Summary
In questo rapporto, descriviamo come risonanza plasmonica di superficie viene utilizzato per rilevare ingresso tossina nel citosol ospitante. Questo metodo molto sensibile in grado di fornire dati quantitativi sulla quantità di tossina citosolica, e può essere applicata ad una gamma di tossine.
Abstract
Tossine AB consistono in un subunità enzimatica A e una cellula vincolante subunità B 1. Queste tossine vengono secreti nel milieu extracellulare, ma agiscono su bersagli all'interno del citoplasma degli eucarioti. Alcuni viaggi AB tossine da parte dei vettori delle vescicole dalla superficie cellulare verso il reticolo endoplasmatico (ER) prima di entrare nel citosol 2-4. Al pronto soccorso, la dissocia catalitico Una catena dal resto della tossina e si muove attraverso una proteina conduttore canale per raggiungere il suo obiettivo citosolico 5. Il traslocato, citosolica Una catena è difficile da rilevare perché il traffico di tossina al pronto soccorso è un processo estremamente inefficiente: la tossina più interiorizzato viene indirizzato ai lisosomi per la degradazione, in modo che solo una piccola frazione di superficie è legato tossina raggiunge l'apparato di Golgi e ER 6 -12.
Per monitorare traslocazione di tossine dal ER al citosol in cellule in coltura, abbiamo combinato un protocollo con il frazionamento subcellulare highly metodo di rilevazione sensibile di risonanza di plasmoni superficiali (SPR) 13-15. La membrana plasmatica delle cellule trattate con tossina è selettivamente permeabilizzate con digitonina, permettendo la raccolta di una frazione citosolica che viene successivamente perfuso su un sensore SPR rivestito con un anti-tossina A anticorpi a catena. L'anticorpo-rivestito sensore in grado di catturare e rilevare pg / mL quantità di tossina citosolico. Con questo protocollo, è possibile seguire la cinetica di entrata tossina nel citosol e caratterizzare effetti inibitori sulla manifestazione traslocazione. La concentrazione della tossina citosolica può anche essere calcolato da una curva standard generata con quantità note di una catena che gli standard sono stati irrorati sul sensore. Il nostro metodo rappresenta un rapido, sistema di rilevamento sensibile e quantitativa che non richiede radiomarcatura o altre modifiche alla tossina di destinazione.
Protocol
1. Preparazione del digitonina
- Aggiungere 500 ml di etanolo al 100% di una provetta e collocarla in un blocco di calore a 80 ° C per 10 min.
- Sciogliere 2,5 mg di digitonina in 250 ml di etanolo riscaldato per produrre una soluzione madre 1% del digitonina.
- Per generare una soluzione di lavoro del 0,04% digitonina, aggiungere 40 ml di soluzione di riserva digitonina a 960 ml di HCN tampone (50 Hepes mM pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM N-ethylmaleimide, e un inibitore della proteasi cocktail).
2. Intossicazione cellulare e permeabilizzazione
Il nostro test traslocazione può essere applicato a una serie di tossine e linee cellulari. Di seguito, forniamo un protocollo dettagliato per la rilevazione di tossina colerica (CT). Una panoramica della procedura è prevista in Figura 1.
- Cellule HeLa vengono seminate nel 6 pozzetti contenenti 1 ml di DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici antimicoticiper raggiungere 1x10 6 cellule / pozzetto dopo una notte di incubazione a 37 ° C. Per generare abbastanza tossina citosolico per il rilevamento riproducibile, pozzi triplice copia sono necessari per ogni condizione.
- A seguito di una notte di incubazione, sostituire il terreno di coltura con 1 ml di DMEM contenente 100 ng / mL di ganglioside GM1. Questo aumenta il numero di siti di legame per il CT, in quanto il GM1 recettore di CT sarà intercalare nella membrana plasmatica delle cellule esposte ad una soluzione di GM1.
- Dopo una incubazione di 1 ora a 37 ° C, togliere il GM1 contenenti medie e lavare le cellule due volte con DMEM. Allora, posto le cellule a 4 ° C per 30 minuti in 1 ml di DMEM contenente 1 mg / mL di CT.
- Rimuovere la tossina mezzo contenente, lavare le cellule due volte con DMEM, e incubare le cellule in 1 ml di DMEM a 37 ° C per l'intervallo di tempo desiderato (s).
- Alla fine di ogni periodo di caccia, lavare le cellule con PBS e incubare ciascun pozzetto con 250 microlitri di 0.5 mM EDTA in PBS. Lasciate che le cellule sedere per 10 minuti a temperatura ambiente e poi togliere dal 6 pozzetti di triturazione vigoroso con un p1000 Pipetman. Dopo un pozzetto di cellule sono stati raccolti, si combinano con il secondo e poi terzo pozzo dalla stessa condizione. Raschiatori cellulare può essere utilizzato anche per raccogliere le cellule.
- Posizionare la sospensione combinato di cellule dai tre pozzi replicare (750 microlitri di volume totale) in una provetta sola, e spin in una microcentrifuga da tavolo per 5 min a 5.000 x g. Pellet cellulari di dimensioni più o meno equivalente deve essere ottenuta per tutte le condizioni.
- Eliminare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri della soluzione del 0,04% di lavoro digitonina. Posizionare la sospensione cellulare in ghiaccio per 10 min.
- Spin le cellule digitonina-permeabilizzate a 16.000 xg per 10 minuti in una microcentrifuga da tavolo. Trasferire il citosol frazione contenente benzina supernatante in una provetta fresco, e mantenere l'organulo frazione contenente benzina pellet.
- Frazioni surnatante citosol contenenti sono diluiti in tampone HCN ad un volume finale di 1 ml. Volumi di campione di almeno 1 mL sono necessarie per garantire l'aria viene estratta dal ciclo campione di 500 microlitri prima dell'iniezione.
