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Immunology and Infection

La détection des toxines translocation dans le cytosol hôte par résonance plasmonique de surface

Published: January 3, 2012 doi: 10.3791/3686
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Microbiology, University of Central Florida

Summary

Dans ce rapport, nous décrivons comment résonance plasmonique de surface est utilisé pour détecter l'entrée de toxine dans le cytosol hôte. Cette méthode très sensible peuvent fournir des données quantitatives sur la quantité de toxine cytosolique, et elle peut être appliquée à une gamme de toxines.

Abstract

Toxines AB se composent d'un sous-unité enzymatique Un cellulaire et d'une sous-contraignante B 1. Ces toxines sont sécrétées dans le milieu extracellulaire, mais ils agissent sur des cibles dans le cytosol des eucaryotes. Certains voyages AB toxines par les transporteurs vésiculaires de la surface cellulaire vers le réticulum endoplasmique (RE) avant d'entrer dans le cytosol 2-4. Dans l'urgence, le dissocie catalytique Une chaîne du reste de la toxine et se déplace à travers un canal protéique-conducteurs pour atteindre sa cible cytosolique 5. La translocation, cytosolique Une chaîne est difficile à détecter car le trafic de toxine à l'ER est un processus extrêmement inefficace: la toxine la plus intériorisé est acheminé vers les lysosomes de dégradation, alors seulement une petite fraction de la surface de la toxine liée atteint l'appareil de Golgi et ER 6 -12.

Pour surveiller la translocation de la toxine de ER dans le cytosol des cellules en culture, nous avons combiné un protocole avec le fractionnement subcellulaire highlméthode de détection sensible y résonance plasmonique de surface (SPR) 13-15. La membrane plasmique des cellules traitées toxine est sélectivement perméabilisées à la digitonine, permettant la collecte d'une fraction cytosolique qui est ensuite perfusé au cours d'un capteur SPR recouvert d'une anti-toxine un anticorps à chaîne. Le capteur revêtues d'anticorps peut capturer et détecter pg / mL quantités de toxines cytosolique. Avec ce protocole, il est possible de suivre la cinétique d'entrée de toxine dans le cytosol et de caractériser des effets inhibiteurs sur l'événement de translocation. La concentration de la toxine cytosolique peut également être calculé à partir d'une courbe standard générée avec des quantités connues d'une chaîne de normes qui ont été perfusés sur le capteur. Notre méthode représente un système rapide de détection sensible et quantitative qui ne nécessite pas de radiomarquage ou d'autres modifications à la toxine cible.

Protocol

1. Préparation de la digitonine

  1. Ajouter 500 ul d'éthanol à 100% à un microtube et le placer dans un bloc thermique fixée à 80 ° C pendant 10 min.
  2. Dissoudre 2,5 mg de digitonine dans 250 uL d'éthanol chauffé pour produire une solution stock de 1% de digitonine.
  3. Pour générer une solution de travail de digitonine 0,04%, ajouter 40 ul de la solution stock à 960 uL digitonine de HCN tampon (50 mM Hepes pH 7,5, NaCl 150 mM, 2 mM de CaCl2, 10 mM de N-éthylmaléimide, et un inhibiteur de protéase cocktail).

2. L'intoxication cellulaire et de perméabilisation

Notre test de translocation peut être appliquée à une gamme de toxines et de lignées cellulaires. Ci-dessous, nous fournissons un protocole détaillé pour la détection de la toxine cholérique (CT). Un aperçu de la procédure est prévue dans la figure 1.

  1. Des cellules HeLa sont ensemencées en plaques 6 puits contenant 1 ml de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal et les antibiotiques antimycosiquespour atteindre 1x10 6 cellules / puits, après une nuit d'incubation à 37 ° C. Pour générer assez de toxine cytosolique pour la détection reproductible, trois puits sont nécessaires pour chaque condition.
  2. Après une nuit d'incubation, de remplacer le milieu de culture avec 1 ml de DMEM contenant 100 ng / mL de GM1. Cela augmente le nombre de sites de liaison pour la TDM, comme le récepteur GM1 de la CT sera s'intercaler dans la membrane plasmique des cellules exposées à une solution de GM1.
  3. Après une incubation de 1 h à 37 ° C, éliminer le milieu GM1 contenant et laver les cellules deux fois avec du DMEM. Ensuite, placer les cellules à 4 ° C pendant 30 min dans 1 ml de DMEM contenant 1 ug / ml de CT.
  4. Retirez le support contenant la toxine, se laver les cellules deux fois avec du DMEM et incuber les cellules dans 1 ml de DMEM à 37 ° C pour l'intervalle de temps souhaité (s).
  5. A la fin de chaque période de chasse, laver les cellules avec du PBS et incuber chaque puits avec 250 uL d'EDTA 0,5 mM dans du PBS. Laissez reposer pendant 10 cellules min à température ambiante, puis les retirer de la plaque de 6 puits par trituration vigoureuse avec un P1000 Pipetman. Après un puits de cellules ont été recueillies, le combiner avec le deuxième puis troisième puits de la même condition. Grattoirs cellulaire peut également être utilisé pour collecter les cellules.
  6. Placer la suspension cellulaire combinée des trois puits de reproduire (750 uL du volume total) dans un microtube unique, et la faire tourner dans une microcentrifugeuse de table pendant 5 min à 5000 x g. Les culots cellulaires de taille à peu près équivalente devrait être obtenue pour toutes les conditions.
  7. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 100 ul de la solution de 0,04% de travail de digitonine. Placer la suspension cellulaire sur la glace pendant 10 min.
  8. Spin cellules perméabilisées digitonine à 16.000 xg pendant 10 min dans une microcentrifugeuse de table. Transférer la fraction cytosolique contenant le surnageant dans un microtube frais, et de conserver la fraction organite contenant de granules.
titre "> 3. Préparation des échantillons

