Summary
I denne rapport beskriver vi, hvordan overfladen plasmon resonans bruges til at påvise toksinet indrejse i værten cytosol. Denne meget følsom metode kan give kvantitative data om mængden af cytosole toksin, og det kan anvendes til en række af toksiner.
Abstract
AB toksiner består af en enzymatisk A subunit og en celle-bindende B subunit 1. Disse giftstoffer udskilles i det ekstracellulære miljø, men de handler på mål inden for eukaryote cytosolen. Nogle AB toksiner rejse med Blære luftfartsselskaber fra cellens overflade til det endoplasmatiske reticulum (ER), inden de kommer ind i cytosolen 2-4. I ER, at den katalytiske En kæde dissocieres fra resten af toksinet og bevæger sig igennem en protein-ledende kanal nå sit cytosolisk mål 5. De omplantes, cytosole En kæde er svær at opdage, fordi toksin menneskehandel til skadestuen er en yderst ineffektiv proces: De fleste internaliserede toksin er dirigeres til lysosomerne for nedbrydning, så kun en lille brøkdel af overflade-bundet toksin når Golgi apparatet og ER 6 -12.
At overvåge toksin translokation fra ER til cytosolen i dyrkede celler, vi kombinerede en subcellulære fraktioner protokol med highly følsom påvisningsmetode af overflade plasmon resonans (SPR) 13-15. Plasma membran af toksin-behandlede celler er selektivt permeabilized med digitonin, så samling af et cytosol fraktion, som efterfølgende perfunderet over en SPR sensor belagt med et anti-toksin A kæde antistof. Den antistof-belagt sensor kan fange og afsløre pg / mL mængder af cytosolisk toksin. Med denne protokol, er det muligt at følge kinetikken af toksin indtræden i cytosolen og at beskrive hæmmende på translokation begivenhed. Koncentrationen af cytosole toksin kan også beregnes ud fra en standardkurve genereret med kendte mængder af en kæde standarder, der er blevet perfunderet over sensoren. Vores metode er en hurtig, følsom, og kvantitative detektion system, der ikke kræver radioaktiv mærkning eller andre ændringer til målet toksin.
Protocol
1. Udarbejdelse af digitonin
- Tilsæt 500 μL af 100% ethanol til et mikrocentrifugerør og læg den i en varmeblok indstillet til 80 ° C i 10 min.
- Opløs 2,5 mg digitonin i 250 μL af den opvarmede ethanol til at producere en 1% stamopløsning af digitonin.
- For at generere en arbejdsgruppe løsning på 0,04% digitonin, der tilsættes 40 μL af digitonin stamopløsning til 960 μL af HCN buffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-ethylmaleimide, og en proteasehæmmer cocktail).
2. Cell beruselse og permeabilization
Vores translokation analyse kan anvendes til en række toksiner og cellelinjer. Nedenfor giver vi en detaljeret protokol til påvisning af kolera toksin (CT). En oversigt over proceduren er fastsat i figur 1.
- HeLa celler er seedet i 6-godt plader indeholdende 1 mL DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika-antimykotikumat opnå 1x10 6 celler / hul efter en nats inkubation ved 37 ° C. For at generere nok cytosole toksin til reproducerbar påvisning, er tredobbelt brønde kræves for hver tilstand.
- Efter en overnatning inkubation, dyrkningsmediet erstatte med 1 mL DMEM indeholdende 100 ng / ml gangliosid GM1. Dette øger antallet af bindingssteder for CT, som GM1 receptor af CT vil intercalate i plasma membran af celler, der udsættes for en opløsning af GM1.
- Efter en 1 time inkubation ved 37 ° C, skal du fjerne GM1-holdigt medium og vaskes cellerne to gange med DMEM. Derefter placere cellerne ved 4 ° C i 30 min i 1 mL DMEM indeholdende 1 mg / ml CT.
- Fjern toksin-holdige medium, vaskes cellerne to gange med DMEM, og inkuber cellerne i 1 ml DMEM ved 37 ° C i den ønskede tidsinterval (s).
- Ved afslutningen af hver Chase periode, Vask cellerne med PBS og inkuber hver brønd med 250 μL på 0,5 mM EDTA i PBS. Lad cellerne sidde i 10 min ved stuetemperatur og derefter fjerne dem fra 6-brønds plade ved kraftig trituration med en P1000 pipetman. Efter en godt af celler er blevet indsamlet, kombinere det med den anden og derefter third godt fra den samme tilstand. Cell skrabere kan også bruges til at indsamle cellerne.
- Placer den kombinerede cellesuspensionen fra de tre replikate brønde (750 μL samlede volumen) i en enkelt mikrocentrifugerør, og spin i en bordplade mikrocentrifuge i 5 minutter ved 5.000 x g. Cell pellets af nogenlunde tilsvarende størrelse skal opnås for alle forhold.
- Supernatanten fjernes, og resuspender cellepelleten i 100 μL af 0,04% brugsopløsning af digitonin. Placer cellesuspensionen på is i 10 min.
- Spin digitonin-permeabilized celler ved 16.000 xg i 10 min i en bordplade mikrocentrifuge. Overfør cytosolen-holdige supernatant fraktion til en frisk mikrocentrifugerør, og fastholde de organel-holdige pellet fraktion.
- Cytosolen-holdige supernatant fraktioner er fortyndet med HCN buffer til et endeligt volumen på 1 ml. Prøvevolumener på mindst 1 mL er nødvendige for at sikre luft er udrenset fra de 500 μL prøve løkken før injektion.