- Organello contenenti frazioni di pellet sono risospesi in 1 ml di HCN tampone contenente 1% Triton X-100. Aggiunta di detersivo è necessario per rilasciare il membrana rivestita pool di tossina.
- Standard di tossine a concentrazioni di 100, 10, 1, e 0,1 ng / mL sono preparato in tampone HCN.
- Paralleli di frazioni citosoliche e organelli sono preparati per un esperimento di controllo per confermare la fedeltà della procedura di frazionamento. Frazioni generato come descritto nella Sezione 2 sono risospesi in 20 ml di tampone campione 4x (frazione citosolica) o 120 ml di 1x tampone campione (frazione organello). Volumi equivalenti di ogni frazione sono risolti con sodio dodecil elettroforesi su gel di poliacrilamide solfato e sondato by Western blot per dimostrare il partizionamento di una proteina citosolica nella frazione surnatante e solubile, la proteina ER residente nella frazione pellet 16-19.
4. SPR scivolo preparazione
- La Reichert SR7000 SPR rifrattometro viene usato per gli esperimenti SPR.
- Impostare un dorato vetrino con un monostrato auto-assemblato nello strumento SPR. Per attivare il sensore di scorrimento, profumato un (v: v) 1:1 soluzione di 0,4 M EDC SSN e 0,1 M sul vetrino per 10 minuti ad un flusso di 41 microlitri / min. Tutti perfusione successive utilizzeranno la stessa portata.
- Per rimuovere l'EDC: buffer di attivazione del Servizio Sanitario Nazionale, lavare la piastra per 5 minuti con PBS contenente 0,05% di Tween 20 (PBST). La piastra contiene ora pastoie ammide reattiva a causa uncapping dal EDC: soluzione NHS.
- Profumato anti-CTA anticorpi sopra la diapositiva sensore attivato a una diluizione di 1:20.000 in 20 mM acetato di sodio (pH 5,5) per 15 minuti. Un calo iniziale nel rifrazione index unità (RIU), si vedrà per effetto della variazione del pH. Questo sarà seguito da un aumento della RIU come l'anticorpo viene catturato dalla amide-reattiva pastoie sul vetrino del sensore.
- Rimuovere l'anticorpo non legato dal vetrino del sensore con un lavaggio PBST 5 minuti. Il segnale prodotto dal RIU anticorpi catturata verrà plateau e stabilizzare, fornendo un nuovo segnale di base.
- Profumato etanolammina 1 M (pH 8,5) sopra il vetrino del sensore per 5 min. Questo tappi e rende inattivi eventuali attacchi non legato lasciato sul vetrino del sensore.
5. SPR analisi dei campioni
- Per stabilire una lettura di base, PBST perfusione negli legate agli anticorpi sensore per 5 min.
- Perfusione un campione sperimentale o standard tossina sopra il sensore per 300 sec. Rimuovere il ligando dal buffer e PBST profumato sul sensore per altri 200 sec.
- Dopo ogni perfusione, tossina legato viene rimosso dal sensore da un lavaggio 100 sec con PBST a pH 5.0. Ciò restituirà il segnaledi lettura di base iniziale, permettendo così un altro campione da elaborare sul sensore stesso.
- Prima di caricare un nuovo campione, spingere una piccola quantità di aria attraverso il ciclo di campionamento per espellere eventuali residui di liquido dal campione precedente. Utilizzando la procedura descritta in 5,2-5,4, dobbiamo correre fino a 12 campioni su una diapositiva senza sostanziale perdita del segnale di base.
- L'analisi dei dati è effettuata con il software 2 Scrubber, Igor e il software viene utilizzato per la preparazione figura.
6. Rappresentante Risultati
Tossina della pertosse (PT) è una tossina AB che si muove dalla superficie cellulare al pronto soccorso prima della sua Una catena (PTS1) entra nel citosol 3, 12. Come mostrato nella Figura 2, il nostro SPR-saggio basato su traslocazione in grado di rilevare PTS1 nel citosol delle cellule CHO intossicato. Nessun segnale è stato generato dal citosol di cellule unintoxicated, che ha confermato l'anticorpo anti-PTS1 non cross-reagiscono con un componente del citosol ospitante. Ilfrazione citosolica intossicati dalle cellule in presenza di brefeldin A (BFA) non è riuscito a produrre un segnale positivo. BfA tossina impedisce di trasporto al sito di traslocazione ER 6-8, 12, 20-25 e, quindi, una catena di consegna al citosol. Alla fine di ogni esecuzione, la tossina legata è spogliato dalla diapositiva sensore. Questo ha permesso di campioni multipli di essere proiettato su un vetrino singolo sensore e quindi fornito un confronto diretto tra i risultati ottenuti con differenti condizioni sperimentali.
CT è un altro AB-tipo, ER-translocating tossina 4. In Figura 3A, CTA1 è stato rilevato nella frazione citosolica da CT-trattate cellule HeLa. Questo ha sottolineato che la nostra metodologia funziona con più tipi di cellule e può essere applicato a qualsiasi tossina per il quale un anticorpo anti-A catena è disponibile. Nessun segnale è stato rilevato quando la frazione citosolica dal CT cellule trattate è stato perfuso su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTB (Fig. 3B), dimostrando così che la CTA1subunità, ma non la cellula vincolante CTB pentamero entra nel citosol. Figura 3C mostra il segnale dalla frazione organello è fuori scala rispetto al segnale più debole dalla frazione citosolica. Ciò era coerente con la nota inefficienza del CT di trasporto al sito di traslocazione ER 6, 7, che a sua volta limita la quantità di tossina che può raggiungere il citosol. Inoltre, la frazione organello contiene holotoxin CT e ER-CTA1 localizzata, in modo che il segnale risultante SPR per la frazione organello è gonfiato dalla massa aggiuntiva del holotoxin associati CTB pentamero. Quindi, non è pratico per tracciare i dati provenienti dalle frazioni di organello e citosolica sul sensorgram stesso.
