Summary
I denna rapport beskriver vi hur ytplasmonresonans används för att upptäcka toxin inträde i den mottagande cytosolen. Denna mycket känsliga metoden kan ge kvantitativa uppgifter om mängden cytosolic toxin, och den kan tillämpas på en rad olika gifter.
Abstract
AB gifter består av en enzymatisk En subenhet och en cell-bindande B-subenhet 1. Dessa gifter utsöndras i den extracellulära miljön, men de agerar på mål inom eukaryota cytosolen. Vissa AB gifter resa med vesikler transportörer från cellytan till endoplasmatiska retiklet (ER) innan cytosolen 2-4. I ER, för att den katalytiska En kedja dissocierar från resten av toxinet och rör sig genom en protein-ledande kanalen nå sitt cytosoliskt mål 5. Den flyttas, cytosoliskt En kedja är svåra att upptäcka eftersom toxin människohandel till ER är en mycket ineffektiv process: de flesta internaliseras toxin är dirigeras till lysosomer för nedbrytning, så bara en liten del av ytbundet toxin når Golgiapparaten och ER 6 -12.
För att övervaka toxin translokation från ER till cytosolen i odlade celler, kombinerade vi en subcellulära fraktionering protokoll med highly känslig metod för ytplasmonresonans (SPR) 13-15. Membranet på toxin-behandlade celler är selektivt permeabilized med digitonin, vilket gör att insamling av en cytosoliskt bråkdel som sedan perfusion över en SPR-sensor belagda med ett anti-toxin En kedja antikropp. De antikroppsförsedda sensorn kan fånga och upptäcka pg / ml mängder cytosoliska toxin. Med detta protokoll är det möjligt att följa kinetiken av toxin inträde i cytosolen och för att karakterisera hämmande inverkan på translokation evenemanget. Koncentrationen av cytosolic toxin kan också beräknas från en standardkurva som genereras med kända mängder av en kedja standarder som har perfusion över sensorn. Vår metod är en snabb, känslig och kvantitativ detektionssystem som inte kräver radioaktiv inmärkning eller andra ändringar till målet toxin.
Protocol
1. Beredning av digitonin
- Tillsätt 500 mikroliter på 100% etanol till ett mikrocentrifugrör och placera den i ett värmeblock inställd på 80 ° C i 10 min.
- Lös 2,5 mg digitonin i 250 mikroliter av den uppvärmda etanol för att producera en 1% stamlösning av digitonin.
- För att generera en fungerande lösning av 0,04% digitonin, tillsätt 40 mikroliter av digitonin stamlösning till 960 mikroliter av HCN buffert (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mm N-Ethylmaleimide och en proteashämmare cocktail).
2. Cell berusning och permeabilization
Vår translokation analysen kan tillämpas på en rad olika gifter och cellinjer. Nedan ger vi ett detaljerat protokoll för upptäckt av kolera toxin (CT). En översikt av det förfarande som finns i figur 1.
- HeLa celler är seedade i 6-bra plattor som innehåller 1 ml DMEM kompletteras med 10% fetalt bovint serum och antibiotika-antimykotikaatt uppnå 1x10 6 celler / brunn efter en natts inkubation vid 37 ° C. Att generera tillräckligt cytosoliskt toxin för reproducerbara upptäckt, är tre exemplar brunnar krävs för varje tillstånd.
- Efter en övernattning inkubationen ersätta odlingsmedium med 1 ml DMEM innehåller 100 ng / ml ganglioside GM1. Detta ökar antalet bindningsställen för CT, eftersom GM1 receptorn av CT intercalate i membranet på celler som utsätts för en lösning av GM1.
- Efter 1 timme inkubation vid 37 ° C, ta bort GM1 innehållande medium och tvätta cellerna två gånger med DMEM. Sedan placera cellerna vid 4 ° C i 30 min i 1 mL DMEM innehåller 1 mikrogram / ml av CT.
- Ta bort toxin-innehållande medium, tvätta cellerna två gånger med DMEM och inkubera celler i 1 ml DMEM vid 37 ° C under önskat tidsintervall (s).
- Vid slutet av varje jaga period, tvätta cellerna med PBS och inkubera varje brunn med 250 mikroliter av 0,5 mM EDTA i PBS. Låt cellerna sitta 10 min i rumstemperatur och sedan ta bort dem från 6-brunnar av kraftig trituration med en P1000 pipetman. Efter en väl av celler har samlats in, kombinera den med andra och gör en sådan tredje väl från samma skick. Cell skrapor kan också användas för att samla in cellerna.
- Placera den kombinerade cellsuspensionen från de tre likadana brunnar (750 mikroliter totala volymen) i en enda mikrocentrifugrör, och snurra den i en bordsskiva mikrocentrifug i 5 min vid 5000 x g. Cell pelletar av ungefär motsvarande storlek bör erhållas för alla förhållanden.
- Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 100 mikroliter av 0,04% brukslösning av digitonin. Placera cellsuspension på is i 10 min.
- Snurra digitonin-permeabilized celler vid 16.000 xgi 10 minuter i en bordsskiva mikrocentrifug. Överför cytosolen innehåller supernatant fraktionen till en ny mikrocentrifugrör, och behålla organell innehåller pellets fraktionen.
- Cytosolen innehåller supernatant fraktioner späds ut i HCN buffert till en slutlig volym på 1 ml. Provvolymer på minst 1 ml är nödvändiga för att säkerställa luft avlägsnas från 500 mikroliter Provslinga före injektion.