- Organel-holdige pellet fraktioner resuspenderes i 1 ml HCN buffer indeholdende 1% Triton X-100. Tilsætning af vaskemidler er nødvendig for at frigøre membran-indkapslet pulje af toksin.
- Toksin standarder ved koncentrationer på 100, 10, 1, og 0,1 ng / ml er udarbejdet i HCN buffer.
- Parallel sæt cytosol og organel fraktioner er forberedt på en kontrol eksperiment for at bekræfte troskab af fraktionering procedure. Brøker genereres som beskrevet i afsnit 2 er resuspenderet i 20 μL på 4x prøve buffer (cytosol fraktion) eller 120 μL af 1x prøve buffer (organel fraktion). Svarende mængder af hver fraktion er løst af natrium dodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese og probed by Western blot-analyse at påvise opdeling af et cytosol protein i supernatanten fraktion og en opløselig, bosiddende ER protein i pellet fraktion 16-19.
4. SPR præparatet
- Den Reichert SR7000 SPR Refraktometer bruges til SPR eksperimenter.
- Indstil en guldbelagt objektglas med et selv-samlet monolag i SPR instrument. For at aktivere sensoren slide, perfuse et 1:1 (v: v) opløsning af 0,4 m EDC og 0,1 M NHS over slide i 10 min ved en flowhastighed på 41 μL / min. Alle efterfølgende perfusions vil bruge den samme flow.
- For at fjerne EDC: NHS aktivering buffer, vaske pladen i 5 min med PBS indeholdende 0,05% Tween 20 (PBST). Pladen indeholder nu reaktive amid bindsler grund uncapper af EDC: NHS løsning.
- Perfuse en anti-CTA antistof over den aktiverede sensor slide ved en fortynding på 1:20,000 i 20 mM natriumacetat (pH 5,5) i 15 min. En indledende fald i refraktiv idex enhed (RIU) vil blive set på grund af pH-ændring. Dette vil blive fulgt af en stigning i RIU som antistoffet er fanget af amid-reaktivt bindsler på sensoren dias.
- Fjern ubundet antistof fra sensoren slide med en 5 minutters PBST vask. Den RIU signal produceret af de tilfangetagne antistof vil plateau og stabilisere, hvilket giver en ny baseline signal.
- Perfuse 1 M ethanolamin (pH 8,5) over sensoren slide i 5 min. Dette huer og inaktiverer eventuelle ubundne bindsler tilbage på sensoren dias.
5. SPR analyse af prøver
- At etablere en baseline læsning, perfuse PBST over antistof-belagt sensor i 5 min.
- Perfuse en eksperimentel prøve eller toksin standard over sensoren til 300 sek. Fjern ligand fra bufferen og perfuse PBST over sensoren for en anden 200 sek.
- Efter hver perfusion er bundet toksin fjernes fra sensoren ved en 100 sek vask med PBST ved pH 5,0. Dette vil returnere signaltil sin oprindelige baseline læsning, således at en anden prøve, der skal behandles på samme sensor.
- Før du lægger en ny prøve, skubbe en lille mængde af luft gennem prøven løkken til at bortvise enhver resterende væske fra før prøven. Ved hjælp af proceduren i 5,2-5,4, har vi køre op til 12 prøver på én slide uden væsentlige tab af baseline signal.
- Dataanalyse er udført med den Scrubber 2-software, og Igor software bruges for figur forberedelse.
6. Repræsentative resultater
Pertussis toksin (PT) er en AB-toksin, der bevæger sig fra celleoverfladen til skadestuen før en kæde (PTS1) kommer ind i cytosolen 3, 12. Som vist i figur 2, kunne vores SPR-baserede translokation analyse detektere PTS1 i cytosolen af berusede CHO celler. Intet signal blev genereret fra cytosolen af unintoxicated celler, som bekræftede den anti-PTS1 antistof ikke krydsreaktion med en komponent af værten cytosolen. Dencytosole fraktion fra celler beruset ved tilstedeværelsen af brefeldin A (BFA) også undladt at give et positivt signal. BFA forhindrer toksin transport til skadestuen translokationen webstedet 6-8, 12, 20-25 og dermed en kæde levering til cytosolen. Ved slutningen af hver kørsel, er bundet toksin strippet fra sensoren dias. Dette gav flere prøver, der skal screenes på en enkelt sensor dias og derved gav en direkte sammenligning mellem resultater opnået med forskellige eksperimentelle betingelser.
CT er en anden AB-typen, ER-translocating toksin 4. I figur 3A, blev CTA1 fundet i cytosol fraktion fra CT-behandlede HeLa celler. Det understreges, at vores metode virker med flere celletyper og kan anvendes på alle giftstof, som en anti-A kæde antistof er til rådighed. Intet signal blev opdaget, da cytosole fraktion fra CT-behandlede celler var perfunderet over en SPR sensor belagt med et anti-CTB antistof (Fig. 3B), hvilket viser, at de CTA1subunit, men ikke den celle-bindende CTB pentamer kommer ind i cytosolen. Figur 3C viser signalet fra organel fraktion er off-skala i forhold til de svagere signal fra cytosolisk fraktion. Dette var i overensstemmelse med den kendte ineffektivitet af CT-transport til skadestuen translokationen webstedet 6, 7, hvilket igen begrænser mængden af toksin, der kan nå cytosolen. Desuden organel fraktion indeholder CT holotoxin samt ER-lokaliserede CTA1, så den resulterende SPR signal til organel fraktion er oppustet af den ekstra masse holotoxin-associerede CTB pentamer. Det er således ikke praktisk at plotte data fra organel og cytosol fraktioner på samme sensorgram.