  1. Cytosol fractions contenant le surnageant sont dilués dans un tampon de HCN à un volume final de 1 ml. Volumes d'échantillon d'au moins 1 ml sont nécessaires pour assurer de l'air est purgé de la boucle de 500 échantillons uL avant l'injection.
  2. Organite fractions contenant granulés sont remises en suspension dans 1 ml de tampon contenant 1% de HCN Triton X-100. Ajout de détergent est nécessaire pour libérer la piscine membrane encastrée de la toxine.
  3. Normes toxines à des concentrations de 100, 10, 1 et 0,1 ng / mL sont préparées dans un tampon de HCN.
  4. Séries parallèles des fractions cytosoliques et des organites sont préparés pour une expérience de contrôle pour confirmer la fidélité de la procédure de fractionnement. Les fractions générée comme décrit dans la section 2 sont remis en suspension dans 20 pl de tampon d'échantillon 4x (fraction cytosolique) ou 120 pi de tampon d'échantillon 1x (fraction organite). Volumes équivalents de chaque fraction sont résolus par électrophorèse sur gel de sulfate de sodium dodécyl polyacrylamide et sondé bl'analyse par Western blot y démontrer le partitionnement d'une protéine cytosolique dans la fraction surnageante et solubles, des protéines résidentes ER dans la fraction granulés 16-19.

4. Préparation des lames de SPR

  1. La SPR Reichert SR7000 Réfractomètre est utilisé pour des expériences de SPR.
  2. Régler une lame de verre plaqué or avec une monocouche auto-assemblée dans l'instrument de SPR. Pour activer le capteur de glissière, perfuser de 1:1 (v: v) solution de 0,4 M d'EDC et 0,1 M NHS sur la lame pendant 10 min à un débit de 41 ul / min. Tous les perfusions ultérieures utiliseront le même débit.
  3. Pour enlever la SEE: tampon d'activation du NHS, laver la plaque pendant 5 min avec du PBS contenant 0,05% de Tween 20 (PBST). La plaque contient maintenant longes amide réactive due à désoperculer par la SEE: solution de NHS.
  4. Perfuser un anticorps anti-CTA sur la lame du capteur activé à une dilution de 1:20,000 dans 20 mM acétate de sodium (pH 5,5) pendant 15 min. Une chute initiale de la réfraction dansdex unité (RIU) seront vus en raison du changement de pH. Cette étape sera suivie par une augmentation de la RIU que l'anticorps est capturé par les longes amide-réactive sur la lame du capteur.
  5. Retirer les anticorps non liés de la diapositive du capteur avec un lavage PBST 5 minutes. Le signal produit par RIU l'anticorps capturée plateau et se stabiliser, fournissant un signal de base de nouvelles.
  6. Perfuser 1 M éthanolamine (pH 8,5) sur la lame du capteur pendant 5 min. Cette casquettes et inactive les attaches non liée à gauche sur la diapositive capteur.

5. L'analyse d'échantillons de SPR

  1. Pour établir une lecture de base, PBST perfuser sur le capteur revêtues d'anticorps pendant 5 min.
  2. Perfuser un échantillon expérimental ou standard toxine sur le capteur pour 300 sec. Retirez le ligand de la mémoire tampon et de PBST perfuser sur le capteur pour un autre sec 200.
  3. Après chaque perfusion, la toxine liée est retiré de la sonde par un lavage avec PBST 100 sec à pH 5,0. Ce sera de retour le signalà sa lecture initiale de référence, permettant ainsi à un autre échantillon d'être traitées sur le même capteur.
  4. Avant de charger un nouvel échantillon, pousser une petite quantité d'air à travers la boucle d'échantillonnage d'expulser tout liquide résiduel provenant de l'échantillon précédent. En utilisant la procédure décrite dans 5.2 à 5.4, nous avons exécuté jusqu'à 12 échantillons sur une lame sans perte substantielle du signal de référence.
  5. L'analyse des données est réalisée avec le laveur deux logiciels, et le logiciel Igor est utilisé pour la préparation des figures.