Il nostro test in grado di monitorare il tempo-dipendente accumulo di traslocato, tossina citosolica (Fig. 4). Le cellule sono state esposte a CT a 4 ° C, una temperatura che permette di tossina legandosi alla membrana plasmatica, ma impedisce l'interiorizzazione della cellula associato tossina. Dopo il removal di tossina non legata, le cellule sono state riscaldate a 37 ° C. Sia il trasporto della tossina al pronto soccorso e A traslocazione catena al citosol può avvenire a questa temperatura. Non tossina è stata rilevata nel citosol 15 minuti dopo il riscaldamento a 37 ° C. Questo riflette l'intervallo di tempo necessario per (i) il traffico holotoxin al pronto soccorso, (ii) A / dissociazione subunità B al pronto soccorso, e (iii) Una catena di esportazione al citosol. Un pool minori di tossina citosolico è stata rilevata dopo 30 minuti a 37 ° C, e le quantità progressivamente crescenti di tossina citosolico sono stati individuati dopo il 45 e 60 minuti inseguimento. Livelli ancora maggiori di tossina citosolico sono stati individuati dopo un intervallo di 5 ore inseguimento 17, dimostrando così un continuo, a lungo termine di consegna delle cellule associate tossina alla citosol ospitante.
Il nostro test può anche rilevare l'inibizione della traslocazione di tossine al citosol (Fig. 5). Cellule trattate con il 10% dimetilsolfossido (DMSO), un chaperone chimico che impedisce il Disord termicoEring del isolate CTA1 subunità (T. Banerjee e K. Teter, osservazioni non pubblicate), esposto bassi livelli di CTA1 citosolico rispetto alle cellule controllo non trattato. Svolgimento della tossina Una catena è un prerequisito per traslocazione del citosol 16-18, in modo che il DMSO indotta stabilizzazione del CTA1 di conseguenza impedito il suo movimento dal pronto soccorso al citosol.
Il tasso di associazione costante (k a) calcolato da esperimenti di SPR è direttamente proporzionale alla concentrazione di ligando nel buffer di perfusione 14, 15, 26. Così, è possibile determinare la concentrazione di tossina citosolica da un grafico che traccia la K a valori per le norme tossina in funzione della concentrazione di tossine. Questa procedura è stata utilizzata per quantificare il DMSO indotta blocco di traslocazione di tossine presentato in Figura 5: la curva standard generata da concentrazioni note di tossina è stato utilizzato per calcolare un citosolico CTA1 concenione di 0,3 ng / mL per cellule non trattate e 0,1 ng / mL per DMSO cellule trattate (Fig. 6). L'inibizione della CTA1 svolgimento da parte di DMSO così generato una riduzione di 3 volte al pronto soccorso a citosol traslocazione di CTA1.
Figura 1. Protocollo panoramica. (A) Le cellule vengono incubate con la tossina AB a 4 ° C, una temperatura che permette di tossina legame alla superficie cellulare, ma impedisce endocitosi tossina. La subunità A e B della tossina sono rappresentati da cerchi rossi e blu, rispettivamente. (B) tossina non legato viene rimosso dal mezzo, e le cellule vengono riscaldati a 37 ° C al fine di promuovere il trasporto endocitosi e retrograda del holotoxin al pronto soccorso. Holotoxin dissociazione si verifica al Pronto Soccorso, che permette la isolato Una catena per entrare nel citosol passando attraverso una proteina-canale di conduzione (s) nella membrana ER. (C) Le cellule vengono trattate con digitonina per permeabilize selettivamente il plasmamembrana. (D) centrifugazione è usata per dividere le celle in parte frazioni citosoliche e organelli. Il citosol è spremuto fuori della cellula attraverso la digitonina generati pori e si trova nel surnatante. Il intatto, legata alla membrana organelli si trovano nella frazione di pellet. (E) Per rilevare la piscina traslocato Una catena di tossina nel citosol di accoglienza, la frazione surnatante è perfuso su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-A catena.
Figura 2. Rilevamento di PTS1 traslocazione nel citoplasma ospite. Cellule CHO sono stati marcati con impulsi a 4 ° C per 30 minuti con 1 mg / mL di PT. Le cellule sono state poi inseguito per 3 ore a 37 ° C in terreno privo di tossine che non contengono le aggiunte (ubriaco) o BfA 5 mcg / ml (+ BfA intossicati). Permeabilizzazione della membrana plasmatica con digitonina è stata usata per estratti cellulari in partizione separata organello e citosolica fractions. Un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-PTS1 è stato utilizzato per rilevare la piscina citosolico di PTS1 da cellule non trattate o trattate con BfA. PTS1 standard sono stati perfusi sul sensore come controlli positivi, mentre la frazione citosolica dalle cellule unintoxicated è stato perfuso sopra la diapositiva sensore come controllo negativo. Alla fine di ogni esecuzione, legato campione è stato spogliato dalla diapositiva sensore.
Figura 3. Rilevamento di CTA1 traslocazione nel citoplasma ospite. Cellule HeLa impulso marcato a 4 ° C con 1 mg / mL di CT sono stati inseguiti per 2 ore a 37 ° C in terreno privo di tossine che non contengono le aggiunte (ubriaco) o BfA 5 mcg / ml (+ BfA intossicati). Permeabilizzazione della membrana plasmatica con digitonina è stata usata per estratti cellulari in partizione separata organello e frazioni citosoliche. (A) Le frazioni citosoliche sono stati perfusi su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTA. Notoquantità di CTA sono stati utilizzati come controlli positivi, mentre il citosol dalle cellule unintoxicated è stato utilizzato come controllo negativo. (B) La frazione citosolica intossicati dalle cellule in assenza di BfA è stato perfuso su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTB. A purificata CTB pentamero era perfuso sopra la diapositiva come controllo positivo. (C) La frazione organello è stato solubilizzato con 1% Triton X-100 prima di perfusione nel corso di un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTA. Ai fini comparativi, la frazione citosolica (1 ml di volume finale) dall'estratto stessa cella e uno standard CTA sono stati perfusi sul sensore. Per tutti i pannelli, campione legato è stata spogliata dal sensore alla fine di ogni esecuzione.