Vores analyse kan overvåge den tidsafhængige ophobning af omplantes, cytosole toksin (Fig 4). Cellerne blev udsat for CT ved 4 ° C, en temperatur, der gør det muligt toksin binding til plasma membranen, men forhindrer internalisering af cellen-associerede toksin. Efter removal af ubundet toksin, blev cellerne opvarmet til 37 ° C. Begge toksin transport til skadestuen og en kæde translokation til cytosolen kan opstå ved denne temperatur. Ingen toksin blev fundet i cytosolen 15 minutter efter opvarmning til 37 ° C. Dette afspejlede forsinkelse tid, der kræves for (i) holotoxin menneskehandel til ER, (ii) A / B subunit dissociation i ER, og (iii) En kæde eksport til cytosolen. En mindre pulje af cytosole toxin blev fundet efter 30 minutter ved 37 ° C, og gradvis større mængder cytosole toxin blev påvist efter 45 og 60 minutter jage intervaller. Endnu større grad af cytosole toxin blev fundet efter et fem timer jage interval 17, hvilket viser en vedvarende, langsigtet levering af celle-associerede toksin til værten cytosolen.
Vores analyse kan også opdage den hæmning af toksin translokation til cytosolen (Fig. 5). Celler behandlet med 10% dimethylsulfoxid (DMSO), et kemikalie anstandsdame, der forhindrer de termiske Disordering af de isolerede CTA1 subunit (T. Banerjee og K. Teter, ikke offentliggjort observationer), udstillet lave niveauer af cytosole CTA1 i forhold til ubehandlet kontrol celler. Udfoldning af toksinet En kæde er en forudsætning for translokation til cytosolen 16-18, så DMSO-induceret stabilisering af CTA1 derfor forhindret dens bevægelse fra ER til cytosolen.
Foreningen hastighedskonstant (K a) beregnes ud fra SPR eksperimenter er direkte proportional med koncentrationen af ligand i perfusionen buffer 14, 15, 26. Det er således muligt at bestemme koncentrationen af cytosole toksin fra en graf, der plotter K er værdier for toksin standarder som en funktion af toksin koncentration. Denne procedure blev anvendt til at kvantificere DMSO-induceret blok toksin translokation præsenteret i Figur 5: standardkurven genereret fra kendte koncentrationer af toksin blev brugt til at beregne et cytosol CTA1 concentration på 0,3 ng / ml for ubehandlede celler og 0,1 ng / ml for DMSO-behandlede celler (Fig. 6). Hæmning af CTA1 udfoldning af DMSO således frembragte en 3-fold reduktion i ER-til-cytosolen translokation af CTA1.
Figur 1. Protokol overblik. (A) Cellerne inkuberes med AB toksin ved 4 ° C, en temperatur, der gør det muligt toksin binding til celleoverfladen, men forhindrer toksin endocytose. A-og B underenheder af toksinet er repræsenteret af røde og blå cirkler, hhv. (B) Ubundet toksin fjernes fra mediet, og cellerne er opvarmet til 37 ° C for at fremme endocytose og retrograd transport af holotoxin til skadestuen. Holotoxin dissociation opstår i skadestuen, som gør det muligt isoleret En kæde at gå ind i cytosolen ved at passere gennem et protein-ledende kanal (er) i ER membranen. (C) Cellerne behandles med digitonin for at selektivt permeabilize plasmamembran. (D) Centrifugering bruges til at opdele celler i separate cytosol og organel fraktioner. Cytosolen er presset ud af cellen gennem digitonin-genererede porer og er beliggende i supernatant. Den intakte, membranbundne organeller findes i pellet fraktion. (E) At påvise translokeres pulje af toxin A-kæden i værten cytosolen, er supernatanten fraktionen perfunderet over en SPR sensor belagt med et anti-A kæde antistof.
Figur 2. Påvisning af PTS1 omplantning til værten cytosol. CHO-celler blev puls-mærket ved 4 ° C i 30 min med 1 mg / ml af PT. Cellerne blev derefter jagtet i 3 hr ved 37 ° C i toksin-fri medium, der ikke indeholder tilføjelser (berusede) eller 5 mg BFA / ml (+ BFA beruset). Permeabilization af plasma membran med digitonin blev brugt til at opdele celleekstrakter i separate organel og cytosole fractions. En SPR sensor belagt med et anti-PTS1 antistof blev brugt til at detektere cytosol puljen af PTS1 fra ubehandlede eller BFA-behandlede celler. PTS1 standarder blev perfunderet over sensoren som positive kontroller, mens cytosole fraktion fra unintoxicated celler blev perfunderet over sensoren slide som en negativ kontrol. Ved slutningen af hver kørsel, blev bundet prøve strippet fra sensoren dias.
Figur 3. Påvisning af CTA1 omplantning til værten cytosol. HeLa celler puls-mærket ved 4 ° C med 1 mg / ml CT blev jaget til 2 timer ved 37 ° C i toksin-fri medium, der ikke indeholder tilføjelser (berusede) eller 5 mg BFA / ml (+ BFA beruset). Permeabilization af plasma membran med digitonin blev brugt til at opdele celleekstrakter i separate organel og cytosolisk fraktioner. (A) cytosole fraktioner blev perfunderet over en SPR sensor belagt med et anti-CTA antistof. Kendtemængder af TCL blev brugt som positiv kontrol, mens cytosolen fra unintoxicated celler blev brugt som en negativ kontrol. (B) cytosole fraktion fra celler beruset i mangel af BFA var perfunderet over en SPR sensor belagt med et anti-CTB antistof. En renset CTB pentamer var perfunderet over slide som en positiv kontrol. (C) organel fraktion blev opløst med 1% Triton X-100, inden perfusion over en SPR sensor belagt med et anti-CTA antistof. Til sammenligning blev de cytosole fraktion (1 ml endelige rumfang) fra den samme celle ekstrakt og en CTA standard også perfunderet over sensoren. For alle paneler, var bundet prøve strippet fra sensoren ved slutningen af hver kørsel.