6. Les résultats représentatifs

La toxine de pertussis (PT) est une toxine AB qui se déplace de la surface des cellules à l'urgence avant son d'une chaîne (PTS1) pénètre dans le cytosol 3, 12. Comme le montre la figure 2, notre test de translocation SPR basé pouvait détecter PTS1 dans le cytosol des cellules CHO ébriété. Aucun signal n'a été généré à partir du cytosol des cellules unintoxicated, qui a confirmé l'anticorps anti-PTS1 n'a pas de réaction croisée avec une composante du cytosol hôte. L'fraction cytosolique des cellules d'ébriété dans la présence de bréfeldine A (BfA) a également échoué à produire un signal positif. BfA empêche le transport de toxines au site de translocation ER 6-8, 12, 20-25 et, par conséquent, une livraison de la chaîne vers le cytosol. A la fin de chaque cycle, la toxine liée est dépouillé de la diapositive du capteur. Cette échantillons a permis plusieurs à être projeté sur une lame de capteur unique et ainsi fourni une comparaison directe entre les résultats obtenus avec différentes conditions expérimentales.

CT est un autre type AB, ER-translocation de toxine 4. Dans la figure 3A, CTA1 a été détecté dans la fraction cytosolique de cellules HeLa CT-traitée. Cette souligner que notre méthodologie fonctionne avec plusieurs types de cellules et peut être appliquée à toute toxine pour laquelle un anticorps anti-A anticorps à chaîne est disponible. Aucun signal n'a été détecté lors de la fraction cytosolique de CT-cellules traitées a été perfusé au cours d'un capteur SPR recouvert d'un anticorps anti-CTB (figure 3B), démontrant ainsi que le CTA1sous-unité, mais pas la cellule contraignant CTB pentamère entre dans le cytosol. La figure 3C montre le signal de la fraction organelle est hors échelle en comparaison à la faiblesse du signal de la fraction cytosolique. Cela était conforme à l'inefficacité connue de CT transport vers le site de translocation ER 6, 7, ce qui limite la quantité de toxine qui peut atteindre le cytosol. Par ailleurs, la fraction organite contient holotoxine CT ainsi que ER-localisées CTA1, de sorte que le signal résultant de SPR pour la fraction organite est gonflé par la masse supplémentaire de l'holotoxine pentamère CTB-associés. Ainsi, il n'est pas pratique pour tracer des données à partir des fractions organite et cytosoliques sur la sensorgramme mêmes.

Notre test peut surveiller l'accumulation dépendant du temps de translocation, la toxine cytosolique (figure 4). Les cellules ont été exposées à CT à 4 ° C, une température qui permet liaison de la toxine à la membrane plasmique, mais empêche l'internalisation de la toxine associée aux cellules. Après le remoVal de toxine non consolidées, les cellules ont été réchauffée à 37 ° C. Les deux toxines de transport à l'urgence et une translocation de la chaîne vers le cytosol peut se produire à cette température. Aucune toxine n'a été détectée dans le cytosol 15 minutes après l'échauffement à 37 ° C. Cela reflète le décalage requis pour le trafic holotoxine (i) à l'ER, (ii) Un / dissociation sous-unité B de l'ER, et (iii) Une chaîne de l'exportation vers le cytosol. Une piscine de toxine mineure cytosolique a été détectée après 30 minutes à 37 ° C, et les quantités progressivement plus de toxine cytosolique ont été détectés après le 45 et 60 intervalles minute chase. Même des niveaux plus de toxine cytosolique ont été détectés après un intervalle de 5 heures 17 chase, démontrant ainsi une constante, à long terme la livraison de toxine associée aux cellules vers le cytosol hôte.

Notre test peut également détecter l'inhibition de la translocation de la toxine dans le cytosol (Fig. 5). Les cellules traitées avec du diméthylsulfoxyde 10% (DMSO), un chaperon chimique qui empêche le Disord thermiquesEring de l'isolement CTA1 sous-unité (T. Banerjee et K. Teter, observations non publiées), présentaient de faibles niveaux de CTA1 cytosolique en comparaison aux cellules témoins non traitées. Déroulement de la toxine Une chaîne est une condition préalable pour la translocation vers le cytosol 16-18, afin de stabiliser le DMSO-induite de CTA1 conséquence empêché son mouvement à partir du RE vers le cytosol.

