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Immunology and Infection

La detección de la translocación de la toxina en el citosol de host de resonancia de plasmones superficiales

Published: January 3, 2012 doi: 10.3791/3686
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Microbiology, University of Central Florida

Summary

En este informe, se describe cómo resonancia de plasmones superficiales se utiliza para detectar la entrada de toxinas en el citosol de acogida. Este método altamente sensible puede proporcionar datos cuantitativos sobre la cantidad de toxina citosólica, y puede ser aplicado a una serie de toxinas.

Abstract

Toxinas AB consisten en una subunidad enzimática y una subunidad de unión celular B 1. Estas toxinas son secretadas en el medio extracelular, sino que actúan sobre los objetivos en el citosol eucariota. Algunas toxinas AB viaje por las compañías de vesículas en la superficie celular en el retículo endoplásmico (RE) antes de entrar en el citosol 2-4. En la sala de emergencias, el catalizador se disocia una cadena del resto de la toxina y se mueve a través de un canal proteico-llevar a cabo para alcanzar su objetivo citosólico 5. La translocación, citosólica Una cadena es difícil de detectar porque el tráfico de la toxina a la sala de emergencia es un proceso extremadamente ineficiente: la toxina más interiorizado se dirige a los lisosomas para la degradación, por lo que sólo una pequeña fracción de la superficie con destino toxina alcanza el aparato de Golgi y RE 6 -12.

Para controlar la translocación de la toxina de la sala de emergencias para el citosol de las células en cultivo, se combinó un protocolo de fraccionamiento subcelular con los highly método de detección sensible de resonancia de plasmones superficiales (SPR) 13-15. La membrana plasmática de las células de toxinas es tratada de forma selectiva permeabilizadas con digitonina, logrando la recolección de una fracción citosólica, que posteriormente se perfunde en un sensor de SPR recubierto con una toxina anti-un anticuerpo de cadena. El sensor recubiertas de anticuerpos puede capturar y detectar pg / mL cantidades de la toxina del citosol. Con este protocolo, es posible seguir la cinética de entrada de la toxina en el citosol y caracterizar los efectos inhibitorios en el caso de desplazamiento. La concentración citosólica de la toxina también puede ser calculada a partir de una curva estándar generada con cantidades conocidas de una cadena de normas que han sido perfundidos sobre el sensor. Nuestro método consiste en un sistema rápido, detección sensible, cuantitativa y que no requiere marcaje radiactivo u otras modificaciones a la toxina de destino.

Protocol

1. Preparación de digitonina

  1. Añadir 500 l de etanol al 100% a un tubo de microcentrífuga y lo coloca en un bloque de calor fijado en 80 ° C durante 10 min.
  2. Disolver 2,5 mg de digitonina en 250 l de etanol se calienta para producir una solución de reserva del 1% de digitonina.
  3. Para generar una solución de trabajo de 0,04% digitonina, agregar 40 ml de la solución madre digitonina a 960 L de HCN buffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM de N-ethylmaleimide, y un inhibidor de la proteasa cóctel).

2. Intoxicación celular y permeabilización

Nuestro ensayo de translocación se puede aplicar a una serie de toxinas y líneas celulares. A continuación, ofrecemos un protocolo detallado para la detección de la toxina del cólera (CT). Una visión general del procedimiento está previsto en la Figura 1.

  1. Las células HeLa se siembran en placas de 6 pocillos con 1 ml de DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y antibióticos antimicóticos-para lograr 1x10 6 células / pocillo después de una noche de incubación a 37 ° C. Para generar la toxina suficiente citosólica para la detección reproducible, tres pozos son necesarios para cada condición.
  2. Después de una incubación durante la noche, sustituir el medio de cultivo con 1 ml de DMEM que contenía 100 ng / mL de gangliósido GM1. Esto aumenta el número de sitios de unión para la TC, como el receptor GM1 de la TC se intercalan en la membrana plasmática de las células expuestas a una solución de GM1.
  3. Después de una incubación de 1 hora a 37 ° C, se elimina el medio GM1 que contienen y se lavan las células dos veces con DMEM. Luego, coloque las células a 4 º C durante 30 minutos en 1 ml de DMEM que contenía 1 mg / ml de CT.
  4. Eliminar el medio que contiene la toxina, se lavan las células dos veces con DMEM y se incuban las células en 1 ml de DMEM a 37 ° C para el intervalo de tiempo deseado (s).
  5. Al final de cada período de persecución, se lavan las células con PBS e incubar cada pocillo con 250 l de 0,5 mM EDTA en PBS. Deje que las células reposar por 10 min a temperatura ambiente y luego sacarlos de la placa de 6 pocillos por trituración vigorosa con un p1000 Pipetman. Después de un pocillo de células que se ha recogido, que se combinan con la segunda y tercera, luego, de la misma condición. Raspadores de células también puede ser utilizado para recoger las células.
  6. Lugar la suspensión de células combinadas de los tres pozos de replicar (750 l volumen total) en un tubo de microcentrífuga sola, y lo hace girar en una microcentrífuga de mesa durante 5 minutos a 5.000 x g. Gránulos de las células de un tamaño más o menos equivalente se debe obtener para todas las condiciones.
  7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 100 L de la solución 0,04% de trabajo de digitonina. Lugar la suspensión de células en hielo durante 10 min.
  8. Giro de las células digitonina permeabilized a 16.000 xg durante 10 minutos en una microcentrífuga de mesa. Transferir el sobrenadante citosol que contiene a un tubo de microcentrífuga nuevo, y retener la fracción orgánulos que contienen pellets.
título "> 3. Preparación de la muestra