Figur 4. Kinetik CTA1 indtræden i cytosol. HeLa celler puls-mærket ved 4 ° C med 1 mg / ml CT blev jagtet i 15, 30, 45 eller 60 min ved 37 ° C i toksin-fri medium. At påvise translokeres pulje af toksin, blev cytosole fraktioner fra digitonin-permeabilized celler perfunderet over en SPR sensor belagt med et anti-CTA antistof. CTA standarder blev perfunderet over sensoren så godt. Ved slutningen af hver kørsel, blev bundet prøve strippet fra sensoren dias.
Figur 5. Hæmning af CTA1 translokation af DMSO. HeLa celler puls-mærket ved 4 ° C med 1 mg / ml CT blev jaget til 2 timer ved 37 ° C i toksin-fri medium, der ikke indeholder tilføjelser (berusede) eller 10% DMSO (+ DMSO beruset). At påvise translokeres pulje af toksin, blev cytosole fraktioner fra digitonin-permeabilized celler perfunderet over en SPR sensor belagt med et anti-CTA antistof. CTA standarder (100, 10, 1, og 0,1 ng / ml) blev perfunderet over sensoren som positive kontroller, kun på 1 og 0,1 ng / mL standarder er vist for skalering formål. Cytosolen fra unintoxicated celler blev brugt som en negativ kontrol. Ved slutningen af hver kørsel, blev bundet prøve strippet fra sensoren dias.
Figur 6. Beregning af cytosolisk CTA1. K er værdier for TCL standarder fra figur 5 blev plottet som funktion af toksin koncentration. Den resulterende standard kurve blev brugt til at bestemme, baseret på K er værdien af den eksperimentelle prøver fra figur 5, er koncentrationen af cytosole CTA1 i ubehandlet og DMSO-behandlede celler. Toksin standarder præsenteres som fyldte cirkler; de ubehandlede cytosolen præsenteres som en åben plads, og den DMSO-behandlede cytosolen præsenteres som en åben cirkel. Den gennemsnit ± intervaller af to uafhængige forsøg er vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammenligning med eksisterende metode
Vores SPR-baserede translokation analyse repræsenterer en hurtig, følsom, og kvantitativ metode til at påvise toksinet levering i værten cytosol. Teknikken kræver ikke radioaktiv mærkning eller andre ændringer af toksin, og det kan anvendes på alle giftstof, som en anti-toksin A kæde antistof er til rådighed. Eksisterende metoder til at overvåge toksin passage ind i cytosol er også afhængige af en subcellulære fraktioner protokol til partition celleekstrakter i separate cytosol og membran fraktioner 11, 23, 27, 28. Disse metoder bruger Western blot eller radiolabels at påvise cytosol pulje af toksin. Førstnævnte tilgang er semikvantitative i bedste fald og lider af relativt dårlig følsomhed. Selv radioaktiv mærkning protokoller kan tage uger at generere et resultat på grund af de lave niveauer af giftstof, der frem til cytosolen. Mens kvantitativ analyse med radioaktivt mærket toksin kan bestemme den relative procentdelaf celle-associeret giftstof, der kommer ind i cytosolen, kan denne tilgang ikke direkte at bestemme det nøjagtige antal cytosolisk toksin molekyler. Sammenligning af følsomheden af SPR toksin afsløring afsløring af radioaktivt toksin er derfor problematisk, da mængden af cytosole toksin kan beregnes ved SPR, men ikke af radioaktiv mærkning.
Andre translokation assays bypass upstream toksin handel trin og levere de toxin A kæde direkte til skadestuen ved hjælp af enten plasmid-baserede udtryk systemer eller in vitro transkription / translation systemer 29-38. For begge metoder, der sigtes mod en amino-terminal-signal sekvens A-kæde til co-translationel import til ER lumen. Eksport af syntetiseret en kæde fra ER derefter opdaget af subcellulære fraktionering, differential centrifugering, toksin aktivitet i cytosolen, proteasomal nedbrydning af translokeres toksin, og / eller et cytosol-specifikke toksin modifikation. Undersæt af disse tilgange tilkunder alene på translokationen begivenhed, der kan anvendes til in vitro rekonstituering eksperimenter, og producere forhøjede niveauer af toksin til påvisning og co-immunoprecipitation studier. Men kan de metoder ikke bestemme kinetik eller effektivitet toksin levering fra celleoverfladen til cytosolen. Det er også muligt, at translokeres En kæden ikke komme ind på skadestuen i samme konformationelle stat som holotoxin-leverede en kæde. Andre aspekter af værts-toksin interaktioner mangler fra disse procedurer, såsom A / B dissociation begivenhed. Der er således både styrker og svagheder til overvågning translokation med A kæder, der er syntetiseret direkte i ER.