L'association constante de vitesse (k a) calculée à partir des expériences SPR est directement proportionnelle à la concentration de ligand dans le tampon de perfusion 14, 15, 26. Ainsi, il est possible de déterminer la concentration cytosolique de la toxine à partir d'un graphe qui trace les valeurs de k une toxine comme les normes en fonction de la concentration des toxines. Cette procédure a été utilisée pour quantifier le bloc DMSO induit la translocation de la toxine présenté dans la Figure 5: la courbe standard générée à partir des concentrations connues de toxine a été utilisée pour calculer un cytosolique CTA1 CONCENTRATion de 0,3 ng / ml pour les cellules non traitées et 0,1 ng / mL pour le DMSO cellules traitées (Fig. 6). L'inhibition de la CTA1 déroulement par le DMSO ainsi généré une réduction de 3 fois dans la translocation ER-à-cytosol des CTA1.

Figure 1
Figure 1. Aperçu Protocole. (A) Les cellules sont incubées avec de la toxine AB à 4 ° C, une température qui permet liaison de la toxine à la surface cellulaire, mais empêche l'endocytose toxine. Les sous-unités A et B de la toxine sont représentés par des cercles rouges et bleus, respectivement. (B) de toxine non lié est éliminé du milieu, et les cellules sont chauffées à 37 ° C afin de promouvoir endocytose et le transport rétrograde de l'holotoxine à l'urgence. Holotoxine de dissociation se produit dans l'urgence, qui permet l'isolement Une chaîne pour entrer dans le cytosol en passant à travers un canal protéique conducteur (s) dans la membrane du RE. (C) Les cellules sont traitées avec de la digitonine, afin de perméabiliser de façon sélective le plasmamembrane. (D) La centrifugation est utilisée pour les cellules dans une partition séparée des fractions cytosoliques et des organites. Le cytosol est évincé de la cellule par les pores digitonine-générée et est situé dans le surnageant. Le intacte, liée à la membrane des organites se trouvent dans la fraction de granules. (E) Pour détecter la piscine translocation de la toxine Une chaîne dans le cytosol hôte, la fraction surnageante est perfusé au cours d'un capteur SPR recouvert d'un anticorps anti-A anticorps à chaîne.

Figure 2
Figure 2. Détection de PTS1 translocation dans le cytosol hôte. Les cellules CHO ont été étiquetés par impulsions à 4 ° C pendant 30 min avec 1 ug / ml de PT. Les cellules ont ensuite été pourchassé pendant 3 heures à 37 ° C dans un milieu exempt de toxines contenant aucun ajout (ivresse) ou 5 ug BfA / mL (+ BfA intoxiqué). Perméabilisation de la membrane plasmique à la digitonine a été utilisé pour des extraits de cellules séparées partition en organite et cytosoliques fractions. Un capteur SPR recouvert d'un anticorps anti-PTS1 a été utilisé pour détecter la piscine cytosolique de PTS1 partir de cellules non traitées ou traitées BfA. PTS1 normes ont été perfusés sur le capteur comme contrôles positifs, tandis que la fraction cytosolique des cellules unintoxicated a été perfusé sur la lame du capteur comme un contrôle négatif. A la fin de chaque cycle, l'échantillon a été dépouillé liés partir de la diapositive du capteur.

Figure 3
Figure 3. Détection de CTA1 translocation dans le cytosol hôte. Des cellules HeLa impulsions marquées à 4 ° C avec 1 ug / ml de CT ont été chassés pendant 2 heures à 37 ° C dans un milieu exempt de toxines contenant aucun ajout (ivresse) ou 5 ug BfA / mL (+ BfA intoxiqué). Perméabilisation de la membrane plasmique à la digitonine a été utilisé pour des extraits de cellules séparées partition en organite et les fractions cytosoliques. (A) Les fractions cytosoliques ont été perfusés au cours d'un capteur SPR recouvert d'un anticorps anti-CTA. Connuquantités de LTC ont été utilisés comme contrôles positifs, tandis que le cytosol des cellules unintoxicated a été utilisé comme contrôle négatif. (B) la fraction cytosolique des cellules ébriété en l'absence de BFA a été perfusé au cours d'un capteur SPR recouvert d'un anticorps anti-CTB. A purifié CTB pentamère a été perfusé sur la lame comme un contrôle positif. (C) La fraction organite a été solubilisé avec 1% de Triton X-100 avant la perfusion sur un capteur SPR recouvert d'un anticorps anti-CTA. Pour fins de comparaison, la fraction cytosolique (1 ml de volume final) de l'extrait même cellule et un standard du CTA ont également été perfusé sur le capteur. Pour tous les panneaux, l'échantillon a été dépouillé liée à partir du capteur à la fin de chaque course.

