Il Ex vivo Preparazione isolato microvasi scheletrico per le Indagini di reattività vascolare

Summary

Un

Abstract

La preparazione dei microvasi isolato è un preparato ex vivo che consente l'esame dei contributi di diversi fattori che diametro natante di controllo, e quindi, la resistenza perfusione ^1-5. Questa è una preparazione classica sperimentale che è stato, in larga misura, inizialmente descritto da Uchida et al ^15. Diversi decenni fa. Questa descrizione iniziale fornito la base per le tecniche che è stato ampiamente modificato e ampliato, principalmente nel laboratorio del Dr. Brian Duling presso la University of Virginia ^6-8, e presentiamo un approccio corrente nelle pagine seguenti. Questo preparato in modo specifico riferimento alla arteriola gracilis in un topo come microvasi di scelta, ma la preparazione di base può essere facilmente applicata alle navi isolati da quasi qualsiasi altro tessuto o organo tra le specie ^9-13. Meccanica (cioè, dimensionale) cambiamenti nel isolato microvasi può essere facilmente valutatain risposta ad una vasta gamma di fisiologico (ad esempio, ipossia, pressione intravascolare, o taglio) o sfide farmacologici, e può fornire informazioni sul elementi meccanici comprendenti risposte integrati in uno intatto, sebbene ex vivo, tessuto. Il significato di questo metodo è che permette la manipolazione facile delle influenze sulla regolazione integrata del diametro microvasi, consentendo anche per il controllo di molti dei contributi provenienti da altre fonti, compresa la pressione intravascolare (miogenico), innervazione autonomica, emodinamica ( ad esempio, sforzo di taglio), stimoli endoteliali dipendenti o indipendenti, e le influenze ormonali, parenchimali, per fornire una lista parziale. Sotto opportune condizioni sperimentali e con obiettivi adeguati, questo può servire come un vantaggio rispetto in vivo o in situ di tessuti / organi preparati, che non consentono facilmente per il controllo di facile ampie variabili sistemiche.

La maJor limitazione di questa preparazione è essenzialmente la conseguenza delle sue forze. Per definizione, il comportamento di questi vasi è stata studiata in condizioni in cui molti dei contributi più significativi alla regolamentazione della resistenza vascolare sono state rimosse, compresa neurale, umorale, metabolica, ecc Come tale, l'investigatore è avvertiti di evitare un eccesso di interpretazione e estrapolazione dei dati raccolti utilizzando questa preparazione. L'altro significativo di preoccupazione per questa preparazione è che può essere molto facile danneggiare componenti cellulari come il rivestimento endoteliale o al muscolo liscio vascolare, tale fonte variabile di errore può essere introdotto. Si raccomanda vivamente che il singolo ricercatore utilizzare misure appropriate per garantire la qualità della preparazione, sia durante la fase iniziale dell'esperimento e periodicamente nel corso di un protocollo.