Toksin translokation er ofte opdages gennem forgiftning assays. Den cytotoksiske eller cytopatisk effekt genereret af eksogent anvendes toksin viser toxin A kæden har nået sin cytosolisk målet. Det er selvfølgelig et indirekte mål for translokation, der overvåger toxin Activity i cytosolen i stedet for den fysiske tilstedeværelse af cytosolisk toksin. Således kan teknikken hverken kvantificere niveauet af cytosole toksin eller direkte afsløre ændrede behandling af translokeres toksin. Der er også scenarier, hvor en direkte sammenhæng mellem cytosol toksinindholdet og toksinvåben aktivitet ikke findes, såsom det eventuelle behov for en tærskel koncentration af cytosole toksin at fremkalde et cellulært respons, eller når toksin aktivitet frembringer en mættet cellulært respons. Alligevel kan forgiftning analyser giver en funktionel korrelation til assays, der direkte dokumenterer translokation begivenhed. Vi har tidligere brugt denne strategi til at demonstrere en hæmning af en kæde translokation svarer til en hæmning af cellulære forgiftning 17-19.
Sammenfattende er der flere metoder til påvisning af toksin levering til cytosolen. Vores SPR-tilgang er fordelene ved at levere hurtige, følsomme, og kvantitative resultater. Den data kan også suppleres med eksperimenter ved hjælp af en af de nævnte ældre strategier til at generere en stærkere konklusion.
Fremtidige applikationer
Vores label-fri metode til påvisning og kvantificering af cytosole toksin giver efterforskere med fleksibilitet til at løse mange udestående spørgsmål i forbindelse med cellebiologi for forgiftning. For eksempel er det muligt at fastslå effektiviteten af en kæde levering til cytosolen ved at beregne den procentdel af overflade-bundet toksin, der når cytosolen. Det er også muligt at kvantificere det samlede beløb for cytosole toksin og dermed er antallet af cytosole toksin molekyler per celle. Det menes, at et molekyle cytosole difteri toxin er tilstrækkelig til at fremkalde en komplet cytopatisk / cytotoksiske effekt 39; denne model kan nu testet med andre giftstoffer ved hjælp af vores translokation assay og korrelationsmaalinger beruselse assays. Således er vores SPR-baseret prøve ShoUld kunne bestemme, hvor mange molekyler af cytosole toksin er nødvendige for produktive forgiftning. Vores teknik kan også spore de vedvarende cytosolisk toksin. Væsentlig forringelse af translokeres En kæde vil begrænse og eventuelt nedbringe sine cytosole koncentrationen over tid, hvilket ville indebære, at virkningerne af beruselse kunne omstødes, hvis En kæde adgang til cytosolen blev begrænset efter den første toksin eksponering. Desuden kan det ekstracellulære medium og membran pellet fra berusede celler bruges til at spore mængden af udskilles toksin eller toksiner bosat i endomembrane systemet, hhv. Komparative studier af ekstracellulært, endomembrane-lokaliseret, og cytosol toksin kan bruges til at undersøge, hvordan cellebiologi af forgiftning varierer for forskellige ER-translocating toksiner. Vores analyse kan også bruges til at dissekere de toksin-specifikke cellulære faktorer, der er nødvendige for translokationen Løb 19. Det bør være muligt at tilpasse vores metode til at sporeendosome-til-cytosolen translokation af andre AB giftstoffer såsom miltbrand dødelige faktor og difteri toxin. Endelig kunne viral indgang i værten cytosol muligvis blive overvåget med en lignende eksperimentel procedure.
Begrænsninger
Forhold, der hæmmer toksin menneskehandel til skadestuen vil også forhindre toksin levering til cytosolen. Dette blev demonstreret ved mangel af cytosole toksin i BFA-behandlede celler (Fig. 2, 3A). Således er yderligere kontrol eksperimenter påkrævet, når du bruger denne metode til at undersøge potentielle blokke af toksin translokation. For nogle AB toksiner,. Reduktion af en disulfid-bro, at bindsler den katalytiske subunit til sin holotoxin sker i ER 6, 40-43 Den redox status En kæde kan derfor bruges som en målestok for toksin transport til skadestuen 16, 18. Rekombinant toksiner, som indeholder den konsensus sekvens for N-linked glycosylation, en ændring, der er påbegyndt i skadestuen, er også blevetanvendes til at påvise toksinet ind ind på skadestuen 12, 23, 44-46. Endelig, som nævnt ovenfor, alternative protokoller, der vedrører co-translationelle indsættelse af toxin A kæden ind på skadestuen lumen kan kontrollere en hæmmende effekt på translokation begivenhed. For eksempel viste vores SPR-baserede translokationen assay en funktionel rolle for Hsp90 i CTA1 translokation, der blev bekræftet med en plasmid-baseret system, udtrykt CTA1 direkte i ER lumen 19.
A-kæder af ER-translocating toksiner udviser en stærk arginin-over-lysin aminosyre skævhed, der gør det muligt for translokeres toksin til at unddrage sig ubiquitin-afhængige proteasomal nedbrydning 47-50. Men nedbrydning af cytosole toksin stadig forekommer ved en relativt langsom, ubiquitin-uafhængig proteasomal mekanisme, 51, 52. Betingelser, der øger proteasomal aktivitet kunne dermed forvrænge resultaterne af vores translokation analyse ved at reducere puljen af translokeres toksin i cytosol FRAIndsatsen. Celler udsat for en proteasom-hæmmer kan bruges til at styre for denne mulighed, en stigning i cytosol toksin som følge af proteasomal hæmning tyder toksinet kunne faktisk nå cytosolen men blev nedbrudt før detektion.
Det skal bemærkes, at disse betragtninger gælder delmængder af ovennævnte alternative tilgange og er ikke enestående for vores metode. Som tidligere nævnt, den bedste strategi til at karakterisere den translokation begivenheden er at bruge en kombination af velkontrollerede teknikker.