Figure 4
Figure 4. Cinétique de CTA1 entrée dans le cytosol. Des cellules HeLa impulsions marquées à 4 ° C avec 1 ug / ml de CT ont été chassés pour 15, 30, 45 ou 60 min à 37 ° C de la toxine sans Medium. Pour détecter la piscine translocation de la toxine, fractions cytosoliques des cellules perméabilisées digitonine ont été perfusés au cours d'un capteur SPR recouvert d'un anticorps anti-CTA. Normes du CTA ont été perfusés sur le capteur ainsi. A la fin de chaque cycle, l'échantillon a été dépouillé liés partir de la diapositive du capteur.

Figure 5
Figure 5. Inhibition de CTA1 translocation par le DMSO. Des cellules HeLa impulsions marquées à 4 ° C avec 1 ug / ml de CT ont été chassés pendant 2 heures à 37 ° C dans un milieu exempt de toxines contenant aucun ajout (ivresse) ou 10% de DMSO (+ DMSO intoxiqué). Pour détecter la piscine translocation de la toxine, fractions cytosoliques des cellules perméabilisées digitonine ont été perfusés au cours d'un capteur SPR recouvert d'un anticorps anti-CTA. Normes du CTA (100, 10, 1 et 0,1 ng / mL) ont été perfusés sur le capteur comme contrôles positifs, seul le 1 et 0,1 ng / mL normes sont indiquées à des fins de mise à l'échelle. Le cytosol à partir unintoxicatecellules D a été utilisé comme contrôle négatif. A la fin de chaque cycle, l'échantillon a été dépouillé liés partir de la diapositive du capteur.

Figure 6
Figure 6. Calcul de CTA1 cytosolique. K une des valeurs pour les normes du CTA de la figure 5 ont été tracées en fonction de la concentration de toxine. La courbe ainsi obtenue standard a été utilisé pour déterminer, sur la base des valeurs de k une des échantillons expérimentaux de la figure 5, la concentration de CTA1 cytosolique dans les cellules non traitées et traitées DMSO. Normes toxines sont présentés comme des cercles remplis; le cytosol non traité est présenté comme une place ouverte, et le cytosol DMSO-traité est présenté comme un cercle ouvert. Les moyennes ± gammes de deux expériences indépendantes sont présentés.

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Discussion

Comparaison à la méthodologie existante

Notre test de translocation SPR à base représente une méthode rapide, sensible, et quantitatives pour détecter administration de la toxine dans le cytosol hôte. La technique ne nécessite pas de radiomarquage ou d'autres modifications à la toxine, et il peut être appliqué à toute toxine pour lequel un anti-toxine A anticorps à chaîne est disponible. Les méthodes existantes pour surveiller le passage de toxines dans le cytosol se fondent également sur ​​un protocole de fractionnement subcellulaire d'extraits cellulaires partition dans le cytosol séparée et fractions membranaires 11, 23, 27, 28. Ces méthodes utilisent Western blot ou radiomarqueurs pour détecter la piscine cytosolique de la toxine. La première approche est semi-quantitative, au mieux, et souffre d'une sensibilité relativement pauvres. Même les protocoles de radiomarquage peut prendre des semaines pour produire un résultat, en raison des faibles niveaux de toxine qui atteignent le cytosol. Alors que l'analyse quantitative avec une toxine radiomarquée peut déterminer le pourcentage relatifdes cellules associées toxine qui pénètre dans le cytosol, cette approche ne peut pas déterminer directement le nombre exact de molécules de toxine cytosolique. En comparant la sensibilité de détection des toxines SPR à la détection de la toxine radiomarquée est donc problématique, car la quantité de toxine cytosolique peut être calculée par SPR, mais pas par radiomarquage.

Dosages translocation Autres contourner les étapes en amont le trafic de toxines et de livrer la toxine Une chaîne directement à l'ER en utilisant soit des systèmes d'expression à base de plasmide ou in vitro de transcription / systèmes de traduction 29-38. Pour que soit la méthode, une séquence signal amino-terminale des objectifs de la chaîne A de co-traductionnelle importer dans la lumière du RE. Exportation de l'synthétisé Une chaîne de l'ER est alors détectée par fractionnement subcellulaire, centrifugation différentielle, activité de la toxine dans le cytosol, dégradation par le protéasome de la toxine translocation, et / ou une modification de toxine cytosolique spécifique. Sous-ensembles de ces approches pourUC uniquement sur l'événement de translocation, peut être utilisé pour des expériences de reconstitution in vitro, et de produire des niveaux élevés de toxines de détection et de co-immunoprécipitation études. Toutefois, les méthodologies ne peuvent pas déterminer la cinétique ou l'efficacité de la livraison de toxines de la surface cellulaire vers le cytosol. Il est également possible que la translocation de la chaîne A ne pas entrer dans la salle d'urgence dans le même état conformationnel que l'holotoxine-livré une chaîne. D'autres aspects de l'hôte-toxine interactions sont absents de ces procédures, telles que l'événement A / B dissociation. Ainsi, il ya deux forces et les faiblesses de la translocation de surveillance avec une des chaînes qui sont synthétisés directement dans le RE.