- Organell som innehåller pellets fraktioner är suspenderade i 1 ml av HCN buffert innehållande 1% Triton X-100. Tillsättning av rengöringsmedel är nödvändigt för att frigöra membran-inneslutet pool av toxin.
- Toxin standarder i koncentrationer på 100, 10, 1 och 0,1 ng / ml är upprättad i HCN buffert.
- Parallella cytosolic och organell fraktioner är förberedda för en kontroll experiment för att bekräfta trohet fraktionering förfarande. Bråk genereras som beskrivs i avsnitt 2 är suspenderade i 20 mikroliter av 4x prov buffert (cytosoliskt fraktionen) eller 120 mikroliter av 1x prov buffert (organell fraktion). Motsvarande volymer av varje fraktion löses med natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores och sonderade By Western blot analys för att visa uppdelning av en cytosolproteinet i supernatanten fraktionen och en löslig, bosatt ER protein i pelleten fraktionen 16-19.
4. SPR preparatet
- Den Reichert SR7000 SPR refraktometer används för SPR experiment.
- Ställ en guldpläterad glasskiva med ett själv-monterade monolager i SPR instrumentet. För att aktivera sensorn bilden, BEGJUTA en 1:1 (v: v) lösning av 0,4 M EDC och 0,1 M NHS över bilden i 10 min med en flödeshastighet på 41 ml / min. Alla efterföljande perfusion kommer att använda samma flöde.
- För att ta bort EDC: NHS aktivering buffert, tvätta plattan i 5 minuter med PBS innehållande 0,05% Tween 20 (PBST). Plattan innehåller nu reaktiva amid tjuder grund avtäckning av EDC: NHS lösning.
- BEGJUTA en anti-CTA antikropp över aktiverade sensorn bild i en utspädning av 1:20,000 i 20 mM natriumacetat (pH 5,5) i 15 min. En inledande nedgång i brytningsindex iDEX enhet (RIU) kommer att ses på grund av pH-förändringen. Detta kommer att följas av en ökning av RIU eftersom antikroppen fångas av amid-reaktivt tjuder på sensorn bilden.
- Ta bort obundna antikroppar från sensorn bilden med en 5 minuters PBST tvätt. Riu signal som produceras av den fångade antikroppar kommer platå och stabilisera genom en ny baslinje signal.
- BEGJUTA 1 M etanolamin (pH 8,5) över sensorn bilden i 5 minuter. Detta mössor och inaktiverar alla obundna tjuder kvar på sensorn bilden.
5. SPR analys av prover
- Att etablera en baslinje läsning, BEGJUTA PBST över antikroppsförsedda sensor för 5 min.
- BEGJUTA ett experimentellt prov eller toxin standard över sensorn för 300 sek. Ta bort liganden från bufferten och BEGJUTA PBST över sensorn för ytterligare 200 sek.
- Efter varje perfusion, är bundet toxin bort från sensorn genom en 100 sek tvätta med PBST vid pH 5,0. Detta kommer tillbaka signalentill sitt ursprungliga baslinjen läsning, så att en annan prov som ska behandlas på samma sensor.
- Innan du laddar ett nytt prov, tryck en liten mängd luft genom Provslinga att utvisa någon resterande vätska från föregående provet. Med det förfarande som beskrivs i 5,2-5,4, har vi köra upp till 12 prover på en bild utan betydande förlust av baslinjen signalen.
- Dataanalys utförs med Scrubber 2 programvaran, och Igor programvara används för figur beredning.
6. Representativa resultat
Kikhosta toxin (PT) är ett AB toxin som flyttar från cellytan till akuten innan dess En kedja (PTS1) träder cytosolen 3, 12. Som visas i figur 2, kan vår SPR-baserade translokation analys upptäcka PTS1 i cytosolen av berusade CHO celler. Ingen signal kom från cytosolen i unintoxicated celler, som bekräftade anti-PTS1 antikroppar inte korsreagerar med en komponent i den mottagande cytosolen. Dencytosoliskt fraktionen från celler berusade i närvaro av brefeldin A (BFA) misslyckades också med att ge en positiv signal. BfA förhindrar toxinet under transport till sjukhus translokation plats 6-8, 12, 20-25 och därmed En kedja leverans till cytosolen. Vid slutet av varje körning, är bundet toxin bort från sensorn bilden. Detta gjorde att flera prover som ska undersökas på en enda sensor bild och därmed gav en direkt jämförelse mellan resultat som erhölls med olika experimentella förhållanden.
CT är en annan AB-typ, ER-translocating toxin 4. I figur 3A var CTA1 upptäckts i cytosoliskt fraktionen från CT-behandlade HeLa celler. Det betonades att vår metodik fungerar med flera celltyper och kan tillämpas på alla toxin som en anti-A-kedjan antikropp är tillgänglig. Ingen signal upptäcktes när cytosoliskt fraktionen från CT-behandlade cellerna var perfusion över en SPR-sensor belagda med ett anti-CTB antikropp (Fig. 3B), vilket visar att CTA1subenhet, men inte den cell-bindande CTB pentamer in i cytosolen. Figur 3C visar signalen från organell fraktionen är utanför skalan i jämförelse med den svagare signalen från cytosoliska fraktion. Detta överensstämde med de kända ineffektivitet CT transport till sjukhus translokation webbplatsen 6, 7, som i sin tur begränsar mängden gift som kan nå cytosolen. Dessutom innehåller organell bråkdel CT holotoxin samt ER-lokaliserad CTA1, så den resulterande SPR signal för organell fraktionen är uppblåst av den extra massan av holotoxin-associerade CTB pentamer. Därför är det inte praktiskt att rita data från organell och cytosola fraktioner på samma sensorgram.