Figura 4. Cinetica di CTA1 ingresso nel citosol. Cellule HeLa impulso marcato a 4 ° C con 1 mg / mL di CT sono stati inseguiti per 15, 30, 45 o 60 min a 37 ° C in tossina-libero Medium. Per rilevare la piscina traslocato di tossina, frazioni citosoliche da digitonina-permeabilizzate cellule sono state perfusi su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTA. Standard CTA sono stati perfusi sul sensore pure. Alla fine di ogni esecuzione, legato campione è stato spogliato dalla diapositiva sensore.
Figura 5. Inibizione della traslocazione CTA1 da DMSO. Cellule HeLa impulso marcato a 4 ° C con 1 mg / mL di CT sono stati inseguiti per 2 ore a 37 ° C in terreno privo di tossine che non contengono le aggiunte (ubriaco) o 10% di DMSO (+ DMSO intossicati). Per rilevare la piscina traslocato di tossina, frazioni citosoliche da digitonina-permeabilizzate cellule sono state perfusi su un sensore SPR rivestiti con un anticorpo anti-CTA. Standard CTA (100, 10, 1, e 0,1 ng / mL) sono stati perfusi sul sensore come controlli positivi, solo l'1 e 0,1 ng / mL standard sono mostrate per scopi di scala. Il citosol da unintoxicatecelle d è stato utilizzato come controllo negativo. Alla fine di ogni esecuzione, legato campione è stato spogliato dalla diapositiva sensore.
Figura 6. Calcolo del citosolico CTA1. K uno standard di valori per il CTA di figura 5 sono state tracciate in funzione della concentrazione di tossine. La curva risultante standard è stato utilizzato per determinare, sulla base dei valori di k uno dei campioni sperimentali di figura 5, la concentrazione di CTA1 citosolico in cellule non trattate e trattate con DMSO. Standard di tossina si presentano come cerchi pieni, il citosol non trattata si presenta come una piazza aperta, e il DMSO trattati citosol si presenta come un cerchio aperto. Le medie ± gamme di due esperimenti indipendenti sono mostrati.
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Discussion
Confronto con metodologia esistente
Il nostro SPR-saggio basato su traslocazione rappresenta un metodo rapido, sensibile e quantitativa per rilevare la consegna tossina nel citosol ospitante. La tecnica non richiede radiomarcatura o altre modifiche alla tossina, e può essere applicato a qualsiasi tossina per i quali un anti-tossina A anticorpi catena è disponibile. Gli attuali metodi di monitorare il passaggio della tossina nel citosol anche contare su un protocollo di frazionamento subcellulare di estratti di partizione delle cellule in citosol separati e le frazioni di membrana 11, 23, 27, 28. Questi metodi utilizzano Western blot o radiolabels per rilevare la piscina citosolico della tossina. Il primo approccio è semi-quantitativa al meglio e soffre di sensibilità relativamente povero. Anche i protocolli radiomarcatura può richiedere settimane per generare un risultato, a causa del basso livello di tossine che raggiungono il citosol. Mentre l'analisi quantitativa con una tossina radiomarcato in grado di determinare la percentuale relativadi cellule associate tossina che entra nel citosol, questo approccio non può direttamente determinare il numero esatto di molecole di tossina citosolico. Confrontando la sensibilità di rilevazione della tossina SPR per la rilevazione di tossine radioattivo è quindi problematico, come la quantità di tossina citosolico può essere calcolata con SPR ma non da radiomarcatura.
Altri saggi di traslocazione bypassare il traffico a monte passi tossina e fornire i tossina Una catena direttamente al pronto soccorso utilizzando plasmide sistemi basati espressione o di trascrizione in vitro / sistemi di traduzione 29-38. Per entrambi i metodi, un amino-terminale la sequenza di segnali target Una catena di co-traslazionale importazione nel lume ER. Esportazione della sintetizzato Una catena dal pronto soccorso viene poi rilevata dal frazionamento subcellulare, centrifugazione differenziale, l'attività della tossina nel citosol, il degrado proteosomale della tossina traslocato, e / o una citosolica specifica modifica tossina. Sottoinsiemi di questi approcci perCUS esclusivamente sull'evento traslocazione, può essere utilizzato per esperimenti di ricostituzione in vitro e produrre livelli elevati di tossina per il rilevamento e la co-immunoprecipitazione studi. Tuttavia, le metodologie non può determinare la cinetica o l'efficienza della consegna tossine dalla superficie cellulare al citosol. E 'anche possibile che la traslocato Una catena non entra al pronto soccorso nello stesso stato conformazionale come holotoxin consegnate a una catena. Altri aspetti della tossina interazioni ospite-mancano da queste procedure, come la A / B evento dissociazione. Così, ci sono sia i punti di forza e di debolezza di traslocazione di monitoraggio con A catene che sono sintetizzati direttamente al pronto soccorso.
