Um sistema totalmente automatizado e altamente versátil para testes de várias funções cognitivas e registro das atividades neuronais em roedores

Summary

Neste relatório, nós apresentamos um sistema totalmente automatizado e altamente versátil, capaz de, simultaneamente, testar multi-cognitivas comportamentos e registro das atividades neuronais para roedores.

Abstract

Nós desenvolvemos um sistema totalmente automatizado para testes de comportamento operante e registro da atividade neuronal através do qual várias funções cognitivas do cérebro podem ser investigados em uma seqüência única tarefa. A única característica deste sistema é uma custom-made câmara, acusticamente transparente que elimina muitos dos problemas associados ao controle auditivo de sinalização em câmaras mais disponíveis comercialmente. A facilidade com a qual os dispositivos operantes podem ser adicionados ou substituídos torna este sistema muito versátil, permitindo a aplicação de uma variedade de auditivo, visual e olfactivos tarefas comportamentais. A automatização do sistema permite o controle fino (10 ms) e temporal preciso selo de tempo de cada evento em uma seqüência predefinida comportamental. Quando combinado com um sistema de gravação multi-canal de eletrofisiologia, múltiplas funções cognitivas do cérebro, tais como motivação, atenção, tomada de decisão, paciência e recompensas, podem ser examinados em seqüência ou de forma independente.

Protocol

Visão Geral do Sistema

O sistema compreende três componentes principais: (1) um quarto de parede dupla prova de som (Companhia Acoustical Industrial, Bronx, New York), (2) um múltiplo canal do sistema de gravação electrofisiológico (Neuralynx, Bozeman, MT) e (3) um totalmente automatizado, o sistema de personalização de teste comportamental da Associates Inc. Med (St. Albans, VT).

Como mostrado na Figura 1A, a câmara de operante está localizado no interior da sala à prova de som. Um comutador (Modelo SL-36, Dragonfly investigação e desenvolvimento, Inc., Ridgeley, West Virginia) para ligar os cabos de headstage ao sistema de gravação electrofisiológico (Figura 1A-a), e uma câmara de vídeo para a monitorização e gravação de comportamentos animais são montados acima câmara operante (Figura 1A-b).

Custom-Designed Câmara operante

O design personalizado, Operan acusticamente transparentet câmara (Figura 1A-d) consiste em três paredes acusticamente transparentes e um painel de operação modular (Figura 1B). Três altifalantes (tweeter Cage, ENV_224BM, Med Associates) montado no topo do meio e dois painéis laterais são utilizados para as pistas auditivas emissores. Estímulos auditivos são gerados por um gerador de áudio calibrado, programável (ANL-926). Uma luz de estímulo (ENV_221M) e duas telas de estímulo triple-LED (ENV_222M) estão localizados nos painéis média e lateral, respectivamente. Estas luzes de estímulo pode ser usado para auditivo-visuais multi-sensoriais testes comportamentais. Um dispositivo de puxão nariz com três luzes de cores de LED (ENV_114M) é montado na parte inferior do painel central. Um detector de infravermelhos instalado dentro da unidade de puxão nariz é usado para sinalizar focinhar e segurando período. As luzes de LED no interior da unidade de puxão nariz pode ser usado para a formação do nariz hold-no interior do furo. Uma resposta móvel alavanca (ENV_112CM) está montado em cada lado do painel operante. O mobility destas alavancas permite um controle flexível da presença das alavancas, que podem ser eficazmente utilizadas para formação tanto tarefa inicial eo estudo de várias importantes funções cognitivas do cérebro (ver abaixo). Quatro pares de fontes de feixe de infravermelhos e detectores (EVN_253SD) controladas por um de quatro canais IR controlador (ENV_253) são colocadas na parte inferior da câmara para ambos indicam as posições do animal e controlar outros dispositivos com base na posição de um animal (Figura 1A- e). Dois dispensadores pelota cada um com uma. Embutido sentinela infravermelho (ENV_203M-45IR) são utilizados para a distribuição de recompensas na recipientes pelete (Figura 1A-c) A sentinela de infravermelho é usado para monitorar falha de dispensador de pelotas e fornecer sinais de alerta.