  1. Citosol que contiene fracciones sobrenadante se diluyen en un tampón de HCN a un volumen final de 1 mL. Volúmenes de muestra de al menos 1 ml son necesarias para asegurar el aire se purga del circuito de muestra de 500 l antes de la inyección.
  2. Orgánulos que contienen fracciones de pellet se resuspendió en 1 ml de tampón de HCN contiene un 1% Triton X-100. Además de detergente es necesario liberar la piscina revestida de membrana de la toxina.
  3. Normas de la toxina en concentraciones de 100, 10, 1 y 0,1 ng / ml se preparan en un tampón de HCN.
  4. Paralelos de las fracciones citosólica y orgánulos están preparados para un experimento de control para confirmar la fidelidad de los procedimiento de fraccionamiento. Fracciones generadas como se describe en la Sección 2 se resuspendió en 20 l de tampón de muestra de 4x (fracción citosólica) o 120 l de tampón de muestra 1x (fracción orgánulo). Volúmenes equivalentes de cada fracción se resolvieron por electroforesis en gel de sodio dodecil sulfato de poliacrilamida y probaron by análisis de Western blot para demostrar la partición de una proteína citosólica en el sobrenadante y una proteína soluble, residente de ER en la fracción de pellets 16-19.

4. SPR preparación de los portaobjetos

  1. El refractómetro Reichert SR7000 SPR se usa para los experimentos de SPR.
  2. Establecer un portaobjetos de vidrio dorado con una monocapa auto-ensambladas en el instrumento de SPR. Para activar el sensor de diapositivas, perfundir una relación 1:1 (v: v) de 0,4 M y 0,1 EDC NHS M sobre el portaobjetos durante 10 minutos con un caudal de 41 l / min. Todas las perfusiones siguientes utilizarán el mismo caudal.
  3. Para quitar la EDC: tampón de activación del SNS, se lava la placa durante 5 min con PBS que contenía 0,05% de Tween 20 (PBST). La placa contiene ahora los amarres reactiva amida debido a destapar por la EDC: solución de NHS.
  4. Perfundir un anticuerpo anti-CTA sobre la diapositiva activa el sensor a una dilución de 1:20.000 en acetato de sodio 20 mM (pH 5,5) durante 15 min. Una caída inicial de la refracción endex unidad (RIU) será visto por el cambio de pH. Esto será seguido por un aumento en el RIU, como el anticuerpo es capturado por las cuerdas amida-reactiva en la diapositiva sensor.
  5. Eliminar el anticuerpo no unido a partir de la diapositiva del sensor con un lavado PBST 5 minutos. La señal producida por el RIU anticuerpos capturados se estabilizará y estabilizar, que proporciona una señal nueva línea de base.
  6. Perfundir 1 M etanolamina (pH 8,5) sobre el portaobjetos sensor de 5 min. Este tapas e inactiva los amarres no unido a la izquierda en la diapositiva sensor.

5. SPR análisis de las muestras

  1. Para establecer una lectura de referencia, PBST perfundir sobre el sensor recubiertas de anticuerpos durante 5 min.
  2. Perfundir una muestra experimental o estándar de la toxina sobre el sensor de 300 seg. Quitar el ligando del búfer y PBST perfundir sobre el sensor para otro sec 200.
  3. Después de cada perfusión, la toxina se elimina obligado desde el sensor de un lavado de 100 segundos con PBST a pH 5,0. Esto devolverá la señalen su lectura inicial de referencia, permitiendo así que otra muestra que se procesa en el mismo sensor.
  4. Antes de cargar una nueva muestra, empujar una pequeña cantidad de aire a través del bucle de muestra para expulsar el líquido residual de la muestra anterior. Utilizando el procedimiento descrito en 5.2 a 5.4, hemos llevado a cabo hasta 12 muestras en una diapositiva sin pérdida sustancial de la señal de referencia.
  5. El análisis de datos se realiza con el Scrubber 2 software y el software de Igor se utiliza para la preparación de la figura.