Vår analys kan övervaka tidsberoende ansamling av flyttad, cytosolic toxin (Fig. 4). Cellerna utsattes för CT vid 4 ° C, en temperatur som gör att giftet bindning till plasmamembranet men förhindrar internalisering av cell-associerade toxin. Efter RemoVal av obundet toxin, var cellerna värmts till 37 ° C. Både toxin under transport till sjukhus och en kedja translokation till cytosolen kan uppstå vid denna temperatur. Inga toxin upptäcktes i cytosolen 15 minuter efter uppvärmning till 37 ° C. Detta återspeglade fördröjning som krävs för att (i) holotoxin människohandel till akuten, (ii) A / B-subenheten dissociation på akuten, och (iii) En kedja export till cytosolen. En mindre pool av cytosolic toxin upptäcktes efter 30 minuter vid 37 ° C och successivt större mängder cytosolic toxin upptäcktes efter 45 och 60 minuters jakt mellanrum. Ännu större grad av cytosolic toxin upptäcktes efter en 5 timmars jakt intervall 17, vilket visar en kontinuerlig och långsiktig leverans av cell-associerade toxin till värden cytosolen.
Vår analys kan också upptäcka hämning av toxin translokation till cytosolen (bild 5). Celler som behandlats med 10% dimetylsulfoxid (DMSO), en kemikalie förkläde som förhindrar den termiska Disordering av de isolerade CTA1 subenhet (T. Banerjee och K. Teter, opublicerade observationer), uppvisade låga nivåer av cytosolic CTA1 i jämförelse med den obehandlade kontrollgruppen celler. Fälla av toxinet En kedja är en förutsättning för translokation till cytosolen 16-18, så DMSO-inducerad stabilisering av CTA1 detta hindrade dess rörelse från ER till cytosolen.
Föreningen hastighetskonstant (k a) beräknas från SPR experiment är direkt proportionell mot koncentrationen av liganden i perfusionen buffert 14, 15, 26. Således är det möjligt att bestämma koncentrationen av cytosolic toxin från en graf som plottar k ett värden för toxin standarder som funktion av toxin koncentration. Detta förfarande användes för att kvantifiera DMSO-inducerad block av toxin translokation som presenteras i Figur 5: standardkurvan genereras från kända koncentrationer av toxin har använts för att beräkna en cytosoliskt CTA1 koncentreradesion på 0,3 ng / ml för obehandlade celler och 0,1 ng / ml för DMSO-behandlade celler (bild 6). Hämningen av CTA1 utvecklas genom DMSO genereras därmed en 3-faldig minskning av ER till cytosolen flyttning av CTA1.
Figur 1. Protokoll översikt. (A) celler inkuberas med AB toxin vid 4 ° C, en temperatur som gör att giftet binda till cellytan men hindrar toxin endocytos. A-och B-subenheter av toxin representeras av röda och blå cirklar, respektive. (B) Obundet giftet tas bort från mediet och cellerna värmts till 37 ° C för att främja endocytos och bakåtsträvande transport av holotoxin till akuten. Holotoxin dissociation inträffar i ER, vilket gör den isolerade En kedja att gå in i cytosolen genom att passera genom en protein-ledande kanal (er) i ER membranet. (C) celler behandlas med digitonin för att selektivt permeabilize plasmamembran. (D) Centrifugering används för att dela cellerna i separata cytosoliskt och organell fraktioner. Cytosolen pressas ut ur cellen genom digitonin-genererade porer och ligger i supernatanten. Den intakta, membranbundna organeller finns i pelleten fraktion. (E) för att upptäcka den flyttad pool av toxin A-kedjan i den mottagande cytosolen är supernatanten bråkdel perfusion över en SPR-sensor belagda med ett anti-En kedja antikropp.
Figur 2. Detektion av PTS1 translokation i den mottagande cytosolen. CHO celler puls-märkta vid 4 ° C i 30 min med 1 mikrogram / ml av PT. Cellerna har sedan jagade efter 3 tim vid 37 ° C i giftfria medel som inte innehåller tillsatser (berusad) eller 5 mikrogram BfA / ml (+ BfA berusade). Permeabilization av plasmamembranet med digitonin användes till utdrag partitionen cell i separata organell och cytosola fractions. En SPR sensor belagda med ett anti-PTS1 antikroppar har använts för att upptäcka cytosoliskt pool av PTS1 från obehandlat eller BfA behandlade celler. PTS1 standarder perfusion över sensorn som positiva kontroller, medan cytosoliskt fraktionen från unintoxicated celler perfusion över sensorn bilden som en negativ kontroll. Vid slutet av varje körning, var bunden prov strippad från sensorn bilden.