Configuração do Sistema

A síntese de ligações do sistema e os componentes de hardware é ilustrado na Figura 2. Funcionalmente, existem duas linhas paralelas, interativosub-sistemas: um para treinamento de comportamento e outro para gravação eletrofisiológico. Os dois sub-sistemas são sincronizados através do MED-PC plataforma de Software IV (SOF-735). O computador envia comandos para os dispositivos de comportamento e leguminosas TTL para o sistema de gravação neural (sinal fluxos indicado pelas setas vermelhas na Figura 2), e recebe sinais gerados pelas respostas dos animais e actividades neuronais (sinal fluxos indicado pelas setas verde e azul, respectivamente, na Figura 2). Esses paralelos, sistemas interativos permitem gravações de sincronizados comportamentais / neuronal de dados e permitem a manipulação do comportamento animal com base na atividade neural, ou vice-versa.

Comportamento sistema de formação sub-Um painel de ligação SmartCtrl (SG-716B) serve como um painel de comunicação de duas vias: ou seja, enviando os sinais de controle (seta vermelha na Figura 2) do computador para os dispositivos comportamentais (listado na caixa vermelha), e transmit animal sinais de resposta (seta verde na Figura 2) de volta para o computador. As saídas do canal quatro IR controlador (ENV_253) também são encaminhados para o painel de ligação. Uma placa de interface (SmartCtrl placa de interface, DIG-716B) e um cartão de descodificação (DIG-700F) comunicar os sinais a partir do painel de ligação para um cartão de PCI (DIG-704PCI) instalado no computador. Auditivas As pistas são gerados pelo gerador de estímulos (ANL-926), que também é controlada pelo software IV MED-PC através da placa de descodificação (DIG-700F). Como ilustrado na Figura 2, todas as cartas de interface são albergados num gabinete de interface de mesa (SG-6080D). Este gabinete também fornece poderes para todos os dispositivos de comportamento.

Sinais electrofisiológicos gravação sub-sistema de Animais de resposta recebido pelo computador são instantaneamente enviado para o sistema de gravação neural via o TTL Superporto cartão (DIG-726) ea chita Digital Box Interface (Neuralynx, Bozeman, MT) (Figura 2). Estes eventos são de comportamento em tempo carimbado e gravado simultaneamente com atividades neurais. Picos neurais detectados em linha a partir do sistema de gravação Neuralynx pode ser usado como sinais de entrada para o controle comportamental sub-sistema para manipular ou interferir comportamento animal. Inversamente, os sinais de resposta do animal pode ser usado como gatilhos para manipular ou interferir actividades neuronais, quando combinado com técnicas de estimulação eléctrica ou optogenetic. Estas abordagens serão valiosas para a elucidação causalidades entre as atividades neuronais e comportamentos.

Programação e processamento de dados Os programas de controle de comportamento são escritos com Trans IV software (Thomas A. Tatham e MED Associates) e compilado com compilador Pascal. Automação de cada etapa de treinamento é realizado por carregar o programa Trans IV para o Software IV MED-PC. Parâmetros de treinamento também pode ser ajustado em linha por formadores wnquanto o MED-PC Software IV está sendo executado. Os códigos Trans IV precisa ser específica para ambos a configuração do sistema e da tarefa comportamental. Programas de treinamento padrão são, no entanto, disponível gratuitamente no MED Associates e pode ser modificado para atender às necessidades específicas de laboratório individual. Os programas de treinamento utilizados em nossas instalações também são livremente disponíveis mediante solicitação.

Os dados comportamentais são salvos automaticamente pelo Software IV MED-PC. Os dados salvos podem ser traduzidos em arquivos do Microsoft Excel usando o MED-PC Para Excel programa (MPC2XL, Thomas A. Tatham e MED Associates). Os arquivos traduzidos do Excel podem ser importados e analisados ​​em um ambiente MATLAB (MathWorks, Natick, MA). Os dados neurais, juntamente com a data e hora de eventos comportamentais gravados com o software Cheetah (Cheetah 5, Neuralynx, Bozeman, MT) também podem ser importados para MATLAB para análise.