6. Resultados representante

La toxina pertussis (PT) es una toxina AB que se mueve de la superficie de la célula a la sala de emergencias antes de que una cadena (PTS1) entra en el citosol 3, 12. Como se muestra en la Figura 2, nuestro SPR-ensayo basado en la translocación podría detectar PTS1 en el citosol de las células CHO intoxicado. No hay señal fue generada desde el citosol de las células unintoxicated, que confirmó el anticuerpo anti-PTS1 no tienen reacción cruzada con un componente de la citosol de acogida. Lafracción citosólica de las células de embriaguez en la presencia de brefeldin A (BFA) también logró producir una señal positiva. BfA impide el transporte de toxinas en el sitio translocación ER 06.08, 12, 20-25 y, por tanto, una cadena de suministro para el citosol. Al final de cada carrera, la toxina obligado es despojado de la diapositiva del sensor. Esto permite múltiples muestras que se proyectarán en una diapositiva de un solo sensor y por lo tanto proporciona una comparación directa entre los resultados obtenidos con diferentes condiciones experimentales.

CT es otro tipo AB, ER-translocación de la toxina 4. En la Figura 3A, CTA1 se detectó en la fracción citosólica de CT tratados con células HeLa. Esto puso de relieve que nuestra metodología funciona con múltiples tipos de células y se puede aplicar a cualquier toxina que un anti-anticuerpo de cadena A está disponible. No se detectó señal cuando la fracción citosólica de la CT-células tratadas fue perfundido en un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTB (Fig. 3B), lo que demuestra que la CTA1subunidad de la célula, pero no vinculante CTB pentámero entra en el citosol. Figura 3C muestra la señal de la fracción orgánulo está fuera de escala en comparación con la señal más débil de la fracción citosólica. Esto fue consistente con la ineficiencia de los CT conocidos de transporte al sitio de translocación ER 6, 7, que a su vez limita la cantidad de toxina que puede alcanzar el citosol. Por otra parte, la fracción organelo contiene holotoxina CT, así como ER-localizada CTA1, por lo que la señal resultante SPR para la fracción orgánulo está inflado por el peso adicional del pentámero holotoxina asociada CTB. Por lo tanto, no es práctico para representar gráficamente los datos de las fracciones citosólica y orgánulos en el sensorgram mismo.

Nuestro ensayo se puede controlar la acumulación en función del tiempo de la toxina trasladadas, citosólica (Fig. 4). Las células fueron expuestas a la TC a 4 ° C, una temperatura que permita unión a la toxina a la membrana plasmática, pero impide la internalización de la toxina asociada a las células. Después de que el removalores de la toxina no consolidados, las células se calentaron a 37 º C. Tanto el transporte de toxinas a la sala de emergencia y un desplazamiento de la cadena hasta el citosol puede ocurrir a esta temperatura. No se detectó la toxina en el citosol de 15 minutos después del calentamiento a 37 º C. Esto refleja el tiempo de espera necesario para el tráfico de holotoxina (i) a la sala de emergencias, (ii) A / disociación subunidad B de la sala de emergencia, y (iii) Una cadena de exportación al citosol. Un grupo de menores de la toxina citosólica se detectó después de 30 minutos a 37 ° C, y las cantidades cada vez mayores de la toxina citosólica se detectaron después de los 45 y 60 minutos de intervalo persecución. Mayores niveles de toxina citosólica se detectaron después de un intervalo de 5 horas 17 persecución, lo que demuestra un continuo, a largo plazo de entrega de células asociadas a la toxina en el citosol de acogida.

Nuestro análisis también puede detectar la inhibición de la translocación de la toxina en el citosol (Fig. 5). Las células tratadas con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), un acompañante químico que impide la trast térmicaEring de los aislados CTA1 subunidad (T. Banerjee y Teter K., observaciones no publicadas), mostraron bajos niveles de CTA1 citosólica en comparación con las células control sin tratar. Desarrollo de la toxina de la cadena es un requisito previo para la translocación al citosol 16-18, por lo que la estabilización de DMSO inducida de CTA1 en consecuencia impide su traslado desde la sala de emergencias en el citosol.