Kritiske trin og fejlfinding
Kemikalieaffald er et kritisk skridt for analysen. Digitonin ikke opløses let, og det bør være forberedt frisk i hvert forsøg. Ligeledes bør frisk PBST bruges til SPR analyse. EDC: NHS aktivering buffer skal tilberedes umiddelbart før brug, og det vil ikke beholde aktivitet, hvis de opbevares efter blanding af de to løsninger. However, adskille afmålinger af EDC og NHS kan opbevares ved -80 ° C og optøs én gang før brug. Alle løsninger, herunder vareprøver, bør degasses før injektion. Dette vil forhindre luft-induceret spikes i SPR signal.
Cellen type, der skal anvendes til denne analyse skal udtrykke nok toksin receptorer til at give en påviselig pulje af toxin A kæde til at nå cytosolen. I nogle tilfælde, såsom forbehandling af HeLa celler med GM1 før CT udfordring, kan yderligere toksin receptorer føjes til overfladen af target-cellerne. Cellen type skal også være modtagelige for selektiv permeabilization af plasma membran med digitonin. Protokollen er beskrevet heri er effektiv med HeLa og CHO celler, men andre celletyper vil kræve en optimering skridt med Western blot-analyse til at overvåge den rene adskillelse af organel og cytosolisk fraktioner. Vi rutinemæssigt følger fordelinger af disulfidisomeraseproteinet (et opløseligt ER protein) og Hsp90 (et cytosol protei) til dette formål 16-19. Den eksklusive opdeling af disulfidisomeraseproteinet i pellet fraktion 16-19 sikrer også, at organeller indsamlet i membranen pellet er intakte. Dette er et afgørende aspekt af vores metode, som utilsigtet brud af intracellulære organeller ville indføre fejl i systemet ved at frigøre endomembrane-begrænset giftstof ind i cytosolisk fraktion. SPR-baserede eksperimenter kan også bruges til at påvise, at cytosole puljen af toksin resultater fra en translokation begivenhed snarere end fra den lyse af intracellulære organeller. For eksempel blev der ikke toksin fundet i cytosolen af BFA-behandlede celler (Fig. 2, 3A), eller cellerne udsættes for toksin til kun 15 minutter (Fig. 4). Ligeledes var B-subunit CT ikke påvist i cytosol fraktion efter en to timers toksin eksponering (Fig. 3B). Havde vores protokol resulterede i permeabilization af interne membraner, ville vi have opdaget et cytosol pulje af toksin til hver af de ovennævnte betingelser. Etablering af den korrekte protokol for reproducerbare, selektiv permeabilization af plasmamembranen er sandsynligt at repræsentere hastighedsbegrænsende trin for analysen gennemførelse. Andre muligheder for plasma membran permeabilization er til rådighed, men vi fandt, at digitonin behandling, mere konsistente resultater end andre metoder såsom behandling med streptolysin O.
Kvaliteten af antistoffet vil også bestemme følsomheden af den analyse, som kan være etableret med serielle fortyndinger af et toksin standard. For eksempel kan vi reproducerbart afsløre så lidt som 0,1 ng / ml af enten PTS1 eller CTA standard (fig. 2-6). Den anti-A kæde antistof bør ikke anerkende toksin B-subunit, og unintoxicated celler bør altid bruges som en kontrol for at sikre, at antistoffet ikke krydsreaktion med proteiner i værtscellen. Indledende eksperimenter vil behovet for at optimere betingelserne for stripning bundet toksin fra antistof, da det kan varieretil forskellige anti-toksin antistoffer.
Når overvågning toksin translokation under ændrede cellulære forhold, bør toksinet standarder og cytosol fraktion fra ubehandlet kontrol celler blive suppleret at matche forholdene i den eksperimentelle prøve. For eksempel blev CTA standarder og den ubehandlede cytosole fraktion fra figur 5 suppleret med 1% DMSO til at matche den endelige lægemiddelkoncentration i cytosol fraktion fra DMSO-behandlede celler. Dette eliminerer eventuelle forskelle i SPR signaler, der måtte opstå som følge af forskelle i den kemiske sammensætning af de indsamlede fraktioner. Sammenligninger mellem cytosol og organel fraktioner vil ligeledes kræve, at tilsætning af 1% Triton X-100 til cytosol fraktion og standarder, da dette vaskemiddel bruges til at frigive den membran-indkapslet toksin fra organel fraktion for SPR detektion. Indledende forsøg har vist, at tilstedeværelsen af cytosolen ændrer ikke SPR svar på toksin standarder,så det er ikke nødvendigt at supplere toksinet standarder med cytosolen fra unintoxicated celler.
Antistof binding til sensoren slide vil ikke forekomme, hvis EDC: NHS aktivering løsning er gammel, eller hvis det dias er sat ind i instrumentet med guld nedad. I betragtning af fremstillingsprocessen, vil der være nogle plade-til-plade variation, der kan forhindre korrekt EDC: NHS aktivering og dermed antistof capture. Hvis antistof binding til diasset er dårlig, som angives af et svagt forhøjet RIU, kan endnu en injektion deponere mere af antistoffet på pladen. Den RIU er en vilkårlig enhed, der varierer fra det ene eksperiment til en anden afhængig af hvor meget anti-toksin antistof er deponeret på sensoren. Vil dog og slukker satser forbliver konstant.