Protocol

1. Prima dell'esperimento

1. Prima del giorno dell'esperimento, tubi di vetro capillari delle dimensioni adeguate per la stazione sono tirato in micropipette (un estrattore orizzontale o verticale possono essere utilizzate). Il diametro della punta può essere facilmente regolata a seconda che la nave abbia isolato, anche se in genere utilizzano una gamma di diametri tra 50-150 micron. Questi vengono poi piegato per la configurazione appropriata per il riscaldamento dei microvasi seguente stazione sopra una fiamma butano. Punte micropipette sono fisicamente rotti per circa il diametro (con pinze sottili) per il microcircolo in questione e può terra o lucidato per le conformazioni appropriati, se necessario per l'applicazione specifica. Per una revisione ampia e straordinaria su queste procedure, il lettore si rivolge a Davis et al. ^16. Due micropipette vengono poi poste in opposizione nei supporti pipetta per la camera dei microvasi. Queste devono essere orientato in modo che le puntesono nello stesso piano orizzontale e verticale all'interno della camera vaso.
   La camera dei microvasi usato in questo manoscritto (figure 1 e 2) è quella che è creato su misura da David Eick presso il Dipartimento di Fisiologia presso il Medical College of Wisconsin ( http://www.phys.mcw.edu/ e www . eicktech.com ). Tuttavia, molti altre configurazioni della camera dei microvasi sono facilmente disponibili in commercio, con quelli sviluppati da Living Instrumentation Systems ( http://www.livingsys.com/ ) e IonOptix ( http://www.ionoptix.com/ ) e 'molto comune. Utilizzando questi altri sistemi, può essere indispensabile utilizzare un microscopio invertito piuttosto che un convenzionale montante, anche se questo dipende dalla esperimento specifico e alle attrezzature. L'uso di microscopi invertiti sarebbe preferibile sperimentale protocols che richiedono l'imaging a fluorescenza o confocale.
2. Preparare una soluzione fisiologica salina (PSS, riportate qui di seguito) e garantire il pH è impostato su livelli appropriati alle specifiche condizioni sperimentali (7,38-7,42 è tipico e rientra nel range fisiologico). La soluzione PSS può essere preparata in anticipo e frigorifero, ma deve essere controllata la temperatura adeguata di pH prima dell'uso. PSS può contenere albumina se lo sperimentatore o protocolli specifici che richiede, anche se questo non è universalmente obbligatoria.
3. Le pinze video digitali utilizzate per misurare il diametro del vaso deve essere tarato usando un emocitometro o stage micrometro microscopio. Per la calibrazione accurata, è essenziale che il micrometro essere posizionato sullo stesso piano l'afflusso / efflusso micropipette nella camera nave.
4. Tie loop per il fissaggio del microcircolo per le pipette devono essere preparati ed essere facilmente accessibile per un uso successivo. Queste possono essere prontamente preparati 8-0 o minore oftalmica sFUTURO. Il ciclo legame singolo può essere preparato in anticipo e memorizzati in una capsula Petri rivestito su una piccola striscia di nastro rovesciato che circonda un vetrino da microscopio fino a quando necessario (questo tenerli vengano perse). (Figura 3).

2. Day of the Experiment

1. Tutte le attrezzature di sostegno dovrebbe essere attivato e controllato il corretto funzionamento. Questo include la tabella anti-vibration/floating e il bagno circolante acqua riscaldata (impostato per fornire la temperatura appropriata nel bagno recipiente - comunemente 37 ° C), tutti i trasduttori di pressione e la camera della pompa di scarico recipiente (Figura 1A e 1B). Accendere i gas bilancianti nella camera e nel recipiente il perfusato e serbatoi superfusate.
2. Riempire tutti i serbatoi, tubi, e camere con la soluzione PSS. La linea perfusato conduce alla pipetta afflusso deve essere completamente riempito per evitare la presenza di bolle d'aria in questa linea che potrebbero danneggiare il dislocare e vaendotelio scular (Figura 1C). Se necessario, utilizzare una siringa per spingere delicatamente le PSS tutto il percorso attraverso la pipetta per assicurarsi che è completamente pieno e senza alcun blocco che potrebbe impedire il flusso perfusato. La pressione di flusso deve essere mantenuto entro limiti ragionevoli per evitare di danneggiare i trasduttori di pressione.

3. La raccolta dei microvasi

1. Dopo anestetizzante dell'animale da cui il microcircolo è da prendere, la nave in questione devono essere isolati secondo le procedure che sono più appropriato per il sistema vascolare da studiare. In alcuni casi, ciò può richiedere la rimozione dell'organo stesso (ad esempio, microvasi cerebrali o coronarica), mentre in altre, vasi possono essere rimossi direttamente dal anestetizzato animale (ad esempio, muscolo). Un esempio di orientamento del recipiente all'interno del muscolo gracile è presentata in Figura 4. Stima della lunghezza della nave in vivo prima della rimozione con perfunghi porcini o pinze di piccole dimensioni. Prima della rimozione della nave dall'animale / organo, può essere molto utile per effettuare un ultimo controllo per accertarsi che la camera nave è pronta e funziona correttamente (compresi tutti i cicli di tiranti in vigore).
2. Rimuovere il vaso dall'animale / organo afferrando il lato esterno della nave ad una estremità con una pinza sottile e taglio lungo la lunghezza della nave finché è libero, estrema cura per evitare qualsiasi tirando o tirando sulla nave. Una volta liberato, metterlo immediatamente in una provetta da centrifuga 1,7 mL riempito con PSS, ma non lasciare andare la nave. Questo è da ricordare l'orientamento, in modo tale che la direzione perfusato nel bagno sarà identico alla direzione del flusso sanguigno nel animale.