La tasa constante de asociación (k a) calculado a partir de experimentos de SPR es directamente proporcional a la concentración del ligando en el buffer de la perfusión de 14, 15, 26. Por lo tanto, es posible determinar la concentración citosólica de la toxina de un gráfico que representa los valores de k una de las normas de la toxina en función de la concentración de toxinas. Este procedimiento se utilizó para cuantificar el bloque de DMSO inducida por la translocación de la toxina se presenta en la Figura 5: la curva estándar generada a partir de concentraciones conocidas de la toxina se utilizó para calcular una citosólica concen CTA1ion de 0,3 ng / ml para las células no tratadas y 0,1 ng / mL de DMSO células tratadas (Fig. 6). La inhibición de la CTA1 desarrollo de DMSO por lo tanto genera una reducción de 3 veces en la translocación de ER-a-citosol de CTA1.

Figura 1
Figura 1. Descripción general del protocolo. (A) Las células se incubaron con la toxina AB a 4 ° C, una temperatura que permita la toxina unión a la superficie celular, pero evita que la endocitosis de toxinas. Las subunidades A y B de la toxina están representados por círculos rojos y azules, respectivamente. (B) Sin consolidar, la toxina se elimina de la media, y las células se calientan a 37 ° C con el fin de promover el transporte retrógrado de la endocitosis y la holotoxina a la sala de emergencias. Holotoxina disociación ocurre en la sala de emergencias, que permite que el aislado una cadena para entrar en el citosol por la que pasa a través de un canal proteico-realización (s) en la membrana del ER. (C) Las células se tratan con digitonina con el fin de permeabilizar selectivamente el plasmamembrana. (D) La centrifugación se utiliza para dividir las células en distintas fracciones citosólica y orgánulos. El citosol es expulsado de la célula a través de los poros digitonina generado y se encuentra en el sobrenadante. El intacta, unidas a la membrana orgánulos se encuentran en la fracción de pellets. (E) Para detectar la piscina trasladadas de la toxina de la cadena en el citosol de acogida, la fracción sobrenadante se perfunde en un sensor de SPR recubierto con un anticuerpo anti-A de la cadena.

Figura 2
Figura 2. Detección de PTS1 translocación en el citosol de acogida. Las células CHO se pulso-marcados a 4 º C durante 30 minutos con 1 mg / ml de PT. Las células fueron perseguidos después de 3 horas a 37 ° C en un medio libre de toxinas que no contiene adiciones (intoxicado) o 5 mg BfA / mL (+ BfA intoxicado). Permeabilización de la membrana plasmática con digitonina se utilizó para los extractos de células partición en distintas organelas y fracti citosólicaComplementos. Un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-PTS1 se utilizó para detectar la piscina citosólica de PTS1 de las células no tratadas o tratadas BfA. PTS1 normas fueron perfundidos en el sensor como controles positivos, mientras que la fracción citosólica de las células unintoxicated fue perfundido sobre la diapositiva sensor como control negativo. Al final de cada ejecución, muestra unida se despojó de la diapositiva del sensor.

Figura 3
Figura 3. Detección de CTA1 translocación en el citosol de acogida. Las células HeLa pulso-marcados a 4 º C con 1 mg / ml de CT fueron perseguidos durante 2 horas a 37 ° C en un medio libre de toxinas que no contiene adiciones (intoxicado) o 5 mg BfA / mL (+ BfA intoxicado). Permeabilización de la membrana plasmática con digitonina se utilizó para los extractos de células partición en distintas organelas y las fracciones citosólica. (A) Las fracciones citosólicas fueron perfundidos por un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. Conocidocantidades de CTA se utilizaron como controles positivos, mientras que el citosol de las células unintoxicated se utilizó como control negativo. (B) La fracción citosólica de las células de embriaguez en la ausencia de BfA se perfundió sobre un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTB. A purificada CTB pentámero se perfundió sobre la diapositiva como un control positivo. (C) La fracción orgánulo se solubilizó con 1% de Triton X-100 antes de la perfusión en un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. A efectos comparativos, la fracción citosólica (1 ml de volumen final) a partir del extracto misma celda y un estándar de CTA fueron perfundidos también sobre el sensor. Para todos los paneles, la muestra unida se despojó del sensor al final de cada carrera.

Figura 4
Figura 4. Cinética de CTA1 entrada en el citosol. Células HeLa pulso-marcados a 4 º C con 1 mg / ml de CT fueron perseguidos durante 15, 30, 45 o 60 min a 37 ° C en el libre de toxinas medium. Para detectar la piscina trasladadas de la toxina, las fracciones citosólica de digitonina permeabilized células fueron perfundidos por un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. Normas CTA fueron perfundidos en el sensor también. Al final de cada ejecución, muestra unida se despojó de la diapositiva del sensor.