Det er at foretrække at bruge et refraktometer med dual channel perfusion kamre, som en kanal kan bruges til den eksperimentelle prøve, og den anden kanal kan bruges til buffer alone med henblik på at korrigere for eventuelle baseline afdrift. Når du bruger en dobbelt kammer instrument, sikre, at anti-toksin antistof kun føjes til en af de to kanaler. Prøver vil efterfølgende blive kørt gennem begge kanaler. Med en enkelt kanal instrument, indebærer kompensation for baseline afdrift samling af buffer alene data fra antistof-belagt slide forud for prøven injektion.
Før starten på en SPR eksperiment, sikre, at sensoren slide er indstillet stram i instrumentet, og alle fittings er sikre. Utætheder som følge af disse spørgsmål vil generere luft pigge i de indsamlede data. Utætheder kan også påvises ved fravær af affald flow, som altid bør være til stede. En prøve volumen på mere end volumen injektionsloop er nødvendigt for at undgå luft pigge, samt - for eksempel bruger vi 1 ml prøvevolumen med en 500 μL injektionsloop. En uhensigtsmæssig mængde fordybelse olie på prismen vil forhindre en stabilisering af baseline underskriftl. Andre spørgsmål i forbindelse med driften af SPR instrumentet er behandlet i Brugervejledning og tekniske bulletins leveret af Reichert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af NIH give R01 AI073783 til K. Teter. Vi takker Dr. Shane Massey for bistand til udvikling af subcellulære fraktionering protokollen og Helen Burress til kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Ganglioside GM1 | Sigma-Aldrich | G7641 | |
| CTA | Sigma-Aldrich | C2398 | |
| PTS1 | List | 182 | |
| NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce, Thermo Scientific | 24500 | |
| EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22981 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135 | |
| PBST | Medicago | 09-8903-100 | |
| Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-80747 | |
| Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 | |
| Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-57639 | |
| Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC | |
| SPR sensor slides | Reichert | 13206060 | |
| Syringe pump | Cole-Parmer | 780200C |
References
- Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 1-24 (2002).
- Watson, P., Spooner, R. A. Toxin entry and trafficking in mammalian cells. Adv. Drug Deliv. Rev. 58, 1581-1596 (2006).
- Carbonetti, N. H. Pertussis toxin and adenylate cyclase toxin: key virulence factors of Bordetella pertussis and cell biology tools. Future Microbiol. 5, 455-469 (2010).
- Wernick, N. L. B., Chinnapen, D. J. -F., Cho, J. A., Lencer, W. I. Cholera toxin: an intracellular journey into the cytosol by way of the endoplasmic reticulum. Toxins. 2, 310-325 (2010).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Lencer, W. I. Entry of protein toxins into mammalian cells by crossing the endoplasmic reticulum membrane: co-opting basic mechanisms of endoplasmic reticulum-associated degradation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 300, 149-168 (2005).
- Lencer, W. I. Entry of cholera toxin into polarized human intestinal epithelial cells. Identification of an early brefeldin A sensitive event required for A1-peptide generation. J. Clin. Invest. 92, 2941-2951 (1993).
- Orlandi, P. A., Curran, P. K., Fishman, P. H. Brefeldin A blocks the response of cultured cells to cholera toxin. Implications for intracellular trafficking in toxin action. J. Biol. Chem. 268, 12010-12016 (1993).
- Sandvig, K., Prydz, K., Hansen, S. H., van Deurs, B. Ricin transport in brefeldin A-treated cells: correlation between Golgi structure and toxic effect. J. Cell. Biol. 115, 971-981 (1991).
- Sandvig, K., Prydz, K., Ryd, M., van Deurs, B. Endocytosis and intracellular transport of the glycolipid-binding ligand Shiga toxin in polarized MDCK cells. J. Cell Biol. 113, 553-562 (1991).
- van Deurs, B. Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. J. Cell Biol. 106, 253-267 (1988).
- Tam, P. J., Lingwood, C. A. Membrane cytosolic translocation of verotoxin A1 subunit in target cells. Microbiology. 153, 2700-2710 (2007).
- Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cell. Microbiol. 10, 1130-1139 (2008).
- Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Medaglia, M. V., Fisher, R. J. Protein-Protein Interactions. Golemis, E. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 255-272 (2002).
- Banerjee, T. Contribution of subdomain structure to the thermal stability of the cholera toxin A1 subunit. Biochemistry. 49, 8839-8846 (2010).
- Massey, S. Stabilization of the tertiary structure of the cholera toxin A1 subunit inhibits toxin dislocation and cellular intoxication. J. Mol. Biol. 393, 1083-1096 (2009).
- Taylor, M. A therapeutic chemical chaperone inhibits cholera intoxication and unfolding/translocation of the cholera toxin A1 subunit. PLoS ONE. 6, e18825-e18825 (2011).
- Taylor, M. Hsp90 is required for transfer of the cholera toxin A1 subunit from the endoplasmic reticulum to the cytosol. J. Biol. Chem. 285, 31261-31267 (2010).
- Donta, S. T., Beristain, S., Tomicic, T. K. Inhibition of heat-labile cholera and Escherichia coli enterotoxins by brefeldin A. Infect. Immun. 61, 3282-3286 (1993).
- Donta, S. T., Tomicic, T. K., Donohue-Rolfe, A. Inhibition of Shiga-like toxins by brefeldin. A. J. Infect. Dis. 171, 721-724 (1995).
- Nambiar, M. P., Oda, T., Chen, C., Kuwazuru, Y., Wu, H. C. Involvement of the Golgi region in the intracellular trafficking of cholera toxin. J. Cell. Physiol. 154, 222-228 (1993).
- Rapak, A., Falnes, P. O., Olsnes, S. Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 3783-3788 (1997).