Traslocazione della tossina è spesso rilevata attraverso saggi intossicazione. L'effetto citotossico o citopatico generato dalla tossina esogena applicata dimostra la tossina Una catena ha raggiunto il suo obiettivo citosolico. Ovviamente, questa è una misura indiretta di traslocazione di tossine che controlla unoTTIVITÀ nel citoplasma piuttosto che la presenza fisica di tossina citosolico. Così, la tecnica non può né quantificare i livelli di tossina citosolica né individuare direttamente l'elaborazione alterato della tossina traslocato. Ci sono anche scenari in cui una correlazione diretta tra livelli di tossine citosolico e l'attività della tossina non esistono, come ad esempio l'eventuale necessità di una concentrazione soglia di tossina citosolico di ottenere una risposta cellulare o quando l'attività della tossina produce una risposta saturo cellulare. Ancora, le analisi intossicazione in grado di fornire una correlazione funzionale a test che direttamente documentare l'evento traslocazione. Abbiamo già usato questa strategia per dimostrare una inibizione di una traslocazione catena corrisponde ad una inibizione di intossicazione cellulare, 17-19.
In sintesi, ci sono diversi metodi per rilevare la consegna tossina al citosol. Il nostro SPR approccio ha il vantaggio di fornire risultati rapidi e sensibili, e quantitativi. Il data possono anche essere integrati con esperimenti utilizzando una delle strategie di cui sopra anziani di generare una conclusione forte.
Applicazioni future
Il nostro metodo label-free per il rilevamento e la quantificazione delle tossine citosolica investigatori fornisce la flessibilità necessaria per affrontare molte questioni in sospeso riguardanti la biologia cellulare di intossicazione. Per esempio, è possibile stabilire l'efficienza di una filiera di consegna al citosol calcolando la percentuale di superficie è legato tossina che raggiunge il citosol. E 'anche possibile quantificare l'importo complessivo di tossina citosolica e, per estensione, il numero di molecole tossina citosolico per cella. Si ritiene che una molecola di tossina difterica citosolico è sufficiente per provocare una completa citopatico / effetto citotossico 39; questo modello può essere testato con altre tossine usando il nostro saggio di traslocazione e saggi intossicazione correlativi. Così, il nostro SPR-saggio basato su shoULD in grado di determinare quante molecole di tossina citosolico sono necessari per intossicazione produttivo. La nostra tecnica può anche monitorare la persistenza della tossina citosolico. Degrado sostanziale del traslocato Una catena potrebbe limitare e possibilmente ridurre la sua concentrazione citosolica nel tempo, il che implicherebbe l'effetto di intossicazione potrebbe essere invertita se A catena l'accesso al citosol è stato limitato dopo l'esposizione tossina iniziale. Inoltre, il mezzo extracellulare e della membrana di pellet a partire da cellule intossicato può essere utilizzato per monitorare la quantità di tossina secreta o tossina che risiedono nel sistema endomembrane, rispettivamente. Gli studi comparativi di extracellulare, tossina endomembrane-localizzato, e citosolica può essere usata per esaminare come la biologia cellulare di intossicazione varia per le diverse ER-translocating tossine. Il nostro test può essere utilizzato anche per analizzare i fattori cellulari tossina-specifici richiesti per l'evento traslocazione 19. Dovrebbe essere possibile adattare la nostra metodologia di tenere tracciadell'endosoma-to-citosol traslocazione di tossine AB altri come il fattore letale di antrace e tossina difterica. Infine, l'ingresso del virus nel citosol ospite potrebbe essere controllati con una procedura simile sperimentale.
Limitazioni
Condizioni che inibiscono il traffico di tossina al pronto soccorso eviterà anche la consegna tossina al citosol. Questo è stato dimostrato l'assenza di tossina BfA citosolico in cellule trattate (fig. 2, 3A). Così, esperimenti di controllo sono necessarie ulteriori quando si utilizza questo metodo per esaminare potenziali blocchi di traslocazione di tossine. Per alcune tossine AB, la riduzione di un legame disolfuro che attacchi la subunità catalitica al suo holotoxin avviene in ER 6, 40-43. Lo stato redox del Una catena può quindi essere usato come misura del trasporto della tossina al pronto soccorso 16, 18. Tossine ricombinante contenente la sequenza consenso per N-glicosilazione, una modifica che viene avviato al pronto soccorso, sono statiutilizzato per rilevare tossine in ingresso al Pronto Soccorso 12, 23, 44-46. Infine, come discusso in precedenza, protocolli alternativi che coinvolgono co-traslazionale inserimento della tossina Una catena nel lume ER può verificare un effetto inibitorio sulla manifestazione traslocazione. Per esempio, il nostro SPR-saggio basato su traslocazione dimostrato un ruolo funzionale di Hsp90 in CTA1 traslocazione che è stato confermato con un plasmide-based che ha espresso CTA1 direttamente nel lume ER 19.
A catene di ER-translocating tossine mostrano una forte arginina-over-lisina pregiudizi aminoacidi che permette la tossina traslocato di eludere ubiquitina-dipendente di degradazione del proteasoma 47-50. Tuttavia, il degrado della tossina citosolica persiste da un relativamente lento, ubiquitina-proteasoma meccanismo indipendente 51, 52. Condizioni che aumentano l'attività del proteasoma potrebbe quindi falsare i risultati dei nostri test traslocazione riducendo il pool di tossina traslocato nel fra citosolicoction. Cellule esposte ad un inibitore del proteasoma può essere utilizzato per controllare questa eventualità, un aumento della tossina citosolico l'inibizione del proteasoma potrebbe indicare la tossina potrebbe infatti raggiungere il citoplasma, ma è stato degradato prima rilevazione.
Va notato che queste considerazioni valgono a sottoinsiemi degli approcci alternativi di cui sopra e non riguardano solo il nostro metodo. Come accennato in precedenza, la strategia migliore per caratterizzare l'evento traslocazione è quello di utilizzare una combinazione di tecniche ben controllati.