4. Cannulating della Nave

1. Mettere il recipiente nel bagno riempita e incannulare l'estremità prossimale sulla pipetta afflusso. Ciò può meglio essere realizzato con un tasso di perfusione modesto attraverso la cannula (~ 50 mmHg di pressione) euna coppia di pinze fini usato per tenere ciascun lato della nave prossimale lume parete (cioè, una coppia di pinze in ogni mano). Nel nostro laboratorio, usiamo una pinza sottile da Strumenti Scienze Arti ( http://www.finescience.com/Home.aspx ), anche se le pinze opportunamente costruiti funziona in modo efficace. Infilare la nave sulle punte della cannula e far avanzare la nave sulla punta fino al punto in cui due cicli cravatta può garantire la nave.
2. Aumentare la pressione afflusso di ~ 75 mmHg per gonfiare ulteriormente la nave e facilitare l'incannulamento sulla punta della pipetta distale. Il flusso attraverso il recipiente deve essere visto come una distorsione nel serbatoio superfusate al deflusso distale del vaso (al microscopio). Incannulare l'estremità distale della nave sulla pipetta deflusso e fissarlo con due anelli pareggio (questi anelli finali devono essere in atto prima della cannulazione; Figura 5).
3. Regolare la cannula fino in coordinate XYZ come needed finché c'è una minima distorsione nel vaso, e il vaso approssima la lunghezza in vivo. Aumentare la pressione fino afflusso si approssima la percentuale della pressione arteriosa media normalmente sperimentato da tale segmento del vaso (nostro laboratorio utilizza 80% della pressione arteriosa media delle arteriole resistenza grandi del muscolo gracile ^8).
4. Mettere una piccola pietra bubbling fornire la miscela di gas appropriata in bagno e posto involucro di plastica o di una copertura in vetro sopra la camera per evitare schizzi, la lente del microscopio. Usiamo una pietra bubbling che è comunemente disponibile affatto PET / depositi dell'acquario ed è di circa 1 cm di diametro, anche se una dimensione inferiore funziona in modo efficace anche. La presenza della pietra gorgogliamento assicura la disponibilità di gas appropriata al recipiente in ogni momento e si estenderà vitalità vaso. Questa pietra viene rimossa durante tutti i periodi di misura (o flusso d'aria attraverso la pietra temporaneamente interrotto) per evitare la distorsione dellaimmagine. Rilasciare il morsetto sulla pipetta deflusso e consentire il flusso attraverso il vaso per 30 minuti. Periodicamente, il flusso deve essere fissata al tubo di uscita per determinare se la nave sta sviluppando tono muscolare. Tutte le navi devono essere controllati per perdite di pressione a questo punto. Perdite sarà evidente introducendo una pressione nota nel recipiente (si usano comunemente 100-120 mmHg) e bloccaggio del deflusso, seguito dal flusso, le linee. Se la pressione intraluminale è stabile, non ci siano perdite distinguibili. Tuttavia, se la pressione comincia a scendere, una perdita significativa è presente e deve essere chiuso. Perdite sia l'afflusso e di deflusso pipette possono essere normalmente corretti con l'aggiunta di un loop aggiuntivo legato intorno alla nave sulla pipetta. In alternativa, se un vaso ha un piccolo ramo laterale che sta permettendo la perdita, ciò compromettere la capacità del recipiente per contenere pressione efficace e può introdurre una ulteriore fonte di errore. Se questa perdita viene identificato, si può di norma essere legato off with un singolo ciclo di 10-0 sutura oftalmico. In alternativa, un unico filo preso in giro 6-0 sutura per rendere il ciclo cravatta è anche molto efficace. Se la perdita non può essere identificato o non possono essere efficacemente legato off (per esempio, non vi è alcuna tronco di ramificazione laterale e semplicemente un foro nella parete del vaso), questo può causare una terminazione prematura dell'esperimento e l'uso di un recipiente alternativo diventare necessario (questo è generalmente il vaso identico nell'altra gamba - o laterale controlaterale se necessario - dell'animale).
   