Figura 5
Figura 5. La inhibición de la translocación de CTA1 DMSO. Las células HeLa pulso-marcados a 4 º C con 1 mg / ml de CT fueron perseguidos durante 2 horas a 37 ° C en un medio libre de toxinas que no contiene adiciones (intoxicado) o DMSO al 10% (+ DMSO intoxicado). Para detectar la piscina trasladadas de la toxina, las fracciones citosólica de digitonina permeabilized células fueron perfundidos por un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. Normas CTA (100, 10, 1 y 0,1 ng / ml) fueron perfundidos en el sensor como controles positivos y sólo el 1 y 0,1 ng / mL normas se muestra para fines de escala. El citosol de unintoxicated células se utilizó como control negativo. Al final de cada ejecución, muestra unida se despojó de la diapositiva del sensor.

Figura 6
Figura 6. Cálculo de citosólicas CTA1. K uno de los valores de los estándares de la CTA en la Figura 5 se representa en función de la concentración de la toxina. La curva resultante estándar se utilizó para determinar, en base a los valores de k una de las muestras experimentales de la Figura 5, la concentración citosólica de CTA1 en las células sin tratar y tratados con DMSO. Normas de la toxina se presentan como círculos rellenos; el citosol sin tratar se presenta como una plaza abierta, y el citosol tratado con DMSO se presenta como un círculo abierto. Los promedios ± intervalos de dos experimentos independientes se muestran.

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Discussion

Comparación con la metodología vigente

Nuestra SPR-ensayo basado en la translocación representa un método rápido, sensible y cuantitativo para detectar la entrega toxina en el citosol de acogida. La técnica no requiere marcaje radiactivo u otras modificaciones a la toxina, y puede ser aplicado a cualquier toxina que un anti-toxina anticuerpo de cadena está disponible. Los métodos existentes para controlar el paso de toxinas en el citosol también se basan en un protocolo de fraccionamiento subcelular de extractos de células de partición en el citosol por separado y fracciones de membrana 11, 23, 27, 28. Estos métodos utilizan Western blot o radioactivas para detectar la piscina citosólica de la toxina. El primer enfoque es semi-cuantitativo en el mejor y padece una sensibilidad relativamente baja. Incluso los protocolos de marcaje radiactivo puede tardar semanas para generar un resultado, debido a los bajos niveles de toxinas que llegan al citosol. Mientras que el análisis cuantitativo con una toxina radiomarcada puede determinar el porcentaje relativode células asociadas a la toxina que entra en el citosol, este enfoque no puede determinar directamente el número exacto de moléculas de toxina citosólica. Al comparar la sensibilidad de la detección de toxinas SPR para la detección de la toxina radiomarcada tanto, es problemática, ya que la cantidad de toxina citosólica se puede calcular por SPR, pero no por radiomarcaje.

Otros ensayos translocación evitar las medidas de toxinas arriba el tráfico y entregar la toxina de la cadena directamente a la sala de emergencia utilizando el plásmido basado en sistemas de expresión o de transcripción in vitro / sistemas de traducción 29-38. Para cualquier método, una secuencia de señal amino-terminal de la cadena de los objetivos de una co-translacional de importación en el lumen del RE. Exportación de la síntesis de una cadena de la sala de emergencias es detectado por fraccionamiento subcelular, la centrifugación diferencial, la actividad de la toxina en el citosol de degradación, proteasomal de la toxina trasladadas, y / o una modificación de la toxina citosólica específica. Subconjuntos de estos enfoques paracus únicamente en el caso de desplazamiento, se puede utilizar en los experimentos de reconstitución in vitro, y producen niveles elevados de la toxina para la detección y estudios de co-immunoprecipitation. Sin embargo, las metodologías no se puede determinar la cinética o la eficiencia de la prestación de la toxina de la superficie de la célula al citoplasma. También es posible que la trasladaron Una cadena no entra en la sala de emergencia en el estado de la conformación misma de la holotoxina entregadas en una cadena. Otros aspectos de las interacciones huésped-toxina no se encuentran en estos procedimientos, como el caso de A / B disociación. Por lo tanto, hay fortalezas y debilidades a la translocación de vigilancia con una cadena que se sintetizan directamente en la sala de emergencias.