Passaggi critici e risoluzione dei problemi
Preparazione chimica è un passo fondamentale per l'analisi. Digitonina non si scioglie facilmente, e deve essere preparato fresco per ogni esperimento. Allo stesso modo, PBST fresca deve essere utilizzato per l'analisi SPR. L'EDC: buffer attivazione NHS dovrebbe essere preparata immediatamente prima dell'uso, non manterrà l'attività, se conservato dopo la miscelazione delle due soluzioni. However, separare le aliquote di EDC e servizio sanitario nazionale possono essere conservati a -80 ° C e una volta scongelato prima dell'uso. Tutte le soluzioni, compresi i campioni, deve essere degassati prima dell'iniezione. Questo consentirà di evitare l'aria indotta picchi nel segnale SPR.
Il tipo di cellule da utilizzare per questa analisi deve esprimere i recettori della tossina sufficiente a consentire un pool rilevabile di tossina Una catena per raggiungere il citosol. In alcuni casi, come il pre-trattamento delle cellule HeLa con GM1 prima sfida CT, i recettori della tossina è possibile aggiungere alla superficie delle cellule bersaglio. Il tipo di cella deve essere suscettibile di permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica con digitonina. Il protocollo qui descritto è efficace con le cellule HeLa e CHO, ma altri tipi di cellule richiederà una fase di ottimizzazione utilizzando l'analisi Western Blot per monitorare la netta separazione di organelli e delle frazioni citosoliche. Noi abitualmente seguono le distribuzioni di proteina disolfuro isomerasi (una proteina solubile ER) e Hsp90 (un pr citosolicaa) per questo scopo 16-19. Il partizionamento esclusivo di proteina disolfuro isomerasi nella frazione pellet 16-19 assicura inoltre che gli organelli raccolti nel pellet membrane sono intatte. Questo è un aspetto cruciale del nostro metodo, come la rottura accidentale di organelli intracellulari introdurrebbe errore nel sistema rilasciando endomembrane-restricted tossina nella frazione citosolica. SPR-based esperimenti possono essere utilizzati anche per dimostrare che il pool citosolico dei risultati tossina traslocazione da un evento piuttosto che dalla lisi degli organelli intracellulari. Per esempio, nessun tossina è stata rilevata nel citosol di BfA cellule trattate (fig. 2, 3A) o cellule esposte alla tossina per soli 15 minuti (Fig. 4). Allo stesso modo, la subunità B della TC non è stato rilevato nella frazione citosolica dopo una esposizione ad una tossina due ore (Fig. 3B). Avuto il nostro protocollo ha portato alla permeabilizzazione delle membrane interne, avremmo individuato un pool citosolico di tossina per ciascuno dei aforecitato condizioni. Stabilire il protocollo corretto per riproducibile, permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica può rappresentare il fattore limitante per l'attuazione del test. Altre opzioni per permeabilizzazione della membrana plasmatica sono disponibili, ma abbiamo trovato che il trattamento digitonina fornito risultati più coerenti rispetto ad altri metodi quali il trattamento con streptolisina O.
La qualità degli anticorpi determinerà anche la sensibilità del test, che può essere stabilita con diluizioni seriali di uno standard tossina. Per esempio, possiamo riproducibile rilevare un minimo di 0,1 ng / ml o di PTS1 o CTA standard (fig. 2-6). L'anticorpo anti-A catena non dovrebbe riconoscere la subunità B della tossina, e le cellule unintoxicated deve essere sempre utilizzato come controllo per assicurare l'anticorpo non cross-reagiscono con le proteine della cellula ospite. Esperimenti preliminari sarà necessario ottimizzare le condizioni per stripping tossina legata dal anticorpi, in quanto possono differireper i diversi anticorpi anti-tossina.
Durante il monitoraggio traslocazione di tossine in condizioni alterate cellulare, gli standard di tossina e la frazione citosolica a partire da cellule di controllo non trattato dovrebbe essere completata in base alle condizioni del campione sperimentale. Per esempio, gli standard CTA e la frazione citosolica non trattati dalla figura 5 sono stati integrati con 1% di DMSO per abbinare la concentrazione finale della droga nella frazione citosolica da DMSO cellule trattate. Questo elimina le possibili differenze nei segnali SPR che potrebbero derivare da differenze nella composizione chimica delle frazioni raccolte. I confronti tra citosolica e frazioni organello sarebbe parimenti richiedere l'aggiunta di 1% Triton X-100 alla frazione citosolica e gli standard, in quanto questo detergente viene usato per rilasciare la membrana racchiuso tossina dalla frazione organello per il rilevamento SPR. Esperimenti preliminari hanno dimostrato la presenza di citosol non altera la risposta SPR agli standard tossina,quindi non è necessario integrare gli standard tossina con citoplasma dalle cellule unintoxicated.
Legame degli anticorpi alla diapositiva sensore non si verifica se l'EDC: soluzione di attivazione NHS è vecchio o se la diapositiva viene inserita nello strumento con il lato oro verso il basso. Dato il processo di produzione, ci saranno alcune piastre-to-plate variabilità che impediscono una corretta EDC: attivazione del Servizio Sanitario Nazionale e, quindi, la cattura degli anticorpi. Se il legame degli anticorpi alla diapositiva è scarsa, come indicato da un RIU debolmente elevata, una seconda iniezione può depositare più di anticorpi sul piatto. Il RIU è un'unità arbitraria che varia da un esperimento all'altro a seconda della quantità di tossina anti-anticorpo si deposita sul sensore. Tuttavia, i tassi di on e off rimarrà costante.
E 'preferibile utilizzare un Rifrattometro con camere a doppio canale di perfusione, come un canale può essere utilizzato per il campione sperimentale e l'altro canale può essere utilizzato per tampone alone al fine di correggere la deriva di base possibili. Quando si usa uno strumento a doppia camera, assicurarsi che la anticorpi anti-tossina viene aggiunto solo ad uno dei due canali. I campioni saranno successivamente attraversano entrambi i canali. Con uno strumento unico canale, il compenso per deriva di base prevede la raccolta di buffer di soli dati dal legate agli anticorpi scivolare prima dell'iniezione del campione.