   La nave dovrebbe essere consentito di equilibrare in nessun condizioni di flusso per un minimo di 30 minuti. Tutti gli esperimenti sono condotti in condizioni di flusso nullo. Una volta che la nave è sviluppata tono soddisfacente ed è sensibile ai criteri di inclusione per l'esperimento in questione, la nave è pronto per lo studio successivo.
   
   Questi criteri di inclusione possono variare a seconda del protocollo sperimentale specifico e sperimentatore. Nel nostro laboratorio, abbiamo regolarmente utilize quanto segue:
   1. Tono attivo di> 30% (calcolato come ΔD / D _max x 100, dove ΔD è l'aumento del diametro arteriolare parete interna dai valori sotto la pressione di equilibrio in risposta all'esposizione a Ca ^{2 +-PSS} libera e D _max è la massima diametro misurato la pressione equilibrazione nelle Ca ^{2 +-libere} PSS).
   2. Attivazione miogenico (mantenimento di, o preferibilmente una riduzione, diametro arteriolare con aumento della pressione endoluminale) come indice di una valida strato muscolatura liscia vasale.
   3. Un rivestimento vitale endoteliale, come evidenziato da una vivace risposta dilatatore all'acetilcolina (10 ^-6 M nella vasca da bagno).
   4. Criteri di inclusione addizionali possono essere aggiunti secondo il protocollo sperimentale specifico, se necessario, ivi comprese le risposte alle costrittori agonisti adrenergici come la fenilefrina (10 ^-7 M), le risposte dilatatori ad altri stimoli come l'adenosina (10 ^-5 2 nel gas equilibrio).
5. La sezione seguente è un esempio di "esperimento mock". Tutte le soluzioni vengono preparate a seconda dei casi, con attenzione per tenere conto del fattore di diluizione dei PSS nella camera nave. Come esempio, per alcune delle nostre attrezzature, il volume della camera nave è 20 ml. Come tale, 20 pl di un 10 ^-2 M soluzione risultati fotografici in una concentrazione efficace di 10 ^-5 M nel bagno camera nave. Dopo la rimozione vaso, incannulazione, equilibrazione e validazione come sopra descritto, l'esperimento è pronto per iniziare. Specifiche come randomizzazione il trattamento e l'efficacia sono specifiche esperimento e che consumano spazio eccessivo per questo sforzo. Come tale, non sono incluse in dettaglio.
   
   Le prime risposte di controllo sono determinati. Ad esempio uno stimolo fisiologico come l'attivazione miogenico (pressione indotta costrizione), intralumenal prEssure è alterata in modo casuale su tutta la gamma desiderata, e la nave è consentito un adeguato periodo di tempo per rispondere (in questo caso, ci avrebbe permesso un periodo di 5-7 minuti). Ad esempio uno stimolo farmacologica come sfida con acetilcolina, il farmaco viene aggiunto al ritorno da soluzioni stock in un ordine casuale. In questo caso, si usa normalmente un intervallo da 10 ^-9 a 10 ^-5 M nel bagno, con washout essendo definito come un ripristino di diametro equilibrazione. Come acetilcolina è un agente ad azione rapida, risposte massime dilatazione può essere facilmente realizzato in pochi secondi. Altri agenti (come peptidi) può richiedere molto più tempo per provocare una risposta massima e questo molto essere preso in considerazione, come pure il periodo di tempo necessario per lavaggio efficace. Una volta che le risposte di controllo sono stati raccolti, gli interventi specifici possono essere imposti al sistema, compresi l'incubazione della nave con gli agonisti dei recettori / antagonisti, gli agenti che operano in specifici canali ionici, istigazionealterata la pressione intraluminale, le differenze di gas equilibrazione o agenti farmacologici mirati a specifici sistemi enzimatici, per citarne alcuni degli interventi più comuni.
   