Figur 3. Detektering av CTA1 translokation i den mottagande cytosolen. HeLa celler puls-märkta vid 4 ° C med 1 mikrogram / ml av CT jagades för 2 tim vid 37 ° C i giftfria medel som inte innehåller tillsatser (berusad) eller 5 mikrogram BfA / ml (+ BfA berusade). Permeabilization av plasmamembranet med digitonin användes till utdrag partitionen cell i separata organell och cytosola fraktioner. (A) cytosoliskt fraktioner var perfusion över en SPR-sensor belagda med ett anti-CTA antikropp. Kändamängder av CTA användes som positiva kontroller, medan cytosolen från unintoxicated celler användes som negativ kontroll. (B) cytosoliskt fraktionen från celler berusade i avsaknad av BfA var perfusion över en SPR-sensor belagda med ett anti-CTB antikropp. Ett renat CTB pentamer var perfusion över bilden som en positiv kontroll. (C) organell fraktionen var solubilized med 1% Triton X-100 innan perfusion över en SPR-sensor belagda med ett anti-CTA antikropp. I jämförande syfte var cytosoliskt bråkdel (1 mL slutliga volym) från samma cell extrakt och en CTA standard även perfusion över sensorn. För alla paneler, var bunden prov strippad från sensorn vid slutet av varje körning.
Figur 4. Kinetik CTA1 inträde i cytosolen. HeLa celler puls-märkta vid 4 ° C med 1 mikrogram / ml av CT jagades i 15, 30, 45 eller 60 min vid 37 ° C i giftfria medium. Att upptäcka flyttad pool av toxin, var cytosoliskt fraktioner från digitonin-permeabilized celler perfusion över en SPR-sensor belagda med ett anti-CTA antikropp. CTA standarder perfusion över sensorn också. Vid slutet av varje körning, var bunden prov strippad från sensorn bilden.
Figur 5. Hämning av CTA1 translokation av DMSO. HeLa celler puls-märkta vid 4 ° C med 1 mikrogram / ml av CT jagades för 2 tim vid 37 ° C i giftfria medel som inte innehåller tillsatser (berusad) eller 10% DMSO (+ DMSO berusade). Att upptäcka flyttad pool av toxin, var cytosoliskt fraktioner från digitonin-permeabilized celler perfusion över en SPR-sensor belagda med ett anti-CTA antikropp. CTA-standarder (100, 10, 1 och 0,1 ng / ml) var perfusion över sensorn som positiva kontroller, bara 1 och 0,1 ng / ml standard visas för skalning ändamål. Cytosolen från unintoxicateD-celler användes som negativ kontroll. Vid slutet av varje körning, var bunden prov strippad från sensorn bilden.
Figur 6. Beräkning av cytosolic CTA1. K ett värden för CTA-standarder från figur 5 var ritas som en funktion av toxin koncentration. Den resulterande Standardkurvan var van att bestämma, baserat på k ett värde av experimentella prover från Figur 5, koncentrationen av cytosolic CTA1 i obehandlade och DMSO-behandlade celler. Toxin standarder presenteras som fyllda cirklar, den obehandlade cytosolen presenteras som ett öppet torg, och DMSO-behandlade cytosolen presenteras som en öppen cirkel. I genomsnitt ± serier av två oberoende experiment visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämförelse med den befintliga metoden
Vår SPR-baserade translokation analysen representerar en snabb, känslig och kvantitativ metod för att upptäcka toxin leverans i den mottagande cytosolen. Tekniken kräver inte radioaktiv inmärkning eller andra ändringar av toxin, och det kan tillämpas på alla toxin som en anti-toxin A-kedjan antikropp är tillgänglig. Befintliga metoder för att övervaka toxin passage i cytosolen bygger också på en subcellulära fraktionering protokoll till utdrag partition cell i separata cytosolen och bråk membran 11, 23, 27, 28. Dessa metoder använder Western blot eller Radioaktivt märkt att upptäcka cytosoliskt pool av toxin. Den tidigare metoden är semikvantitativ i bästa fall och lider av relativt dålig känslighet. Även radioaktiv inmärkning protokoll kan ta veckor att generera ett resultat på grund av låga nivåer av toxin som når cytosolen. Medan kvantitativ analys med ett radioaktivt märkt toxin kan avgöra den relativa andelenav cell-associerade toxin som kommer in i cytosolen, kan denna metod inte direkt fastställa det exakta antalet cytosolic toxin molekyler. Jämföra känslighet SPR toxin upptäckt till upptäckt av radioaktivt märkt toxin är därför problematisk, eftersom den mängd cytosolic toxin kan beräknas genom SPR men inte av radioaktiv inmärkning.
Andra translokation analyser förbi uppströms stegen toxin människohandel och leverera toxin En kedja direkt till akuten med antingen plasmid-baserad uttryck system eller in vitro transkription / översättningssystem 29-38. För båda metoderna, mål en amino-terminal signalsekvensen A-kedjan för co-translationell import till ER lumen. Export av den syntetiserade En kedja från ER sedan detekteras av subcellulära fraktionering, differential centrifugering, toxin aktivitet i cytosolen, proteasomal nedbrytning av flyttad toxin, och / eller en cytosoliskt-specifika toxin modifiering. Delmängder av dessa metoder förkunderna enbart på translokation händelsen, kan användas för in vitro-beredning experiment och ge förhöjda nivåer av toxin för att upptäcka och co-immunoprecipitation studier. Däremot kan metoderna inte fastställa kinetik eller effektivitet toxin leverans från cellytan till cytosolen. Det är också möjligt att den flyttad En kedja inte kommer in i ER i samma konformationsanalys staten som holotoxin levererade-en kedja. Andra aspekter av värd-toxin interaktioner saknas i dessa förfaranden, såsom A / B dissociation händelse. Det finns alltså både styrkor och svagheter för att övervaka förflyttning med A kedjor som syntetiseras direkt i ER.