Treinamento

Para ilustrar o funcionamento do presente sistema, descrevemos aqui umaDuas alternativas Escolha tarefa de discriminação Pitch, projetado para examinar o limiar de discriminação de freqüência de um rato. Uma ilustração esquemática da tarefa é mostrado na Figura 3.

1. Pré-treino

1. Começar com macho adulto ingénuos, Sprague-Dawley, ratos, idade ~ 60 dias.
2. Antes do treinamento, limitar a ingestão de alimentos até que o peso do animal é de aproximadamente 90% da linha de base peso libidum anúncio.

2. Gaiola Aclimatação

1. Para preparar a câmara para aclimatação, retrair as alavancas e bloquear o furo puxão nariz com uma rolha de borracha (feita a partir do êmbolo de uma seringa de 60 cc) para impedir animal a partir de activação do dispositivo de nariz puxão.
2. O local de ~ 20 peletes totalmente nutricionais (45 mg de produto, # F0021, BioServ, Frenchtown, NJ) em cada recipiente pelete (comida copo).
3. Coloque um animal ingénuo na câmara de aclimatação. O rato vai em breve começar a explorar os copos de alimentos e comer as pelotas.
4. Forçar o rato se mover para ambos os lados da câmara, suprimindo peletes aleatoriamente em cada copo de alimentos. Uma sessão de 30 minutos é geralmente suficiente para estabelecer a associação de alimentos copo. Em uma sessão de 30 minutos, o rato geralmente obtém 200 - 300 pelotas, que são o suficiente para manter seu peso corporal em um nível constante de ~ 90% do valor basal.

3. Alavanca push-Formação

1. Em uma sessão de novo, estendem ambas as alavancas para dentro da câmara e deixar o copo de alimentos vazio.
2. Em seguida, coloque um rato dentro da câmara climatizada. Quando o animal entra na proximidade de uma alavanca, dispensar uma pelete manualmente através do software de IV Med-PC. Também proporcionar recompensas quando o rato mostra interesse na alavanca, como cheirar, tocar, ou subir. Um empurrão acidental da alavanca também deve desencadear uma recompensa automaticam pelo programa.
3. Para estimular a alavanca empurrando e para forçar a exploração de ambas as alavancas, permitir que o animal para empurrar cada alavanca consecutivamente um número limitado de vezes. Quando o limite for atingido, retire a alavanca. Quando ambas as alavancas de ter retraído, estendê-los para repetir o procedimento.
4. Diminuir gradualmente o limite até que as retrai alavanca cada vez que é empurrada. Uma a duas sessões de 30 minutos geralmente são o suficiente para estabelecer o impulso da alavanca - associação recompensa alimentar.

4. Nariz poke-Formação

1. Em uma nova sessão, retirar as alavancas, e retire a tampa de borracha do puxão nariz. Coloque várias bolinhas dentro do nariz puxão de estimular o interesse rato em explorar o dispositivo nariz puxão.
2. Reintroduzir o animal para dentro da câmara. Estender uma das duas alavancas aleatoriamente quando o rato fareja o furo nariz puxão para peletes alimentares.
3. Vendo a alavanca estendida, o rato se aproxima e empurre a alavanca para obter um alimento peldeixe. Após a alavanca é pressionada ea recompensa é dispensado, retirar a alavanca para incentivar o rato para explorar o dispositivo puxão nariz. Geralmente, leva cerca de 20 a 30 minutos para aprender a seqüência de tarefas: Nariz poke-→ → extensão da alavanca Lever empurrar → Rewards.

5. Formação Cue

1. Em uma nova sessão, jogar as pistas auditivas após um evento nariz cotovelada com um pequeno atraso (100 a 250 ms). Estenda ambas as alavancas esquerda e direita em breve (100 ms) após cada apresentação sinal sonoro.
2. Recompensar o rato apenas quando se empurra a alavanca que é indicado pelo sinal sonoro. O animal irá gradualmente aprender a associar um sinal sonoro específico com uma alavanca. O animal é então livre para começar um novo julgamento com a seqüência: Nariz poke-Cue → → → Lever impulso Recompensa / Não Recompensa (Figura 3). Por causa da alta taxa falsa nas sessões de aprendizagem inicial, suplementar food deve ser dada para manter o peso corporal após cada sessão de treinamento.
3. Nos próximos várias sessões de 30 minutos, que a prática de rato a tarefa recém-aprendido até um nível de desempenho consistente é atingido (ver Figura 3A para uma curva típica de aprendizado). Quando a tarefa for dominado, um rato pode obter cerca de 200 - 300 pelotas em cada sessão de 30 minutos, que são o suficiente para manter seu peso corporal.