   Dopo un momento opportuno per l'intervento per essere efficace (che devono essere testati in modo appropriato), un turno successivo di raccolta dei dati può essere avviata. A seconda del protocollo sperimentale specifico, gli interventi successivi può essere imposto alla nave o il primo può essere rimosso (o da washout - rimozione o semplice della sfida fisiologica - quando possibile). Una volta che la nave è tornata al suo stato di equilibrio (che dovrebbe essere verificata), gli interventi successivi può essere applicato, se necessario con dati aggiuntivi raccolti. Questa procedura generale verrebbe continuata fino al termine dell'esperimento o fino alla qualità della preparazione recipiente scende sotto criteri di soglia prefissati (ad esempio, risposta a un agonista o la capacità di sviluppare sufficiente tono attivo). A questo punto, l'esperimento è concluso sia, o il ricercatore può desiderare di raccogliere dati che è indipendente dalla reattività del recipiente isolato (come la meccanica della parete del vaso, che possono essere condotti utilizzando la procedura di attivazione identica miogenico, solo con una nave priva di ogni tono attivo ^14).
6. La pulizia regolare tutte le attrezzature è essenziale per la rimozione di accumulo sale e la prevenzione della crescita di qualsiasi entità biologiche indesiderate. Alla fine di ogni giorno dell'esperimento, come minimo, tutte le linee e le camere sono completamente lavata di PSS con abbondanti quantità di acqua distillata o deionizzata e lasciati asciugare completamente. Dopo ogni 2-3 giorni di utilizzo, un lavaggio con alcool etilico viene anche effettuato e l'apparecchiatura viene lasciato asciugare completamente. Alla fine di ogni settimana di uso costante, tutte le linee e le camere vengono riempiti con 0,1 M di acido cloridrico, concesso a 'incubare' per 30 minuti e poi lavate con acqua come sopra. Infine, lafine di 2-3 settimane di utilizzo consecutive, tutte le sezioni di tubi vengono sostituiti con nuovi e la camera e serbatoi vengono puliti con HCl 1,0 M seguito da un ampio risciacquo con acqua distillata / deionizzata. Se uno qualsiasi di decolorazione stabilimento tubi o visivo di una crescita nella tubazione o qualsiasi elemento della camera / serbatoi, questi vengono sostituiti o puliti come appropriato. Con la regolare pulizia e manutenzione generale, l'impianto può durare un tempo molto lungo. Al momento della scrittura, le nostre camere sono tutte navi nel loro 8 ^° o 9 ^° anno di uso routinario e abbiamo avuto alcuna difficoltà significativa con loro.

5. Risultati rappresentativi

Figura 1A. Questa figura presenta la base impostazione stazione dei microvasi. Una televisione = per la visualizzazione nave, b = pinze digitali; C = siringa per spingere superfusate thrpipetta afflusso ough se necessario; D = colonna idrostatica di pressione per cambiare perfusato afflusso; E = microscopio; F = microvasi camera; G = superfusate serbatoio; H = pressione monitor (multiple possono essere aggiunte se necessario); I = microvasi camera della pompa di drenaggio per superfusate; J = gas tank equilibrio miscela; K = rifiuti contenuti (per superfusate); L = scaldabagno circolante; anti-vibration/floating M = tavolo.

Figura 1B. Questa figura presenta una visione più ravvicinata del setup camera dei microvasi. In questa figura, E = microscopio; F = microvasi camera; H = monitor della pressione (mentre mostra un solo per semplicità, multiple può essere aggiunto a siti diversi, se necessario); I = microvasi pompa di scarico della camera; N = tubo collegato al fin dall'inizio della pipetta afflusso perfusato (una continuazione da 'D' in Figura 1A); O = tubo attaccato alla pipetta deflusso perfusato.

Figura 1C. Questa figura presenta il più vicino vista della camera microvasi. In questa figura, la linea N = perfusato (cioè, tubazione collegata direttamente alla pipetta afflusso perfusato); = O tubo direttamente fissata alla pipetta deflusso perfusato; P = i controlli posizione orizzontale e verticale per la pipetta afflusso, Q = la superfusate scarico per il bagno di acqua (collegato a 'I' nelle Figure 1A e 1B), R = l'afflusso per bagno d'acqua proveniente dal serbatoio (collegato a 'G' in Figura 1A).

Figura 2. Questa figura mostra una rappresentazione schematica del flusso di liquidi e gas nel sistema. In questa figura, A = PSS afflusso linea superfusate; B = PSS linea perfusato di afflusso pipetta; C = PSS scarico superfusate da bagno da perdere contenitore; D = PSS deflusso perfusato dalla pipetta di deflusso; E = ingresso acqua riscaldata in giacca da camera; F = uscita acqua riscaldata dalla giacca da camera.