Translocation toxines est souvent détecté par des tests d'intoxication. L'effet cytotoxique ou cytopathique généré par la toxine appliquée de manière exogène démontre la toxine A de la chaîne a atteint sa cible cytosolique. Évidemment, il s'agit d'une mesure indirecte de la translocation de la toxine qui surveille unectivité dans le cytosol, plutôt que la présence physique de la toxine cytosolique. Ainsi, la technique ne peut ni quantifier les niveaux de toxine cytosolique, ni de détecter directement le traitement de la toxine modifiée translocation. Il ya aussi des scénarios dans lesquels une corrélation directe entre les niveaux de toxines et d'activité de la toxine cytosolique n'existent pas, telles que la nécessité éventuelle d'un seuil de concentration de la toxine cytosolique à induire une réponse cellulaire ou lorsque l'activité de toxine produit une réponse saturées cellulaire. Pourtant, les tests d'intoxication peuvent fournir une corrélation fonctionnelle à des dosages qui sont directement documenter l'événement de translocation. Nous avons déjà utilisé cette stratégie pour démontrer une inhibition d'une translocation de la chaîne correspond à une inhibition de l'intoxication cellulaire 17-19.

En résumé, il existe plusieurs méthodes pour détecter les toxines de livraison vers le cytosol. Notre approche basée sur les SPR a l'avantage de fournir des résultats rapides, sensibles et quantitatives. Le dATA peut également être complétée par des expériences utilisant l'une des stratégies mentionnées plus à générer une forte conclusion.

Les applications futures

Notre méthode sans étiquette pour la détection et la quantification de la toxine cytosolique fournit aux enquêteurs la souplesse nécessaire pour répondre à bon nombre des questions en suspens concernant la biologie cellulaire de l'intoxication. Par exemple, il est possible d'établir l'efficacité d'une livraison de la chaîne vers le cytosol en calculant le pourcentage de surface liée à la toxine qui atteint le cytosol. Il est également possible de quantifier le montant total de la toxine cytosolique et, par extension, le nombre de molécules de toxine cytosolique par cellule. On croit que d'une molécule de la toxine diphtérique cytosolique est suffisante pour déclencher une cytopathique complet / cytotoxiques effet 39; ce modèle peut désormais être testée avec d'autres toxines à l'aide de notre test de translocation et des dosages d'intoxication corrélatifs. Ainsi, notre SPR essai basé sur shoULD être en mesure de déterminer combien de molécules de toxine cytosolique sont requis pour une intoxication productif. Notre technique permet également de suivre la persistance de la toxine cytosolique. La dégradation substantielle de la translocation Une chaîne serait de limiter, voire réduire sa concentration cytosolique au fil du temps, ce qui impliquerait les effets de l'intoxication pourrait être inversée si l'accès de la chaîne A vers le cytosol a été restreinte après l'exposition à la toxine initiale. Par ailleurs, le milieu extracellulaire et la membrane des cellules granulés intoxiquée peut être utilisé pour suivre la quantité de toxine sécrétée ou d'une toxine qui résident dans le système endomembranaire, respectivement. Des études comparatives de extracellulaires, toxine endomembranaire-localisées, et cytosoliques peuvent être utilisées pour examiner comment la biologie cellulaire de l'intoxication varie pour les différents ER-translocation des toxines. Notre test peut également être utilisé pour disséquer les facteurs de toxine cellulaire spécifique nécessaire pour l'événement 19 translocation. Il devrait être possible d'adapter notre méthodologie à suivrela translocation endosome-à-cytosol des toxines AB d'autres tels que le facteur mortel d'anthrax et la toxine diphtérique. Enfin, l'entrée virale dans le cytosol hôte pourrait éventuellement être surveillées avec une procédure similaire expérimental.

Limitations

Conditions qui empêchent le trafic de toxine à l'urgence sera également empêcher la livraison de toxine dans le cytosol. Cela a été démontré par l'absence de toxine dans le cytosol des cellules traitées au BfA (fig. 2, 3A). Ainsi, des expériences de contrôle supplémentaires sont nécessaires lorsque vous utilisez cette méthode pour examiner le potentiel des blocs de la translocation de la toxine. Pour certaines toxines AB, la réduction d'un pont disulfure qui longes les sous-unité catalytique de ses holotoxine se produit dans la ER 6, 40-43. L'état d'oxydoréduction de la chaîne A peut donc être utilisé comme une mesure du transport de la toxine à l'ER 16, 18. Toxines recombinants contenant la séquence consensus pour la N-glycosylation, une modification qui est initié à l'urgence, ont également étéutilisé pour détecter l'entrée de la toxine dans ER 12, 23, 44-46. Enfin, comme discuté ci-dessus, les protocoles alternatifs impliquant l'insertion co-traductionnelle de la toxine A de chaîne dans la lumière du RE peut vérifier un effet inhibiteur sur l'événement de translocation. Par exemple, notre test de translocation SPR basé démontré un rôle fonctionnel pour Hsp90 dans CTA1 translocation qui a été confirmé par un système à base de plasmide qui exprime CTA1 directement dans la lumière du RE 19.