Toxin translokation är ofta upptäcks genom berusning analyser. Den cytotoxiska eller cytopatisk effekt som genereras av exogent tillämpas toxin visar toxin A-kedjan har nått sin cytosoliska mål. Uppenbarligen är detta ett indirekt mått på translokation som övervakar toxin enctivity i cytosolen snarare än den fysiska närvaron av cytosoliska toxin. Således kan tekniken kvantifiera varken nivåer cytosolic toxin eller direkt upptäcka förändrat behandlingen av flyttad toxin. Det finns också scenarier där ett direkt samband mellan cytosoliskt toxinhalterna och toxinaktivitet inte finns, såsom eventuellt behov av en tröskel koncentration av cytosolic toxin att framkalla en cellulär reaktion eller när toxinaktivitet ger en mättad cellulära svar. Ändå kan berusning testmetoder ger ett funktionellt samband med tester som direkt dokumentera translokation händelsen. Vi har tidigare använt denna strategi för att visa en hämning av en kedja translokation motsvarar en hämning av cellulära berusning 17-19.
Sammanfattningsvis, det finns flera metoder för att upptäcka toxin leverans till cytosolen. Vår SPR-metoden har fördelarna med att skapa snabba, känsliga och kvantitativa resultat. Den data kan även kompletteras med experiment med en av de ovan nämnda äldre strategier för att skapa en starkare slutsats.
Framtida tillämpningar
Vår label-fri metod för detektion och kvantifiering av cytosolic toxin ger utredare med flexibiliteten att kunna ta itu med många olösta frågor om cellbiologi av berusning. Till exempel är det möjligt att fastställa effektiviteten i en kedja leverans till cytosolen genom att beräkna andelen ytbundet toxin som når cytosolen. Det är också möjligt att kvantifiera den totala mängden cytosolic toxin och i förlängningen antalet cytosolic toxin molekyler per cell. Man tror att en molekyl cytosolic difteri toxin räcker för att framkalla en komplett cytopatisk / cytotoxiska effekten 39, denna modell kan nu testas med andra gifter med våra translokation analys och korrelat analyser berusning. Således vår SPR-baserad analys should kunna avgöra hur många molekyler i cytosoliskt toxin krävs för produktiva berusning. Vår teknik kan även följa ihållande cytosoliska toxin. Betydande försämring av flyttad En kedja skulle begränsa och eventuellt minska sin cytosoliskt koncentration över tid, vilket skulle innebära att effekterna av berusning kan vändas om En kedja tillgång till cytosolen var begränsad efter den första giftet exponering. Dessutom kan extracellulära mediet och membran pellets från berusade celler användas för att spåra den mängd utsöndras toxin eller toxin som bor i endomembrane systemet, respektive. Jämförande studier av extracellulär, endomembrane-lokaliserad, och cytosola toxin kan användas för att undersöka hur cellbiologi av förgiftning varierar för olika ER-translocating toxiner. Vår analys kan också användas för att dissekera toxin-specifika cellulära faktorer som krävs för translokation händelsen 19. Det bör vara möjligt att anpassa våra metoder för att spåraden endosome till cytosolen förflyttning av andra AB gifter som mjältbrand dödlig faktor och difteri toxin. Slutligen kan viralt inträde i den mottagande cytosolen eventuellt följas upp med en liknande experimentell förfarande.
Begränsningar
Förhållanden som hämmar toxin människohandel till akuten kommer också förhindra toxin leverans till cytosolen. Detta visades av frånvaron av cytosolic toxin i BFA-behandlade celler (bild 2, 3A). Således är ytterligare kontroll experiment som krävs när man använder denna metod för att undersöka potentiella block av toxin translokation. För vissa AB toxiner, minskning av en disulfide obligation som tjuder den katalytiska subenheten till sin holotoxin sker i ER 6, 40-43. Redox status En kedja kan därför användas som ett mått på toxin under transport till sjukhus 16, 18. Rekombinant gifter innehåller konsensus sekvensen för N-bundna glykosyleringsställen, en modifiering som initieras på akuten, har ocksåanvänds för att upptäcka toxin inträde i ER 12, 23, 44-46. Slutligen, som diskuterats ovan, alternativt protokoll inbegriper sam-translationell isättningen av toxin A-kedjan i ER lumen kan verifiera en hämmande effekt på translokation evenemanget. Till exempel visade vår SPR-baserade translokation analysen en funktionell roll för Hsp90 i CTA1 translokation som bekräftades med ett plasmid-baserat system som uttrycks CTA1 direkt i ER lumen 19.
A-kedjor av ER-translocating gifter uppvisar en stark arginin-over-lysin aminosyra partiskhet som gör att flyttas toxin att undgå ubiquitin-beroende proteasomal nedbrytning 47-50. Dock sker nedbrytning av cytosolic toxin fortfarande av en relativt långsam, ubiquitin-oberoende proteasomal mekanism 51, 52. Förhållanden som ökar proteasomal verksamheten skulle således kunna förvränga resultaten av vårt translokation analys genom att minska pool av flyttad toxin i cytosoliska FRAInsatser. Celler som utsätts för en proteasomhämmaren kan användas för att styra denna möjlighet, en ökning cytosoliskt toxin till följd av proteasomal hämning tyder giftet verkligen kunde nå cytosolen men var nedsatt före upptäckt.
Det bör noteras att dessa överväganden gäller för delmängder av de ovan nämnda alternativa strategier och är inte unika för vår metod. Som tidigare nämnts är den bästa strategin för att karakterisera translokation händelsen att använda en kombination av de välkontrollerade tekniker.
