В этом докладе мы описываем, как поверхностного плазменного резонанса используется для обнаружения токсина вступления в хост цитозоле. Этот высокочувствительный метод может обеспечить количественные данные о количестве цитозольного токсин, и он может быть применен к различным токсинам.
AB токсины состоят из ферментативной субъединицы и клетка-связывающий B субъединицы 1. Эти токсины секретируются во внеклеточную среду, но они действуют на цели в пределах эукариотической цитозоле. Некоторые туристические AB токсинов пузырьков носителей от поверхности клетки, чтобы эндоплазматический ретикулум (ER), перед входом в цитозоле 2-4. В ER, каталитический диссоциирует цепь от остальной токсина и движется через белок-проводящий канал, чтобы достичь своей целевой цитозольного 5. Перемещаться, цитозольного цепи трудно обнаружить, поскольку токсин торговли людьми ER является крайне неэффективный процесс: большинство внутренним токсин направляется лизосом для деградации, так что только небольшая часть поверхности связанного токсина достигает аппарат Гольджи и ОР 6 -12.
Для контроля перемещения токсинов из ЭР в цитозоле в культуре клеток, мы объединили субклеточных протокол фракционирования с highlу чувствительный метод обнаружения поверхностного плазменного резонанса (SPR) 13-15. Плазматической мембраны токсин-обработанных клеток избирательно проницаемыми с дигитонин, позволяя коллекция цитозольного фракцию, которая впоследствии перфузии за датчик SPR покрыты анти-токсин цепи антитела. Покрытых антителами датчик может захватить и выявления пг / мл количество цитозольного токсина. С этим протоколом, то можно проследить кинетику токсин вступления в цитозоле и охарактеризовать тормозящее действие на транслокацию события. Концентрация цитозольного токсин может быть вычислена по стандартной кривой, полученной с известными количествами цепочке стандартов, которые были перфузии по датчику. Наш метод представляет собой быстрый, чувствительный и количественного определения системы, которая не требует радиоактивной метки или другие изменения целевой токсин.
Сравнение с существующей методологии
Наши SPR основе анализа транслокации представляет быстрый, чувствительный и количественный метод для обнаружения токсина доставку в принимающее цитозоле. Техника не требует радиоактивной метки или другие изменения токсин, и он може?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась NIH грант R01 AI073783 К. Тетер. Мы благодарим доктора Шейна Massey за помощь в развитии субклеточного фракционирования протокол и Хелен Burress за критическое прочтение рукописи.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Digitonin | Sigma | D141 |
Ethanol | Acros | 61509-0010 |
DMEM | Invitrogen | 11995065 |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
Ganglioside GM1 | Sigma | G7641 |
CTA | Sigma | C2398 |
PTS1 | List | 182 |
NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce | 24500 |
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Scientific | 22981 |
Ethanolamine | Sigma | E0135 |
PBST | Medicago | 09-8903-100 |
Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotech | sc-80747 |
Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 |
Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-57639 |
Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC |
SPR sensor slides | Reichert | 13206060 |
Syringe pump | Cole Palmer | 780200C |