Les chaînes A de ER-translocation des toxines présentent une forte arginine-sur-lysine biais d'acide aminé qui permet la toxine translocation d'échapper à l'ubiquitine-dépendante dégradation par le protéasome 47-50. Cependant, la dégradation de la toxine cytosolique persiste par une relativement lente, l'ubiquitine protéasome mécanisme indépendant 51, 52. Conditions qui favorisent l'activité du protéasome pourrait ainsi fausser les résultats de notre test de translocation en réduisant la piscine de la toxine dans la translocation cytosolique fraction. Les cellules exposées à un inhibiteur du protéasome peut être utilisé pour le contrôle de cette possibilité; une augmentation de la toxine cytosolique résultant de l'inhibition du protéasome semble indiquer la toxine pourrait en effet atteindre le cytosol, mais a été dégradée avant la détection.

Il convient de noter que ces considérations s'appliquent aux sous-ensembles des approches alternatives susmentionnées et ne sont pas uniques à notre méthode. Comme mentionné précédemment, la meilleure stratégie pour caractériser l'événement de translocation est d'utiliser une combinaison de techniques bien maîtrisées.

Les étapes critiques et le dépannage

Préparation chimique est une étape critique pour le dosage. Digitonine ne se dissout pas facilement, et il doit être préparé pour chaque expérience. De même, PBST frais doivent être utilisés pour l'analyse SPR. La SEE: tampon d'activation du NHS doit être préparée immédiatement avant utilisation, il ne sera pas conserver l'activité s'il est conservé après le mélange des deux solutions. Uter, aliquotes séparées d'EDC et NHS peuvent être stockés à -80 ° C et décongelés une fois avant utilisation. Toutes les solutions, y compris les échantillons, doivent être dégazés avant l'injection. Cela permettra d'éviter l'air induite par les pics dans le signal SPR.

Le type de cellules à utiliser pour ce dosage doit exprimer des récepteurs de toxine suffisante pour permettre une piscine détectable de toxine Une chaîne pour atteindre le cytosol. Dans certains cas, comme le pré-traitement des cellules HeLa avec GM1 avant l'épreuve CT, les récepteurs de toxines supplémentaires peuvent être ajoutés à la surface des cellules cibles. Le type de cellule doit également être sensibles à perméabilisation sélective de la membrane plasmique à la digitonine. Le protocole décrit aux présentes est efficace avec HeLa et les cellules CHO, mais d'autres types cellulaires, il faudra une étape d'optimisation en utilisant une analyse par Western blot pour surveiller la séparation nette des organites et des fractions cytosoliques. Nous avons régulièrement suivi les distributions d'une protéine disulfure isomérase (une protéine soluble ER) et Hsp90 (une prote cytosoliquein) pour ce 16-19 effet. Le partitionnement exclusive de protéine disulfure isomérase dans la fraction 16-19 granulés assure également que les organites recueillis dans le culot de membranes sont intactes. Ceci est un aspect crucial de notre méthode, comme la rupture accidentelle d'organites intracellulaires serait introduire une erreur dans le système en libérant endomembranaire-restricted toxine dans la fraction cytosolique. SPR basé sur les expériences peuvent aussi être utilisées pour démontrer que la piscine cytosolique des résultats de toxine d'un événement plutôt que la translocation de la lyse des organites intracellulaires. Par exemple, aucune toxine n'a été détectée dans le cytosol des cellules traitées BfA (fig. 2, 3A) ou de cellules exposées à la toxine pendant seulement 15 minutes (fig. 4). De même, la sous-unité B de la CT n'a pas été détecté dans la fraction cytosolique après une exposition à la toxine deux heures (figure 3B). Si notre protocole a abouti à la perméabilisation des membranes internes, nous avons détecté une piscine cytosolique de la toxine pour chacun des AFOREconditions mentionnées. Etablir le protocole approprié pour reproductibles, perméabilisation sélective de la membrane plasmique est susceptible de représenter l'étape limitante pour la mise en œuvre du dosage. D'autres options de perméabilisation de la membrane plasmatique sont disponibles, mais nous avons constaté que le traitement digitonine fourni des résultats plus cohérents que d'autres méthodes telles que le traitement avec streptolysine O.