Prima dell'inizio di un esperimento SPR, garantire la diapositiva sensore è impostato stretto nello strumento e tutti gli accessori sono sicuri. Perdite derivanti da questi problemi genera picchi d'aria nei dati raccolti. Le perdite possono anche essere rilevato per l'assenza di flusso di rifiuti, che dovrebbe essere sempre presente. Un volume del campione superiore al volume del ciclo di iniezione è necessario per evitare i picchi d'aria, come pure - per esempio, usiamo volumi di 1 ml di campione con un ciclo di iniezione 500 microlitri. Un ammontare inadeguato di olio da immersione sul prisma impedirà la stabilizzazione della linea di base signal. Altre questioni relative al funzionamento dello strumento SPR sono affrontati nella Guida Utenti e bollettini tecnici forniti da Reichert.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere R01 AI073783 a K. Teter. Ringraziamo il Dott. Shane Massey per l'assistenza nello sviluppo del protocollo di frazionamento subcellulare e Helen Burress per la lettura critica del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Ganglioside GM1 | Sigma-Aldrich | G7641 | |
| CTA | Sigma-Aldrich | C2398 | |
| PTS1 | List | 182 | |
| NHS (N-Hydroxysuccinimide) | Pierce, Thermo Scientific | 24500 | |
| EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22981 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135 | |
| PBST | Medicago | 09-8903-100 | |
| Anti-CTA antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-80747 | |
| Anti-CTB antibody | Calbiochem | 227040 | |
| Anti-PTS1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-57639 | |
| Refractometer | Reichert | SR7000, SR7000DC | |
| SPR sensor slides | Reichert | 13206060 | |
| Syringe pump | Cole-Parmer | 780200C |
References
- Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 1-24 (2002).
- Watson, P., Spooner, R. A. Toxin entry and trafficking in mammalian cells. Adv. Drug Deliv. Rev. 58, 1581-1596 (2006).
- Carbonetti, N. H. Pertussis toxin and adenylate cyclase toxin: key virulence factors of Bordetella pertussis and cell biology tools. Future Microbiol. 5, 455-469 (2010).
- Wernick, N. L. B., Chinnapen, D. J. -F., Cho, J. A., Lencer, W. I. Cholera toxin: an intracellular journey into the cytosol by way of the endoplasmic reticulum. Toxins. 2, 310-325 (2010).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Lencer, W. I. Entry of protein toxins into mammalian cells by crossing the endoplasmic reticulum membrane: co-opting basic mechanisms of endoplasmic reticulum-associated degradation. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 300, 149-168 (2005).
- Lencer, W. I. Entry of cholera toxin into polarized human intestinal epithelial cells. Identification of an early brefeldin A sensitive event required for A1-peptide generation. J. Clin. Invest. 92, 2941-2951 (1993).
- Orlandi, P. A., Curran, P. K., Fishman, P. H. Brefeldin A blocks the response of cultured cells to cholera toxin. Implications for intracellular trafficking in toxin action. J. Biol. Chem. 268, 12010-12016 (1993).
- Sandvig, K., Prydz, K., Hansen, S. H., van Deurs, B. Ricin transport in brefeldin A-treated cells: correlation between Golgi structure and toxic effect. J. Cell. Biol. 115, 971-981 (1991).
- Sandvig, K., Prydz, K., Ryd, M., van Deurs, B. Endocytosis and intracellular transport of the glycolipid-binding ligand Shiga toxin in polarized MDCK cells. J. Cell Biol. 113, 553-562 (1991).
- van Deurs, B. Estimation of the amount of internalized ricin that reaches the trans-Golgi network. J. Cell Biol. 106, 253-267 (1988).
- Tam, P. J., Lingwood, C. A. Membrane cytosolic translocation of verotoxin A1 subunit in target cells. Microbiology. 153, 2700-2710 (2007).
- Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cell. Microbiol. 10, 1130-1139 (2008).
- Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Medaglia, M. V., Fisher, R. J. Protein-Protein Interactions. Golemis, E. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 255-272 (2002).
- Banerjee, T. Contribution of subdomain structure to the thermal stability of the cholera toxin A1 subunit. Biochemistry. 49, 8839-8846 (2010).
- Massey, S. Stabilization of the tertiary structure of the cholera toxin A1 subunit inhibits toxin dislocation and cellular intoxication. J. Mol. Biol. 393, 1083-1096 (2009).
- Taylor, M. A therapeutic chemical chaperone inhibits cholera intoxication and unfolding/translocation of the cholera toxin A1 subunit. PLoS ONE. 6, e18825-e18825 (2011).
- Taylor, M. Hsp90 is required for transfer of the cholera toxin A1 subunit from the endoplasmic reticulum to the cytosol. J. Biol. Chem. 285, 31261-31267 (2010).
- Donta, S. T., Beristain, S., Tomicic, T. K. Inhibition of heat-labile cholera and Escherichia coli enterotoxins by brefeldin A. Infect. Immun. 61, 3282-3286 (1993).
- Donta, S. T., Tomicic, T. K., Donohue-Rolfe, A. Inhibition of Shiga-like toxins by brefeldin. A. J. Infect. Dis. 171, 721-724 (1995).
- Nambiar, M. P., Oda, T., Chen, C., Kuwazuru, Y., Wu, H. C. Involvement of the Golgi region in the intracellular trafficking of cholera toxin. J. Cell. Physiol. 154, 222-228 (1993).
- Rapak, A., Falnes, P. O., Olsnes, S. Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 3783-3788 (1997).