Kritiska steg och felsökning
Kemiskt preparat är ett kritiskt steg för analysen. Digitonin löser inte lätt, och det bör beredas på nytt för varje experiment. Likaså bör färska PBST användas för SPR analys. EDC: NHS aktivering buffert skall beredas omedelbart före användning, det kommer inte behålla aktiviteten om lagras efter blandning av de två lösningarna. However, separata alikvoter av EDC och NHS kan förvaras vid -80 ° C och tinas en gång före användning. Alla lösningar, inklusive prover, bör avgasade före injektion. Detta kommer att förhindra luft-induced spikar i SPR signal.
Den celltyp som ska användas för denna analys måste uttrycka tillräckligt toxin receptorer för att möjliggöra en detekterbar pool av toxin En kedja för att nå cytosolen. I vissa fall, till exempel förbehandling av HeLa celler med GM1 före CT utmaning, kan ytterligare toxin receptorer läggas till ytan av målceller. Den celltyp måste också vara mottagliga för selektiv permeabilization av plasmamembranet med digitonin. Protokollet beskrivs häri är effektivt med HeLa och CHO-celler, men andra celltyper kommer att kräva en optimering steg med Western blot-analys för att övervaka den rena separationen av organell och cytosola fraktioner. Vi följer rutinmässigt fördelningarna av proteindisulfidisomeras (ett lösligt protein ER) och Hsp90 (en cytosoliska protei) för detta ändamål 16-19. Den exklusiva uppdelningen av proteindisulfidisomeras i pelleten fraktionen 16-19 säkerställer också att de organeller som samlats in i membranet pellets är intakta. Detta är en viktig aspekt av vår metod, eftersom oavsiktlig brytning av intracellulära organeller skulle leda till fel i systemet genom att släppa endomembrane fritt toxinet till cytosoliska fraktion. SPR-baserade experiment kan också användas för att visa att cytosoliskt pool av toxin resultat från en translokation händelse snarare än från lys av intracellulära organeller. Till exempel var inget toxin påvisas i cytosolen i BfA-behandlade celler (bild 2, 3A) eller celler som utsätts för giftet för bara 15 minuter (bild 4). Likaså var det B-subenheten av CT inte registreras i cytosoliskt delen av avfallet efter en två timmars toxin exponering (Fig. 3B). Hade våra protokoll resulterade i permeabilization av interna membran, skulle vi ha upptäckt ett cytosoliskt pool av toxin för varje av ovannämnda villkor. Fastställande av rätt protokoll för reproducerbara, selektiv permeabilization av plasmamembranet sannolikt att representera de hastighetsbegränsande steget för analys genomförande. Andra alternativ för plasmamembranet permeabilization finns tillgängliga, men vi fann att digitonin vård jämnare resultat än andra metoder såsom behandling med streptolysin O.
Kvaliteten på antikroppar kommer också att avgöra hur känslig analysen, som kan fastställas med spädningar av ett toxin standard. Till exempel kan vi upptäcka reproducerbart så lite som 0,1 ng / ml av antingen PTS1 eller CTA standard (bild 2-6). Den anti-En kedja antikroppar skall inte redovisa den underavdelning toxin B och unintoxicated celler ska alltid användas som en kontroll för att säkerställa att antikroppen inte korsreagerar med proteiner i värdcellen. Preliminära experiment kommer att behöva för att optimera förutsättningarna för att strippa bundet toxin från antikroppar, eftersom detta kan varieraför olika anti-toxin antikroppar.
Vid övervakning av toxin translokation i förändrade cellulära villkor, bör toxinet standarder och cytosola fraktionen från obehandlad kontroll celler kompletteras för att passa förhållandena i den experimentella provet. Till exempel var CTA standarder och obehandlade cytosoliskt fraktionen från Figur 5 kompletteras med 1% DMSO för att matcha den slutliga drogen koncentrationen i cytosoliskt fraktionen från DMSO-behandlade celler. Detta eliminerar eventuella skillnader i SPR signaler som kan uppstå skillnader i den kemiska sammansättningen av insamlade fraktioner. Jämförelser mellan cytosoliskt och organell fraktioner skulle också kräva tillägg av 1% Triton X-100 till cytosoliskt fraktionen och standarder, eftersom detta rengöringsmedel används för att frigöra den membran-inneslutet toxin från organell fraktion för SPR upptäckt. Preliminära försök har visat förekomst av cytosolen inte ändrar den SPR svar toxin standarder,så det är inte nödvändigt att komplettera toxin standarder cytosolen från unintoxicated celler.
Antikropp riktad mot sensorn bilden kommer inte att uppstå om EDC: NHS aktivering lösning är gammal eller om bilden är isatt i instrumentet med guld nedåt. Med tanke på tillverkningsprocessen, kommer det att finnas en del plåt-till-plåt variationer som kan förhindra en korrekt EDC: NHS aktivering och därmed antikroppar fånga. Om antikropp riktad mot bilden är dålig, vilket framgår av ett svagt förhöjda RIU, kan en andra injektion sätta in mer av antikroppen på tallriken. Den RIU är en godtycklig enhet som varierar från ett experiment till en annan beroende på hur mycket anti-toxin antikropp deponeras på sensorn. Kommer dock på och utanför ligger konstant.
Det är bättre att använda en refraktometer med dubbla kammare kanaler genomblödning, som en kanal kan användas för experimentella provet och den andra kanalen kan användas för buffert Alone för att korrigera för eventuella baslinjen drift. När du använder en dubbel kammare instrument, se till att den anti-toxin antikroppar enbart läggs till en av de två kanalerna. Prover kommer sedan att gå igenom båda kanalerna. Med en enda kanal instrument, innebär ersättning för baslinjen drift samling av buffert enbart data från antikroppsförsedda bild före injektion av provet.