6. Os resultados representativos

Seguindo o protocolo acima, nós ratos treinados para reconhecer dois padrões diferentes de pulso tom puro treina constituído por seis tone pips quer com a mesma frequência (F, F, F, F, F, F) ou diferentes frequências (F, F-Af , F, F-Af, F, F-Af) ^1-5. Cada pip tom é de 200 ms de duração eo intervalo pip tom é de 400 ms. No presente estudo, F foi ajustado para ser de 10 kHz e Af variou de 1 a 50% do F (Figura 3, em cima). Normalmente, Af foi definidopelo valor relativamente grande durante as sessões de formação: 5 kHz, 4 kHz, 3 kHz, 2 kHz e 1 kHz, para facilitar o treinamento. Cada trem de pulsos de tom puro com valor Af diferente foi apresentado de forma aleatória em uma determinada sessão.

O bi-Alternativa A escolha tarefa de discriminação pitch é ilustrado na Figura 3. Os ratos foram treinados para cutucar o nariz no buraco do nariz (Figura 1B e Figura 3, abaixo) para iniciar um julgamento. Puxão nariz desencadeia transmissão dos estímulos auditivos. Após o reconhecimento das pistas, os ratos precisam correr para o lado correto da câmara, a abordagem da alavanca, espere a alavanca para estender para dentro da câmara, em seguida, empurre a alavanca dentro de uma janela de tempo determinado (alavanca tempo ativo, 1 a 2 segundo) para obter uma recompensa (Figura 3). A taxa de acerto foi calculada para cada valor de Af como o número de ensaios de vida dividido pelo número de ensaios totais para cada valor de Af individual. Um critério de 75%taxa de acerto foi utilizado para indicar que o rato ter aprendido a tarefa. Uma curva de aprendizagem típico de um rato é apresentado na Figura 4A. Cada linha colorida representa o progresso de aprendizagem para cada trem de pulsos com Af diferente (ΔF0 representa o trem de pulso constante). Em média, foram necessários cerca de sete sessões de treinamento (a partir da primeira sessão de apresentação auditiva sugestão, Step Training Cue 5) para alcançar o critério da taxa de 75% hit.

Este sistema também permite a caracterização quantitativa do comportamento animal no desempenho da tarefa projetado por experimentadores. Três medições que são amplamente utilizados em animais estudos comportamentais são mostrados na Figura 4 B - D O tempo de reacção, reflectindo principalmente atenção de um animal para a tarefa, foi medida como decorrer do tempo entre o início dos sinais sonoros e push alavanca.. O intervalo inter-julgamento, refletindo como um animal foi comprometido com a tarefa em que o animal iniciado cada ensaioe não foi punido pelo tempo fora no julgamento falso, foi plotada na Figura 4C. A variação temporal do desempenho dentro de uma sessão, representando os padrões dinâmicos de desempenho geral de um animal e refletindo melhoria / adaptação que pode ocorrer em uma única sessão, foi plotada na Figura 4D. Cada sessão foi dividida em fase inicial, intermediária e tardia (10 minutos por etapa). Números acumulados de recompensas em cada estágio foram utilizados neste medição.

A base neural de diversos comportamentos cognitivos (Figura 5A e ver Discussão) podem também ser tratadas com este sistema, gravando as atividades neurais dos animais realizando uma tarefa. Exemplos de atividade neural gravados simultaneamente no núcleo basalis (RN) e área tegmental ventral (VTA) de um cérebro de rato são mostrados na Figura 5B e C. Os disparos de neurônios estão com carimbo de hora de se relacionar com cada caso de julgamento (como como nariz puxão,alavanca push, apresentação auditiva taco e reconhecimento, e real recebimento de recompensa) e analisados ​​em relação a esses eventos de tarefas comportamentais. Resultados de registro da atividade neural e comportamental combinado com este sistema será frutífero para elucidar a base neural de uma variedade de comportamentos cognitivos.