- Xu, Y., Barbieri, J. T. Pertussis toxin-mediated ADP-ribosylation of target proteins in Chinese hamster ovary cells involves a vesicle trafficking mechanism. Infect. Immun. 63, 825-832 (1995).
- Yoshida, T., Chen, C. C., Zhang, M. S., Wu, H. C. Disruption of the Golgi apparatus by brefeldin A inhibits the cytotoxicity of ricin, modeccin, and Pseudomonas toxin. Exp. Cell Res. 192, 389-395 (1991).
- Godber, B. Direct quantification of analyte concentration by resonant acoustic profiling. Clin. Chem. 51, 1962-1972 (2005).
- Bernardi, K. M., Forster, M. L., Lencer, W. I., Tsai, B. Derlin-1 facilitates the retro-translocation of cholera toxin. Mol. Biol. Cell. 19, 877-884 (2008).
- Wernick, N. L., De Luca, H., Kam, W. R., Lencer, W. I. N-terminal Extension of the Cholera Toxin A1-chain Causes Rapid Degradation after Retrotranslocation from Endoplasmic Reticulum to Cytosol. J. Biol. Chem. 285, 6145-6152 (2010).
- Simpson, J. C. Ricin A chain utilises the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter the cytosol of yeast. FEBS. Lett. 459, 80-84 (1999).
- Veithen, A., Raze, D., Locht, C. Intracellular trafficking and membrane translocation of pertussis toxin into host cells. Int. J. Med. Microbiol. 290, 409-413 (2000).
- Castro, M. G., McNamara, U., Carbonetti, N. H. Expression, activity and cytotoxicity of pertussis toxin S1 subunit in transfected mammalian cells. Cell. Microbiol. 3, 45-54 (2001).
- Schmitz, A., Herrgen, H., Winkeler, A., Herzog, V. Cholera toxin is exported from microsomes by the Sec61p complex. J. Cell Biol. 148, 1203-1212 (2000).
- Teter, K., Allyn, R. L., Jobling, M. G., Holmes, R. K. Transfer of the cholera toxin A1 polypeptide from the endoplasmic reticulum to the cytosol is a rapid process facilitated by the endoplasmic reticulum-associated degradation pathway. Infect. Immun. 70, 6166-6171 (2002).
- Winkeler, A., Godderz, D., Herzog, V., Schmitz, A. BiP-dependent export of cholera toxin from endoplasmic reticulum-derived microsomes. FEBS Lett. 554, 439-442 (2003).
- Yu, M., Haslam, D. B. Shiga toxin is transported from the endoplasmic reticulum following interaction with the luminal chaperone HEDJ/ERdj3. Infect. Immun. 73, 2524-2532 (2005).
- LaPointe, P., Wei, X., Gariepy, J. A role for the protease-sensitive loop region of Shiga-like toxin 1 in the retrotranslocation of its A1 domain from the endoplasmic reticulum lumen. J. Biol. Chem. 280, 23310-23318 (2005).
- Teter, K., Jobling, M. G., Sentz, D., Holmes, R. K. The cholera toxin A13 subdomain is essential for interaction with ADP-ribosylation factor 6 and full toxic activity but is not required for translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Infect. Immun. 74, 2259-2267 (2006).
- Redmann, V. Dislocation of ricin toxin a chains in human cells utilizes selective cellular factors. J. Biol. Chem. 286, 21231-21238 (2011).
- Yamaizumi, M., Mekada, E., Uchida, T., Okada, Y. One molecule of diphtheria toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell. Cell. 15, 245-250 (1978).
- Bellisola, G. Reductive activation of ricin and ricin A-chain immunotoxins by protein disulfide isomerase and thioredoxin reductase. Biochem. Pharmacol. 67, 1721-1731 (2004).
- McKee, M. L., FitzGerald, D. J. Reduction of furin-nicked Pseudomonas exotoxin A: an unfolding story. Biochemistry. 38, 16507-16513 (1999).
- Orlandi, P. A. Protein-disulfide isomerase-mediated reduction of the A subunit of cholera toxin in a human intestinal cell line. J. Biol. Chem. 272, 4591-4599 (1997).
- Spooner, R. A. Protein disulphide-isomerase reduces ricin to its A and B chains in the endoplasmic reticulum. Biochem. J. 383, 285-293 (2004).
- Fujinaga, Y. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol. Biol. Cell. 14, 4783-4793 (2003).
- Guerra, L. Cellular internalization of cytolethal distending toxin: a new end to a known pathway. Cell. Microbiol. 7, 921-934 (2005).
- Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. J. Biol. Chem. 272, 19554-19561 (1997).
- Deeks, E. D. The low lysine content of ricin A chain reduces the risk of proteolytic degradation after translocation from the endoplasmic reticulum to the cytosol. Biochemistry. 41, 3405-3413 (2002).
- Hazes, B., Read, R. J. Accumulating evidence suggests that several AB-toxins subvert the endoplasmic reticulum-associated protein degradation pathway to enter target cells. Biochemistry. 36, 11051-11054 (1997).
- Rodighiero, C., Tsai, B., Rapoport, T. A., Lencer, W. I. Role of ubiquitination in retro-translocation of cholera toxin and escape of cytosolic degradation. EMBO Rep. 3, 1222-1227 (2002).
- Worthington, Z. E., Carbonetti, N. H. Evading the proteasome: absence of lysine residues contributes to pertussis toxin activity by evasion of proteasome degradation. Infect. Immun. 75, 2946-2953 (2007).
- Pande, A. H., Moe, D., Jamnadas, M., Tatulian, S. A., Teter, K. The pertussis toxin S1 subunit is a thermally unstable protein susceptible to degradation by the 20S proteasome. Biochemistry. 45, 13734-13740 (2006).
- Pande, A. H. Conformational instability of the cholera toxin A1 polypeptide. J. Mol. Biol. 374, 1114-1128 (2007).