Före början av en SPR experiment, se till att sensorn bilden är satt tätt i instrumentet och alla kopplingar är säkra. Läckage till följd av dessa frågor kommer att generera luft spikar i insamlade data. Läckage kan också upptäckas genom frånvaron av avfall flöde, som alltid bör vara närvarande. Ett prov volym större än volymen för injektionsslinga är nödvändigt för att undvika luft spikar samt - till exempel använder vi 1-volymer mL prov med en 500 mikroliter injektionsslinga. En olämplig mängd immersionsolja på prismat kommer att förhindra baslinjen har stabiliserats signal. Andra frågor som rör driften av SPR instrumentet behandlas i Användarhandbok och tekniska meddelanden från Reichert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R01 AI073783 till K. Teter. Vi tackar Dr Shane Massey för att få hjälp i utvecklingen av subcellulära fraktionering protokoll och Helen Burress för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Ganglioside GM1 | Sigma-Aldrich | G7641 | |
| CTA | Sigma-Aldrich | C2398 | |
| PTS1 | List | 182 | |
| NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce, Thermo Scientific | 24500 | |
| EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22981 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135 | |
| PBST | Medicago | 09-8903-100 | |
| Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-80747 | |
| Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 | |
| Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-57639 | |
| Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC | |
| SPR sensor slides | Reichert | 13206060 | |
| Syringe pump | Cole-Parmer | 780200C |
References
- Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 1-24 (2002).
- Watson, P., Spooner, R. A. Toxin entry and trafficking in mammalian cells. Adv. Drug Deliv. Rev. 58, 1581-1596 (2006).
- Carbonetti, N. H. Pertussis toxin and adenylate cyclase toxin: key virulence factors of Bordetella pertussis and cell biology tools. Future Microbiol. 5, 455-469 (2010).
- Wernick, N. L. B., Chinnapen, D. J. -F., Cho, J. A., Lencer, W. I. Cholera toxin: an intracellular journey into the cytosol by way of the endoplasmic reticulum. Toxins. 2, 310-325 (2010).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Lencer, W. I. Entry of protein toxins into mammalian cells by crossing the endoplasmic reticulum membrane: co-opting basic mechanisms of endoplasmic reticulum-associated degradation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 300, 149-168 (2005).
- Lencer, W. I. Entry of cholera toxin into polarized human intestinal epithelial cells. Identification of an early brefeldin A sensitive event required for A1-peptide generation. J. Clin. Invest. 92, 2941-2951 (1993).
- Orlandi, P. A., Curran, P. K., Fishman, P. H. Brefeldin A blocks the response of cultured cells to cholera toxin. Implications for intracellular trafficking in toxin action. J. Biol. Chem. 268, 12010-12016 (1993).
- Sandvig, K., Prydz, K., Hansen, S. H., van Deurs, B. Ricin transport in brefeldin A-treated cells: correlation between Golgi structure and toxic effect. J. Cell. Biol. 115, 971-981 (1991).
- Sandvig, K., Prydz, K., Ryd, M., van Deurs, B. Endocytosis and intracellular transport of the glycolipid-binding ligand Shiga toxin in polarized MDCK cells. J. Cell Biol. 113, 553-562 (1991).
- van Deurs, B. Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. J. Cell Biol. 106, 253-267 (1988).
- Tam, P. J., Lingwood, C. A. Membrane cytosolic translocation of verotoxin A1 subunit in target cells. Microbiology. 153, 2700-2710 (2007).
- Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cell. Microbiol. 10, 1130-1139 (2008).
- Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Medaglia, M. V., Fisher, R. J. Protein-Protein Interactions. Golemis, E. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 255-272 (2002).
- Banerjee, T. Contribution of subdomain structure to the thermal stability of the cholera toxin A1 subunit. Biochemistry. 49, 8839-8846 (2010).
- Massey, S. Stabilization of the tertiary structure of the cholera toxin A1 subunit inhibits toxin dislocation and cellular intoxication. J. Mol. Biol. 393, 1083-1096 (2009).
- Taylor, M. A therapeutic chemical chaperone inhibits cholera intoxication and unfolding/translocation of the cholera toxin A1 subunit. PLoS ONE. 6, e18825-e18825 (2011).
- Taylor, M. Hsp90 is required for transfer of the cholera toxin A1 subunit from the endoplasmic reticulum to the cytosol. J. Biol. Chem. 285, 31261-31267 (2010).
- Donta, S. T., Beristain, S., Tomicic, T. K. Inhibition of heat-labile cholera and Escherichia coli enterotoxins by brefeldin A. Infect. Immun. 61, 3282-3286 (1993).
- Donta, S. T., Tomicic, T. K., Donohue-Rolfe, A. Inhibition of Shiga-like toxins by brefeldin. A. J. Infect. Dis. 171, 721-724 (1995).
- Nambiar, M. P., Oda, T., Chen, C., Kuwazuru, Y., Wu, H. C. Involvement of the Golgi region in the intracellular trafficking of cholera toxin. J. Cell. Physiol. 154, 222-228 (1993).
- Rapak, A., Falnes, P. O., Olsnes, S. Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 3783-3788 (1997).
- Xu, Y., Barbieri, J. T. Pertussis toxin-mediated ADP-ribosylation of target proteins in Chinese hamster ovary cells involves a vesicle trafficking mechanism. Infect. Immun. 63, 825-832 (1995).