Translocación de la toxina se detecta a menudo a través de ensayos de la intoxicación. El efecto citotóxico o citopático generado por la toxina exógena aplicada demuestra la toxina de la cadena ha alcanzado su objetivo citosólica. Obviamente, esta es una medida indirecta de la translocación de la toxina que controla unctividad en el citosol y no la presencia física de la toxina del citosol. Por lo tanto, la técnica no puede cuantificar los niveles de toxina citosólica ni detectar directamente el procesamiento alterado de la toxina trasladadas. También hay escenarios en los que existe una correlación directa entre los niveles de toxina citosólica y la actividad de la toxina no existen, como la posible necesidad de un umbral de concentración de la toxina citosólica de inducir una respuesta celular o cuando la actividad de la toxina produce una respuesta celular saturada. Sin embargo, los ensayos de la intoxicación puede proporcionar una correlación funcional a los ensayos que directamente documentar el evento translocación. Anteriormente hemos utilizado esta estrategia para demostrar la inhibición de una translocación de la cadena corresponde a una inhibición de la intoxicación celular 17-19.

En resumen, existen varios métodos para detectar la toxina de entrega al citosol. Nuestro enfoque basado en SPR tiene la ventaja de proporcionar resultados rápidos, sensibles y cuantitativos. El dATA también se puede complementar con experimentos utilizando una de las estrategias mencionadas más para generar una conclusión más firme.

Las aplicaciones futuras

Nuestro método sin etiqueta para la detección y cuantificación de toxinas citosólica proporciona a los investigadores la flexibilidad para hacer frente a muchas cuestiones pendientes en relación con la biología celular de la intoxicación. Por ejemplo, es posible establecer la eficiencia de una cadena de suministro al citosol mediante el cálculo del porcentaje de superficie con destino toxina que llega al citosol. También es posible cuantificar la cantidad total de la toxina citosólica y, por extensión, el número de moléculas de toxina citosólico por la célula. Se cree que una molécula de la toxina diftérica citosólica es suficiente para producir una completa citopático / citotóxicos efecto 39, este modelo ya se puede probar con otras toxinas con nuestro ensayo de translocación y ensayos correlativos intoxicación. Por lo tanto, nuestro ensayo SPR basados ​​should ser capaz de determinar cuántas moléculas de toxina citosólicas son necesarios para la intoxicación productivo. Nuestra técnica puede también seguir la persistencia de la toxina del citosol. Degradación sustancial de la translocación Una cadena que limitar y reducir posiblemente la concentración citosólica con el tiempo, lo que implicaría a los efectos de la intoxicación podría ser revertido si una cadena de acceso al citosol se restringió después de la exposición a un tóxico inicial. Además, el medio extracelular y el pellet de membrana de células intoxicadas pueden ser utilizados para rastrear la cantidad de toxina secretada o toxina que residen en el sistema de endomembranas, respectivamente. Los estudios comparativos de la toxina extracelular, endomembranas-localizada, y citosólica se puede utilizar para examinar cómo la biología celular de la intoxicación varía para diferentes ER-translocación de toxinas. Nuestro análisis también se puede utilizar para analizar los factores celulares específicos de toxina necesaria para el evento de desplazamiento 19. Debe ser posible adaptar nuestra metodología para realizar un seguimientola translocación endosoma a citosol de otras toxinas AB como el factor letal del ántrax y la toxina de la difteria. Por último, la entrada del virus en el citosol de acogida, posiblemente, podrían ser controlados con un procedimiento experimental similar.

Limitaciones

Condiciones que impiden el tráfico de la toxina a la sala de emergencias también impedir la entrega de toxina en el citosol. Esto fue demostrado por la ausencia de la toxina en el citosol de las células tratadas BfA (Figs. 2, 3A). Así, los experimentos de control adicionales son necesarios cuando se utiliza este método para examinar los bloques potenciales de la translocación de toxinas. Para algunas toxinas AB, la reducción de un puente disulfuro que ata la subunidad catalítica de la holotoxina ocurre en la sala de urgencias 6, 40-43. El estado redox de la cadena A consecuencia puede ser utilizado como una medida del transporte de la toxina a la sala de emergencias 16, 18. Toxinas recombinantes que contienen la secuencia consenso de N-glicosilación, una modificación que se inicia en la sala de emergencia, también se hanutiliza para detectar la entrada de toxinas en la sala de emergencias 12, 23, 44-46. Finalmente, como se los protocolos anteriores, alternativas implican co-translacional inserción de la toxina de la cadena en el lumen del RE se puede comprobar un efecto inhibitorio en el caso de desplazamiento. Por ejemplo, nuestro SPR-ensayo basado en la translocación demostrado un papel funcional para la Hsp90 en CTA1 translocación que se confirmó con un sistema basado en plásmidos que expresaban CTA1 directamente en el lumen del RE 19.

