salt magazzino | 100 mL | ||
| 20x della scorta | 100 mL | ||
| Acqua distillata | 1800 mL |
Tabella 2. Ricetta per standard di soluzione salina fisiologica (PSS) utilizzato nei protocolli microvasali isolati.
Commenti a Ricetta: Fai 2 L di Stock sale e 2 litri di scorta. Questi cuno in frigorifero quando non viene utilizzato, ma scuoterli bene e spesso prima di preparare PSS. Gli ingredienti aggiuntivi vengono aggiunti al momento della preparazione della PSS finali.
| Van Breemen del PSS rilassanti | Per fare 2 litri di PSS | 20X magazzino Salt (1L) | 20X scorta (1L) |
|---|---|---|---|
| NaCl | 107,4 g | ||
| KCl | 7,0 g | ||
| MgSO 4-7H 2 O | 5,76 g | ||
| MgCl 2-6H 2 O | 81,32 g | ||
| NaHCO 3 | 40,4 g | ||
| EDTA | 0,2 g | ||
| EGTA | 15,22 | ||
| NaH 2 PO 4 | 0,28 g | ||
| Glucosio | 1,98 g | ||
| 20x Salt magazzino | 100 mL | ||
| 20x della scorta | 100 mL | ||
| Acqua distillata | 1800 mL |
Tabella 3. Ricetta per una soluzione rilassante Van Breemen di sale fisiologica (PSS) utilizzato nei protocolli microvasali isolate in condizioni di tono attivo pari a zero.
Commenti a Ricetta: Fai 1 litro di brodo sale alnd 1 L di scorta. Questi possono essere refrigerato quando non viene utilizzato, ma scuoterli bene e spesso prima di preparare PSS. Gli ingredienti aggiuntivi vengono aggiunti al momento della preparazione della finali PSS rilassanti.
Riferimenti
- Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. , 1-18 (2009).
- Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C.
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