Figura 1. Os componentes principais do sistema (A) e um desenho esquemático da câmara de auditivo feito por medida operante (B). A. A câmara de operante está localizado numa parede dupla quarto à prova de som. Cunhas de espuma anecóicas são montadas ao longo das paredes da sala para eliminar dispersão de som e deflexão a:. Comutador para roteamento fios para sistema neuronal atividade de gravação; b: câmera de vídeo para monitorar e gravar comportamento animal; c: Pellet distribuidores; d: câmara operante . e:Receptores de infravermelho. B. A caixa de condicionamento operante é composto por três paredes acusticamente transparentes e um painel de operação modular. Veja o texto para descrições detalhadas.

Figura 2 vista geral esquemática. Do sistema. O sistema consiste de dois sub-sistemas: treinamento comportamental e sistema de gravação neural atividade. Os dois subsistemas interativamente comunicar uns com os outros através de pulsos TTL (ver Configuração do Sistema para detalhes). As setas vermelhas representam comandos e / ou eventos comportamentais enviados a partir do computador; as setas verdes indicam sinais de resposta de alimentação de animais de volta para o computador e na seta azul representa as entradas de sinal de eventos neurais detectados on-line com o sistema de gravação Neuralynx.

Figura 3. Duas alternativas Choice tarefa de discriminação de freqüência. Top, Diagrama de blocos mostrando a seqüência de tarefas básicas. representação, Bottom esquemática das principais ações comportamentais. Setas verdes indicam o fluxo sequencial da tarefa.

Figura 4 Os resultados representativos de duas alternativas tarefa de discriminação escolha da freqüência A. Aprendizagem curvas:.. Cada linha colorida representa o progresso de aprendizagem de um rato em discriminar cada variação de freqüência (ΔFs). A linha escura representa a curva de aprendizado média de variação de freqüência. B. Distribuição do tempo de reação medido como os tempos de voltas, desde o início da pista para empurrar a alavanca. C. Distribuição de inter-julgamento intervalo. D. dinâmica temporal do desempenho dentro de uma sessão medida com recompensas acumulados obtidos na fase inicial, intermediária e final de uma sessão. All os dados em B - D foi obtida na última etapa quando o desempenho do rato foi sobre a taxa de sucesso de 75%.

Figura 5. Exemplo de comportamentos cognitivos e funções cerebrais que podem ser investigados utilizando o sistema. Comportamentos A. cognitivas. As legendas de topo descrever cada ação em uma sequência de um julgamento. As legendas de fundo indicam os comportamentos cognitivos que podem ser estudadas. Note-se que ambas as alavancas foram extraídos em todas as imagens excepto no d onde a alavanca está no processamento de estender para dentro da câmara. B. Firing padrões de um neurónio registados no NB de um rato executar a tarefa auditivo dois da escolha. Top, Raster enredo imagem de disparar em cada tentativa. Cada rectângulo colorido representa o disparo da célula ea taxa de queima é codificado pela parte inferior da cor., Peri, mesmot histograma da taxa de queima. Observe o edifício-up do disparo antes da ação (empurrando a alavanca no tempo zero microssegundos, indicado pela linha vermelha pontilhada vertical) e de dispersão gradual da demissão após a ação. C. queima padrões de um neurônio gravado na VTA de um rato executar a tarefa auditiva dois escolha. Top, Raster enredo imagem do disparo de um único neurônio VTA em cada tentativa. Cada retângulo colorido representa o disparo do neurônio VTA e sua taxa de disparo é codificada por cor. Bottom, histograma Peri-evento da taxa de disparo mostrado na imagem raster. Observe o disparo escassa imediatamente antes da ação da alavanca empurrando (no tempo zero microssegundos, indicado pela linha vermelha pontilhada vertical) e queima vigorosa durante o período de tempo quando o rato é obter a recompensa. A actividade deste neurônio é praticamente silenciosa entre essas duas ações. Stereotrodes tungstênio implantados no cérebro foram utilizados para record atividades neurais simultaneamente a partir do NB e VTA, enquanto o rato foi executar a tarefa. Espiga triagem foi realizada off-line usando SpikeSort 3D Software (Neuralynx, Bozeman, MT).

