In diesem Bericht beschreiben wir, wie Oberflächen-Plasmon-Resonanz verwendet wird, um Toxin Einreise in den Aufnahmemitgliedstaat Zytosol zu erkennen. Dieser hochempfindliche Methode lassen sich quantitative Daten über die Höhe der zytosolischen Toxin geben, und es kann zu einer Reihe von Toxinen eingesetzt werden.
AB Toxine bestehen aus einer enzymatischen A-Untereinheit und einer Zell-bindenden B-Untereinheit 1. Diese Toxine sind in das extrazelluläre Milieu ausgeschieden, aber sie wirken auf Ziele innerhalb der eukaryotischen Cytosol. Einige AB Toxine Reise durch Vesikel Träger von der Zelloberfläche zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) vor dem Eintritt in das Zytosol 2-4. In der Notaufnahme, um die katalytische A-Kette distanziert sich von dem Rest des Toxins und bewegt sich durch ein Protein-leitenden Kanals erreichen ihren zytosolischen Ziel 5. Die transloziert, cytosolische Eine Kette ist nur schwer zu erkennen, weil Toxin Menschenhandel, die ER ist ein sehr ineffizienter Prozess: Die meisten verinnerlicht Toxin wird zu den Lysosomen zum Abbau geführt, so dass nur ein kleiner Bruchteil der Oberflächen-gebundenen Toxin gelangt der Golgi-Apparat und ER 6 -12.
Zur Überwachung Toxin Translokation aus dem ER ins Zytosol in kultivierten Zellen, kombinierten wir eine subzelluläre Fraktionierung-Protokoll mit den highly empfindliche Nachweismethode der Surface Plasmon Resonance (SPR) 13-15. Die Plasmamembran der Toxin-behandelten Zellen selektiv mit Digitonin permeabilisiert, wodurch Sammlung eines zytosolischen Fraktion, die anschließend über einen SPR-Sensor mit einer Anti-Toxin A-Antikörper beschichtet ist, perfundiert. Die Antikörper-beschichteten Sensor kann erfassen und erkennen pg / mL Mengen von zytosolischen Toxin. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die Kinetik der Toxin-Eintrag in das Zytosol zu folgen und hemmende Wirkung auf die Translokation Ereignis zu charakterisieren. Die Konzentration der zytosolischen Toxin kann auch aus einer Standardkurve mit bekannten Mengen von A-Kette Standards, die über den Sensor wurden perfundiert, festgesetzt werden. Unsere Methode stellt eine schnelle, empfindliche und quantitative Nachweis-System, das keine radioaktiven Markierung oder andere Änderungen an der Ziel-Toxin.
Vergleich zu bestehenden Methoden
Unsere SPR-basierter Assay Translokation stellt eine schnelle, empfindliche und quantitative Methode zur Toxin Lieferung in die Host-Cytosol zu erkennen. Die Technik erfordert keine radioaktiven Markierung oder sonstige Änderungen, um das Toxin, und es kann auf jeden Toxin, für die eine anti-Toxin A-Antikörper zur Verfügung angewendet werden. Bestehende Methoden zur Toxin Passage in das Zytosol Monitor beruhen auch auf eine subzelluläre Fraktionierung Pro…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde vom NIH R01 AI073783 K. Teter finanziert. Wir danken Dr. Shane Massey um Hilfe bei der Entwicklung der subzellulären Fraktionierung-Protokoll und Helen Burress für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Digitonin | Sigma | D141 |
Ethanol | Acros | 61509-0010 |
DMEM | Invitrogen | 11995065 |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
Ganglioside GM1 | Sigma | G7641 |
CTA | Sigma | C2398 |
PTS1 | List | 182 |
NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce | 24500 |
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Scientific | 22981 |
Ethanolamine | Sigma | E0135 |
PBST | Medicago | 09-8903-100 |
Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotech | sc-80747 |
Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 |
Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-57639 |
Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC |
SPR sensor slides | Reichert | 13206060 |
Syringe pump | Cole Palmer | 780200C |