- Xu, Y., Barbieri, J. T. Pertussis toxin-mediated ADP-ribosylation of target proteins in Chinese hamster ovary cells involves a vesicle trafficking mechanism. Infect. Immun. 63, 825-832 (1995).
- Yoshida, T., Chen, C. C., Zhang, M. S., Wu, H. C. Disruption of the Golgi apparatus by brefeldin A inhibits the cytotoxicity of ricin, modeccin, and Pseudomonas toxin. Exp. Cell Res. 192, 389-395 (1991).
- Godber, B. Direct quantification of analyte concentration by resonant acoustic profiling. Clin. Chem. 51, 1962-1972 (2005).
- Bernardi, K. M., Forster, M. L., Lencer, W. I., Tsai, B. Derlin-1 facilitates the retro-translocation of cholera toxin. Mol. Biol. Cell. 19, 877-884 (2008).
- Wernick, N. L., De Luca, H., Kam, W. R., Lencer, W. I. N-terminal Extension of the Cholera Toxin A1-chain Causes Rapid Degradation after Retrotranslocation from Endoplasmic Reticulum to Cytosol. J. Biol. Chem. 285, 6145-6152 (2010).
- Simpson, J. C. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS. Lett. 459, 80-84 (1999).
- Veithen, A., Raze, D., Locht, C. Intracellular trafficking and membrane translocation of pertussis toxin into host cells. Int. J. Med. Microbiol. 290, 409-413 (2000).
- Castro, M. G., McNamara, U., Carbonetti, N. H. Expression, activity and cytotoxicity of pertussis toxin S1 subunit in transfected mammalian cells. Cell. Microbiol. 3, 45-54 (2001).
- Schmitz, A., Herrgen, H., Winkeler, A., Herzog, V. Cholera toxin is exported from microsomes by the Sec61p complex. J. Cell Biol. 148, 1203-1212 (2000).
- Teter, K., Allyn, R. L., Jobling, M. G., Holmes, R. K. Transfer of the cholera toxin A1 polypeptide from the endoplasmic reticulum to the cytosol is a rapid process facilitated by the endoplasmic reticulum-associated degradation pathway. Infect. Immun. 70, 6166-6171 (2002).
- Winkeler, A., Godderz, D., Herzog, V., Schmitz, A. BiP-dependent export of cholera toxin from endoplasmic reticulum-derived microsomes. FEBS Lett. 554, 439-442 (2003).
- Yu, M., Haslam, D. B. Shiga toxin is transported from the endoplasmic reticulum following interaction with the luminal chaperone HEDJ/ERdj3. Infect. Immun. 73, 2524-2532 (2005).
- LaPointe, P., Wei, X., Gariepy, J. A role for the protease-sensitive loop region of Shiga-like toxin 1 in the retrotranslocation of its A1 domain from the endoplasmic reticulum lumen. J. Biol. Chem. 280, 23310-23318 (2005).
- Teter, K., Jobling, M. G., Sentz, D., Holmes, R. K. The cholera toxin A13 subdomain is essential for interaction with ADP-ribosylation factor 6 and full toxic activity but is not required for translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Infect. Immun. 74, 2259-2267 (2006).
- Redmann, V. Dislocation of ricin toxin a chains in human cells utilizes selective cellular factors. J. Biol. Chem. 286, 21231-21238 (2011).
- Yamaizumi, M., Mekada, E., Uchida, T., Okada, Y. One molecule of diphtheria toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell. Cell. 15, 245-250 (1978).
- Bellisola, G. Reductive activation of ricin and ricin A-chain immunotoxins by protein disulfide isomerase and thioredoxin reductase. Biochem. Pharmacol. 67, 1721-1731 (2004).
- McKee, M. L., FitzGerald, D. J. Reduction of furin-nicked Pseudomonas exotoxin A: an unfolding story. Biochemistry. 38, 16507-16513 (1999).
- Orlandi, P. A. Protein-disulfide isomerase-mediated reduction of the A subunit of cholera toxin in a human intestinal cell line. J. Biol. Chem. 272, 4591-4599 (1997).
- Spooner, R. A. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and B chains in the endoplasmic reticulum. Biochem. J. 383, 285-293 (2004).
- Fujinaga, Y. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol. Biol. Cell. 14, 4783-4793 (2003).
- Guerra, L. Cellular internalization of cytolethal distending toxin: a new end to a known pathway. Cell. Microbiol. 7, 921-934 (2005).
- Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. J. Biol. Chem. 272, 19554-19561 (1997).
- Deeks, E. D. The low lysine content of ricin A chain reduces the risk of proteolytic degradation after translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Biochemistry. 41, 3405-3413 (2002).
- Hazes, B., Read, R. J. Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Biochemistry. 36, 11051-11054 (1997).
- Rodighiero, C., Tsai, B., Rapoport, T. A., Lencer, W. I. Role of ubiquitination in retro-translocation of cholera toxin and escape of cytosolic degradation. EMBO Rep. 3, 1222-1227 (2002).
- Worthington, Z. E., Carbonetti, N. H. Evading the proteasome: absence of lysine residues contributes to pertussis toxin activity by evasion of proteasome degradation. Infect. Immun. 75, 2946-2953 (2007).
- Pande, A. H., Moe, D., Jamnadas, M., Tatulian, S. A., Teter, K. The pertussis toxin S1 subunit is a thermally unstable protein susceptible to degradation by the 20S proteasome. Biochemistry. 45, 13734-13740 (2006).
- Pande, A. H. Conformational instability of the cholera toxin A1 polypeptide. J. Mol. Biol. 374, 1114-1128 (2007).