Discussion

Um aspecto crítico no projeto de qualquer tarefa auditiva comportamental é a eliminação de sons indesejáveis ​​resultantes da dispersão e deformação no ambiente de teste. Controle de som pobre pode ter um efeito significativo sobre o comportamento que está sendo testado e irá produzir resultados enganosos ou mesmo não interpretável. A câmara de comportamental utilizado no sistema aqui descrito é especificamente concebido para ser acusticamente transparente, a fim de evitar desvios de som a partir das paredes da câmara. Na verdade, quando medido a partir do centro da câmara, a deflexão do som era eficaz indetectáveis ​​(dados não mostrados).

Embora este sistema foi desenvolvido principalmente para o estudo do sistema auditivo, ele pode ser facilmente adaptado por outros investigadores para estudar outros sistemas sensoriais. Modificações podem ser feitas facilmente no software e hardware para tarefas diferentes sem alterar a configuração geral do sistema. O painel de operação modular torna o sistema particularmente versatile, permitindo a adição e / ou substituições de diferentes dispositivos para novas tarefas comportamentais. Por exemplo, olfativos tarefas comportamentais pode ser implantado através da apresentação de estímulos olfativos no dispositivo puxão nariz. Os cinco escolha parede puxão iluminado nariz com estímulo olfativo do MED Associates (ENV-115A-DE) pode ser facilmente instalado no painel de operação para tarefas complexas olfativas. Além disso, todos os dispositivos operantes pode ser facilmente substituído por aqueles que são concebidos para os ratos sem alterar a configuração do sistema.

Controlo temporal precisa de cada dispositivo operante, bem como a gravação de alta resolução de eventos únicos em um ensaio dado, permitir a manipulação precisa dos dispositivos para personalizar o desenho de tarefas comportamentais para tratar diferentes funções cognitivas do cérebro (ver abaixo). Quando combinado com o registro da atividade neuronal, uma rica variedade de temas no campo das neurociências podem ser estudados com este sistema. Por exemplo, no umatarefa uditory descrito acima, as seguintes questões relacionadas com as funções cognitivas do cérebro podem ser investigados em um único teste:

(1). Motivação: Uma vez que cada ensaio é iniciado por animal "auto-motivated" acção nariz puxão-(Figura 5A-um e Figura 3), motivação pode, assim, ser avaliada quantitativamente através da medição do número total de ensaios realizados por um animal numa dada sessão, ou o número de ensaios consecutivos realizada ^6,7.

(2). Atenção: A chave para a obtenção de uma recompensa em um julgamento é reconhecer correctamente os sinais auditivos. Em cerca de 25% dos ratos que não podiam ser treinados para executar a tarefa, a falta de atendimento às pistas auditivas foi o principal fator. Em contraste, nos ratos que aprenderam a tarefa, uma pausa momentânea de comportamentos foi aparente durante a apresentação sinal sonoro (ver Figura 5A-b e Figura 3). Ao utilizar este sistema, é assim possível a ratos (i) de tela de "atenção defidéficits "e (ii) estudar mecanismos neurais da atenção quando combinado com gravações neuronais enquanto o animal está atendendo a sugestões dos ^8-10 auditivos.

(3). Decisão: Após o reconhecimento dos sinais auditivos, o animal tem que decidir em que direção voltar-se para abordar a alavanca correta dentro de uma janela de tempo limitado (Figura 5A-c). É, portanto, também um paradigma para o estudo eficaz de tomada de decisão ^11,12.

(4). Paciência: O momento da extensão da alavanca pode ser controlado de tal forma que o animal tem que esperar para a alavanca depois de chegar ao local onde a alavanca vai estender (Figura 5A-d). Ao variar o comprimento de esperar, a extensão da paciência de um animal pode ser testada e quantificados ^13.

(5). Prêmios: O objetivo final da tarefa é obter a recompensa (Figura 5A e-e Figura 3). Tarefas comportamentais que usam este sistema pode assimser facilmente projetados para estudar vários aspectos da recompensa tomada de questões ea função dos sistemas de valores do cérebro ^14-17.