La qualité de l'anticorps va aussi déterminer la sensibilité du dosage, qui peut être établi avec des dilutions en série d'une norme toxine. Par exemple, nous pouvons reproductible détecter aussi peu que 0,1 ng / ml soit PTS1 ou CTA standard (fig. 2-6). Les anti-A anticorps à chaîne ne devrait pas reconnaître la sous-unité B de la toxine, et les cellules unintoxicated doit toujours être utilisé comme un contrôle pour s'assurer de l'anticorps n'a pas de réaction croisée avec des protéines dans la cellule hôte. Des expériences préliminaires auront besoin pour optimiser les conditions de décapage toxine liée par l'anticorps, car cela peut varierpour les différents anticorps anti-toxine.

Lors de la surveillance de translocation de toxine dans des conditions cellulaires modifiées, les normes et les toxines fraction cytosolique des cellules témoins non traitées doivent être complétées en fonction des conditions de l'échantillon expérimental. Par exemple, les normes de l'OTC et la fraction cytosolique non traitée de la figure 5 ont été complétées par 1% de DMSO pour correspondre à la concentration du médicament final dans la fraction cytosolique du DMSO cellules traitées. Ceci élimine les différences possibles dans les signaux SPR qui pourraient résulter de différences dans la composition chimique des fractions collectées. Les comparaisons entre les fractions cytosoliques et organite serait également nécessiter l'ajout de 1% de Triton X-100 à la fraction cytosolique et des normes, comme ce détergent est utilisé pour libérer la toxine à la membrane encastrée partir de la fraction organite pour la détection SPR. Des expériences préliminaires ont montré la présence de cytosol ne modifie pas la réponse SPR aux normes toxine,il n'est donc pas nécessaire de compléter les normes toxine avec le cytosol des cellules unintoxicated.

Fixation des anticorps à la diapositive capteur ne va pas se produire si la SEE: solution d'activation du NHS est ancienne ou si la lame est insérée dans l'appareil avec la face latérale d'or vers le bas. Étant donné le processus de fabrication, il y aura une certaine variabilité plaque-plaque qui peut prévenir bon EDC: l'activation du NHS et, par conséquent, la capture d'anticorps. Si des anticorps se liant à la diapositive est pauvre, comme indiqué par un RIU faiblement élevée, une deuxième injection peut déposer plus de l'anticorps sur la plaque. Le RIU est une unité arbitraire qui varie d'une expérience à une autre en fonction de combien d'anticorps anti-toxine est déposé sur le capteur. Cependant, les taux sur et hors restera constante.

Il est préférable d'utiliser un réfractomètre avec deux chambres de perfusion canal, comme un canal peut être utilisé pour l'échantillon expérimental et l'autre canal peut être utilisé pour le tampon aloNE afin de corriger la dérive de base possibles. Lorsque vous utilisez un instrument à double chambre, s'assurer que les anticorps anti-toxine est seulement ajouté à l'un des deux canaux. Les échantillons seront ensuite parcourent les deux canaux. Avec un instrument seul canal, la compensation de la dérive de base consiste à recueillir des données de tampon seul la lame revêtue d'anticorps avant injection de l'échantillon.

Avant le début d'une expérience SPR, d'assurer la diapositive du capteur est fixé serré dans l'instrument et tous les raccords sont bien fixés. Les fuites résultant de ces problèmes va générer des pics de l'air dans les données recueillies. Les fuites peuvent également être détectés par l'absence de flux de déchets, qui doivent toujours être présents. Un volume d'échantillon plus grand que le volume de la boucle d'injection est nécessaire pour éviter les pics de l'air ainsi - par exemple, nous utilisons une volumes d'échantillons mL avec une boucle d'injection 500 uL. Un montant approprié de l'huile d'immersion sur le prisme de prévenir la stabilisation de la base Signal. Autres questions relatives au fonctionnement de l'instrument SPR sont abordés dans le Guide de l'utilisateur et des bulletins techniques fournies par Reichert.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par NIH R01 AI073783 à K. Teter. Nous remercions le Dr Shane Massey pour l'aide au développement de l'fractionnement subcellulaire protocole et Helen Burress pour la lecture critique du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digitonin Sigma-Aldrich D141
Ethanol Acros Organics 61509-0010
DMEM Invitrogen 11995065
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Ganglioside GM1 Sigma-Aldrich G7641
CTA Sigma-Aldrich C2398
PTS1 List 182
NHS (N-Hydroxysuccinimide) Pierce, Thermo Scientific 24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) Thermo Fisher Scientific, Inc. 22981
Ethanolamine Sigma-Aldrich E0135
PBST Medicago 09-8903-100
Anti-CTA antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-80747
Anti-CTB antibody Calbiochem 227040
Anti-PTS1 antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-57639
Refractometer Reichert SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides Reichert 13206060
Syringe pump Cole-Parmer 780200C

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La détection des toxines translocation dans le cytosol hôte par résonance plasmonique de surface
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