A las cadenas de ER-translocación de toxinas presentan una fuerte sobre-arginina-lisina sesgo de aminoácidos que permite que la toxina trasladadas a evadir la ubiquitina-dependiente de la degradación proteasomal 47-50. Sin embargo, la degradación de la toxina citosólica se sigue produciendo a un ritmo relativamente lento, ubiquitina proteasomal mecanismo independiente de 51, 52. Las condiciones que aumentan la actividad proteasomal podría por lo tanto alteran los resultados de nuestro ensayo desplazamiento mediante la reducción de la piscina de la toxina trasladadas en el fra citosólicacción. Las células expuestas a un inhibidor del proteasoma puede ser utilizado para el control de esta posibilidad, un aumento de la toxina citosólica resultantes de la inhibición proteasomal indicaría que la toxina podría de hecho llegar al citosol, pero fue degradado antes de la detección.

Cabe señalar que estas consideraciones se aplican a los subconjuntos de los enfoques alternativos antes mencionados y no son exclusivas de nuestro método. Como se mencionó anteriormente, la mejor estrategia para caracterizar el evento translocación es utilizar una combinación de técnicas bien controladas.

Los pasos críticos y resolución de problemas

Preparación química es un paso crítico para el ensayo. Digitonina no se disuelve fácilmente, y hay que prepararse de nuevo para cada experimento. Del mismo modo, PBST fresco debe ser utilizado para el análisis de SPR. La EDC: tampón de activación del SNS debe prepararse inmediatamente antes de su uso, no va a mantener la actividad, si se almacena después de mezclar las dos soluciones. However, alícuotas separadas de la EDC y el NHS pueden ser almacenadas a -80 ° C y descongelado una vez antes de su uso. Todas las soluciones, incluidas las muestras, deben ser de-cámaras de gas antes de la inyección. Esto evitará que el aire inducida por los picos de la señal de SPR.

El tipo de célula que se utilizarán para este ensayo debe expresar los receptores de la toxina suficiente para permitir que un grupo de detectar la toxina de la cadena para llegar al citosol. En algunos casos, como el pre-tratamiento de las células HeLa con GM1 antes de la exposición CT, los receptores de la toxina adicional se puede agregar a la superficie de las células diana. El tipo de células también debe ser susceptible a la permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina. El protocolo se describe en este documento es efectiva con células HeLa y CHO, pero otros tipos de células requiere un paso de optimización mediante el análisis de Western blot para controlar la separación limpia del orgánulo y las fracciones citosólica. Nosotros habitualmente siguen la distribución de la proteína isomerasa disulfuro (una proteína soluble en ER) y Hsp90 (una prote citosólicain) para este propósito 16-19. La partición exclusiva de proteína disulfuro isomerasa en la fracción de pellets 16-19 también se asegura de que los orgánulos recogidos en el sedimento de membrana están intactos. Este es un aspecto fundamental de nuestro método, como la ruptura accidental de organelos intracelulares que introducir errores en el sistema mediante la liberación de endomembranas restringida toxina en la fracción citosólica. SPR basados ​​en experimentos también se puede utilizar para demostrar que la piscina citosólica de los resultados de la toxina de un evento de desplazamiento y no de la lisis de las organelas intracelulares. Por ejemplo, no se detectó la toxina en el citosol de las células tratadas con BfA (Figs. 2, 3A) o las células expuestas a la toxina de tan sólo 15 minutos (Fig. 4). Del mismo modo, la subunidad B de la TC no se detectó en la fracción citosólica después de una exposición a toxinas dos horas (Fig. 3B). Tenía el protocolo dio lugar a la permeabilización de membranas internas, que se han detectado una piscina citosólica de la toxina por cada una de las Aforecondiciones mencionadas. Establecer el protocolo apropiado para la permeabilización reproducible, selectiva de la membrana plasmática es probable que represente el paso limitante para la ejecución del ensayo. Otras opciones para la permeabilización de la membrana de plasma están disponibles, pero hemos encontrado que el tratamiento digitonina proporcionan resultados más consistentes que otros métodos como el tratamiento con estreptolisina O.

La calidad de los anticuerpos también se determinará la sensibilidad de la prueba, que se puede establecer con diluciones seriadas de un estándar de la toxina. Por ejemplo, podemos reproducible puede detectar tan poco como 0,1 ng / mL de PTS1 o CTA estándar (Figs. 2-6). El anti-un anticuerpo de cadena no debe reconocer la subunidad B de la toxina, y las células unintoxicated siempre debe ser utilizado como un control para asegurarse de que el anticuerpo no tiene reacción cruzada con las proteínas en la célula huésped. Los experimentos preliminares se necesita para optimizar las condiciones para la extracción de toxinas obligados del anticuerpo, ya que esto puede variarpara diferentes anticuerpos anti-toxina.

