I denne rapporten beskriver vi hvordan overflaten plasmon resonans blir brukt til å påvise toksin innreise til verten cytosol. Denne svært følsom metode kan gi kvantitative data om mengden av cytosoliske toksin, og den kan brukes til en rekke giftstoffer.
AB giftstoffer består av en enzymatisk A subenhet og en celle-bindende B-subenhet 1. Disse giftstoffer skilles ut i ekstracellulære miljøet, men de handle på mål i eukaryote cytosol. Noen AB giftstoffer reise med vesicle bærere fra cellen overflate til det endoplasmatiske retikulum (ER) før vi går i cytosol 2-4. I ER, til katalytiske En kjede spaltes fra resten av toksinet og beveger seg gjennom et protein-ledende kanal nå sitt cytosoliske mål 5. Den translocated, cytosoliske En kjede er vanskelig å oppdage fordi toksinet trafficking til ER er en svært ineffektiv prosess: De fleste internalisert toksinet er rutet til lysosomer for degradering, så bare en liten brøkdel av overflate-bundet toksinet når Golgi-apparatet og ER 6 -12.
For å overvåke toksin translokasjon fra ER til cytosol i dyrkede celler, kombinerte vi en subcellular fraksjonering protokoll med highly sensitive deteksjonsmetode av overflaten plasmon resonans (SPR) 13-15. Plasma membran av toksin-behandlede cellene er selektivt permeabilized med digitonin, slik samling av en cytosoliske brøkdel som deretter perfused over en SPR sensor belagt med en anti-toksin En kjede antistoff. Antistoff-belagte sensor kan fange opp og oppdage pg / ml mengder cytosoliske toksin. Med denne protokollen, er det mulig å følge kinetikken av toksin oppføring i cytosol og å karakterisere hemmende effekter på translokasjon hendelsen. Konsentrasjonen av cytosoliske toksinet kan også beregnes fra en standard kurve generert med kjente mengder av en kjede standarder som har blitt perfused over sensoren. Vår metode representerer en rask, følsom, og kvantitative deteksjon system som ikke krever radiolabeling eller andre modifikasjoner til målet toxin.
Sammenligning med eksisterende metodikk
Våre SPR-baserte translokasjon analysen representerer en rask, følsom, og kvantitative metode for å detektere toxin levering i verten cytosol. Teknikken krever ikke radiolabeling eller andre endringer av giftstoffer, og det kan brukes på alle toksin som en anti-toksin A kjede antistoff er tilgjengelig. Eksisterende metoder for å overvåke toxin passasje inn i cytosol også stole på en subcellular fraksjonering protokoll for å partisjonere celle ek…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd R01 AI073783 til K. Teter. Vi takker Dr. Shane Massey for bistand i utviklingen av subcellular fraksjonering protokollen og Helen Burress for kritisk lesing av manuskriptet.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Digitonin | Sigma | D141 |
Ethanol | Acros | 61509-0010 |
DMEM | Invitrogen | 11995065 |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
Ganglioside GM1 | Sigma | G7641 |
CTA | Sigma | C2398 |
PTS1 | List | 182 |
NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce | 24500 |
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Scientific | 22981 |
Ethanolamine | Sigma | E0135 |
PBST | Medicago | 09-8903-100 |
Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotech | sc-80747 |
Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 |
Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-57639 |
Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC |
SPR sensor slides | Reichert | 13206060 |
Syringe pump | Cole Palmer | 780200C |