. Figura 3 Questa figura presenta legame singolo loop fatto da sutura oftalmica (viste attraverso un microscopio da dissezione con gli oculari 10x e uno zoom con ingrandimento 4,5 x regolabile; Panel A) che vengono utilizzati nella nostra preparazione e lo stoccaggio di loop cravatta più 8-0 e 10-0 sutura sul nastro rovesciato intorno ad un vetrino da microscopio, che è memorizzato in una capsula Petri coperto (per evitare di perdere loro; Pannello B).

Figura 4. Questa figura fornisce una immagine (visto attraverso un microscopio standard di dissezione) della arteriola resistenza muscolo gracile prima dell'isolamento e la rimozione chirurgica per consentire il corretto orientamento spaziale.

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Figura 5. Questa figura fornisce un'immagine rappresentativa di uno microvasi cannulato. Pannello A mostra l'intera lunghezza della nave, sia con afflusso (A) e deflusso (B) pipette nonché loop tiranti (C) mostrati. Pannello B presenta un'immagine ad alto ingrandimento, che mostra chiaramente la determinazione del diametro interno arteriolare con i compassi digitali (in questo caso il diametro è 112 um).

Figura 6. Questa figura presenta le immagini rappresentative di un equilibrio cannulata seguito dei microvasi. L'immagine è superiore di un recipiente sotto controllo, non stimolate condizioni alla pressione di equilibrio, il mezzo è immagine del vaso stesso a seguito dilatazione di impugnare con acetilcolina (10 ^-6 M nel bagno), e l'immagine è inferiore di tale nave dopo constriction per sfidare con fenilefrina (10 ^-7 M nella vasca da bagno).

. Figura 7 Questa figura riassume le risposte di un isolato microvasi in risposta alla sfida con: ipossia (Pannello A, una riduzione perfusato e superfusate PO ₂ nel nostro sistema di ~ 135 mmHg a ~ 40 mmHg), concentrazioni crescenti di acetilcolina (Pannello B), le variazioni della pressione intravascolare in condizioni di controllo e di incubazione seguito della nave con un calcio privo di PSS (gruppo C).

Discussion

Il protocollo presentato descrive la cannulazione isolamento, rimozione e di un doppio microvasi muscolo scheletrico, sebbene questa tecnica generale può essere facilmente applicato alla maggior parte dei tessuti. Per il manoscritto attuale, il termine "arteriole" è stato utilizzato dagli autori per descrivere una nave resistenza compresa tra 70-120 micron di diametro a riposo sotto tono attivo, che è anche un importante contributo alla regolazione della resistenza perfusione ad un organo o tessuto.

Con alcune modifiche, questo sistema può essere installato più applicazioni per l'investigatore specifico e consente facilmente per l'incorporazione di tecniche aggiuntive per fornire più in profondità sperimentazione (ad esempio, l'uso di elettrodi transmembrana per la determinazione del potenziale di membrana ^17). Un passo fondamentale nella preparazione di base è sempre assicurando che le pipette di afflusso e deflusso che vengono utilizzati per incannulare il vaso sono ben assortiti, rimanere chiaro, e consentireportata e pressione da mantenere in modo facile. Quando le pipette intasarsi con pezzi minuti di detriti, può essere necessario per rompere pezzi molto piccoli delle punte per ripristinare il flusso. Se l'investigatore è attento, pipette può essere riutilizzato più volte fino a raggiungere un punto in cui o non possono essere unclogged o dei diametri sufficientemente grandi cannulazione del vaso diventa estremamente difficile. Tuttavia, con padronanza di questa preparazione chirurgica e sperimentale, cura dei dettagli, e le opportune modifiche in base alle condizioni e ai requisiti specifici, gli investigatori può facilmente valutare i percorsi che determinano la reattività vascolare in risposta ad una miriade di problemi fisiologici e farmacologici. Questa preparazione consentirà anche al ricercatore di effettuare analisi di base su alterazioni vascolari meccanica parete in condizioni di assenza di tono attivo ^14. Questo è davvero una tecnica molto potente e flessibile ed è uno chepuò facilmente essere utilizzato per applicazioni che copre la gamma di uno studio approfondito meccanicistico high-throughput screening di più risposte di base.