Al supervisar la translocación de toxinas bajo condiciones alteradas celular, las normas de la toxina y de la fracción citosólica de las células de control sin tratamiento deben complementarse para que coincida con las condiciones de la muestra experimental. Por ejemplo, las normas de la CTA y la fracción citosólica tratada en la Figura 5 se complementaron con DMSO al 1% para que coincida con el final de la concentración del fármaco en la fracción citosólica de las células tratadas con DMSO. Esto elimina las posibles diferencias en las señales de SPR que pudieran derivarse de diferencias en la composición química de las fracciones recogidas. Las comparaciones entre las fracciones citosólica y orgánulos también se requiere la adición de 1% de Triton X-100 a la fracción citosólica y las normas, ya que el detergente se utiliza para liberar la toxina a la membrana revestida de la fracción orgánulo para la detección de SPR. Los experimentos preliminares han demostrado la presencia de citosol no altera la respuesta de SPR a las normas de la toxina,por lo que no es necesario complementar las normas de la toxina con citosol de las células unintoxicated.

La unión de anticuerpos a la diapositiva del sensor no se producirá si la EDC: la solución de la activación del SNS es viejo o si la tapa está inserta en el instrumento con el lado dorado hacia abajo. Teniendo en cuenta el proceso de fabricación, habrá una cierta variabilidad placa a placa, que puede impedir un EDC: la activación del SNS y, por tanto, la captura de anticuerpos. Si la unión de anticuerpos a la diapositiva es pobre, como lo indica el RIU débilmente elevada, una segunda inyección puede depositar más de los anticuerpos en el plato. La RIU es una unidad arbitraria que varía de un experimento a otro dependiendo de la cantidad de anticuerpos anti-toxina se deposita sobre el sensor. Sin embargo, las tasas de encendido y apagado se mantendrá constante.

Es preferible usar un refractómetro con dos cámaras de canal de la perfusión, como un canal puede ser utilizado para la muestra experimental y el otro canal se puede utilizar para el buffer de alone con el fin de corregir la deriva de referencia posible. Cuando se utiliza un instrumento de doble cámara, asegúrese de que el anticuerpo anti-toxina sólo se agrega a uno de los dos canales. Posteriormente, las muestras se llevará a cabo a través de ambos canales. Con un instrumento de un solo canal, la compensación de la deriva de línea de base implica la recogida de tampón solo los datos de la diapositiva recubiertas de anticuerpos antes de la inyección de la muestra.

Antes del inicio de un experimento SPR, garantizar la diapositiva sensor se encuentra ajustado en el instrumento y todos los accesorios estén seguros. Las filtraciones de estos temas va a generar picos de aire en los datos recopilados. Las fugas también se pueden detectar por la ausencia de flujo de residuos, que debe estar siempre presente. Un volumen de muestra mayor que el volumen del circuito de inyección es necesaria para evitar los picos de aire, así - por ejemplo, se utiliza un volumen de ml de la muestra con un bucle de inyección de 500 mL. Una cantidad inadecuada de aceite de inmersión sobre el prisma evitará que la estabilización de la línea de base Signal. Otras cuestiones relacionadas con el funcionamiento del instrumento SPR se tratan en la Guía del usuario y boletines técnicos prestados por Reichert.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R01 AI073783 a K. Teter. Agradecemos al Dr. Shane Massey para la asistencia en el desarrollo del fraccionamiento subcelular de protocolo y Helen Burress para la lectura crítica del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digitonin Sigma-Aldrich D141
Ethanol Acros Organics 61509-0010
DMEM Invitrogen 11995065
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Ganglioside GM1 Sigma-Aldrich G7641
CTA Sigma-Aldrich C2398
PTS1 List 182
NHS (N-Hydroxysuccinimide) Pierce, Thermo Scientific 24500
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) Thermo Fisher Scientific, Inc. 22981
Ethanolamine Sigma-Aldrich E0135
PBST Medicago 09-8903-100
Anti-CTA antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-80747
Anti-CTB antibody Calbiochem 227040
Anti-PTS1 antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-57639
Refractometer Reichert SR7000, SR7000DC
SPR sensor slides Reichert 13206060
Syringe pump Cole-Parmer 780200C

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La detección de la translocación de la toxina en el citosol de host de resonancia de plasmones superficiales
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