- Yoshida, T., Chen, C. C., Zhang, M. S., Wu, H. C. Disruption of the Golgi apparatus by brefeldin A inhibits the cytotoxicity of ricin, modeccin, and Pseudomonas toxin. Exp. Cell Res. 192, 389-395 (1991).
- Godber, B. Direct quantification of analyte concentration by resonant acoustic profiling. Clin. Chem. 51, 1962-1972 (2005).
- Bernardi, K. M., Forster, M. L., Lencer, W. I., Tsai, B. Derlin-1 facilitates the retro-translocation of cholera toxin. Mol. Biol. Cell. 19, 877-884 (2008).
- Wernick, N. L., De Luca, H., Kam, W. R., Lencer, W. I. N-terminal Extension of the Cholera Toxin A1-chain Causes Rapid Degradation after Retrotranslocation from Endoplasmic Reticulum to Cytosol. J. Biol. Chem. 285, 6145-6152 (2010).
- Simpson, J. C. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS. Lett. 459, 80-84 (1999).
- Veithen, A., Raze, D., Locht, C. Intracellular trafficking and membrane translocation of pertussis toxin into host cells. Int. J. Med. Microbiol. 290, 409-413 (2000).
- Castro, M. G., McNamara, U., Carbonetti, N. H. Expression, activity and cytotoxicity of pertussis toxin S1 subunit in transfected mammalian cells. Cell. Microbiol. 3, 45-54 (2001).
- Schmitz, A., Herrgen, H., Winkeler, A., Herzog, V. Cholera toxin is exported from microsomes by the Sec61p complex. J. Cell Biol. 148, 1203-1212 (2000).
- Teter, K., Allyn, R. L., Jobling, M. G., Holmes, R. K. Transfer of the cholera toxin A1 polypeptide from the endoplasmic reticulum to the cytosol is a rapid process facilitated by the endoplasmic reticulum-associated degradation pathway. Infect. Immun. 70, 6166-6171 (2002).
- Winkeler, A., Godderz, D., Herzog, V., Schmitz, A. BiP-dependent export of cholera toxin from endoplasmic reticulum-derived microsomes. FEBS Lett. 554, 439-442 (2003).
- Yu, M., Haslam, D. B. Shiga toxin is transported from the endoplasmic reticulum following interaction with the luminal chaperone HEDJ/ERdj3. Infect. Immun. 73, 2524-2532 (2005).
- LaPointe, P., Wei, X., Gariepy, J. A role for the protease-sensitive loop region of Shiga-like toxin 1 in the retrotranslocation of its A1 domain from the endoplasmic reticulum lumen. J. Biol. Chem. 280, 23310-23318 (2005).
- Teter, K., Jobling, M. G., Sentz, D., Holmes, R. K. The cholera toxin A13 subdomain is essential for interaction with ADP-ribosylation factor 6 and full toxic activity but is not required for translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Infect. Immun. 74, 2259-2267 (2006).
- Redmann, V. Dislocation of ricin toxin a chains in human cells utilizes selective cellular factors. J. Biol. Chem. 286, 21231-21238 (2011).
- Yamaizumi, M., Mekada, E., Uchida, T., Okada, Y. One molecule of diphtheria toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell. Cell. 15, 245-250 (1978).
- Bellisola, G. Reductive activation of ricin and ricin A-chain immunotoxins by protein disulfide isomerase and thioredoxin reductase. Biochem. Pharmacol. 67, 1721-1731 (2004).
- McKee, M. L., FitzGerald, D. J. Reduction of furin-nicked Pseudomonas exotoxin A: an unfolding story. Biochemistry. 38, 16507-16513 (1999).
- Orlandi, P. A. Protein-disulfide isomerase-mediated reduction of the A subunit of cholera toxin in a human intestinal cell line. J. Biol. Chem. 272, 4591-4599 (1997).
- Spooner, R. A. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and B chains in the endoplasmic reticulum. Biochem. J. 383, 285-293 (2004).
- Fujinaga, Y. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol. Biol. Cell. 14, 4783-4793 (2003).
- Guerra, L. Cellular internalization of cytolethal distending toxin: a new end to a known pathway. Cell. Microbiol. 7, 921-934 (2005).
- Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. J. Biol. Chem. 272, 19554-19561 (1997).
- Deeks, E. D. The low lysine content of ricin A chain reduces the risk of proteolytic degradation after translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Biochemistry. 41, 3405-3413 (2002).
- Hazes, B., Read, R. J. Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Biochemistry. 36, 11051-11054 (1997).
- Rodighiero, C., Tsai, B., Rapoport, T. A., Lencer, W. I. Role of ubiquitination in retro-translocation of cholera toxin and escape of cytosolic degradation. EMBO Rep. 3, 1222-1227 (2002).
- Worthington, Z. E., Carbonetti, N. H. Evading the proteasome: absence of lysine residues contributes to pertussis toxin activity by evasion of proteasome degradation. Infect. Immun. 75, 2946-2953 (2007).
- Pande, A. H., Moe, D., Jamnadas, M., Tatulian, S. A., Teter, K. The pertussis toxin S1 subunit is a thermally unstable protein susceptible to degradation by the 20S proteasome. Biochemistry. 45, 13734-13740 (2006).
- Pande, A. H. Conformational instability of the cholera toxin A1 polypeptide. J. Mol. Biol. 374, 1114-1128 (2007).
