Summary
Это видео демонстрирует протокол новый метод генерации и последующей очистки нейронных клеток-предшественников из возобновляемых источников нервные стволовые клетки (НСК) на основе их физических (размер и внутренней детализации) и флуоресцентные свойства с помощью технологии проточной цитометрии.
Abstract
Нервные стволовые клетки (НСК) могут быть выделены и расширен в больших масштабах, используя neurosphere анализа и дифференцированы на три основных типа клеток центральной нервной системы (ЦНС), а именно астроциты, олигодендроциты и нейроны. Эти характеристики делают нейронных стволовых и прогениторных клеток бесценный возобновляемый источник клеток для лабораторного исследования, такие как наркотики, Нейротоксикология и электрофизиологии, а также для мобильных заместительной терапии при многих неврологических заболеваний. На практике, однако, неоднородность НСК потомство, низкое производство нейронов и олигодендроцитов и астроцитов преобладание после дифференциации ограничить их клинического применения. Здесь мы описываем новую методологию для создания и последующей очистки незрелых нейронов с мышиным потомством НСК активировать с помощью флуоресцентной сортировки клеток (FACS) технологии. Используя эту методологию, обогащенного нейронные популяции клеток-предшественников может быть достигнут умомHout заметного астроцитов и добросовестных загрязнения НСК. Процедура включает в себя дифференциацию НСК потомство изолированы и расширен с E14 мыши ганглиозные возвышения использованием neurosphere анализа, с последующим выделением и обогащение незрелых нервных клеток в зависимости от их физических (размер и внутреннюю сложность) и флуоресцентные свойства с помощью технологии проточной цитометрии. В целом, это занимает 5-7 дней для получения нейросферы и 6-8 дней, чтобы дифференцировать НСК потомство и изоляции высокоочищенных незрелых нервных клеток.
Protocol
1. Основная настройка Прежде чем приступить к культуре клеток
- NeuroCult НСК базальной среды и NeuroCult НСК распространения добавки смешиваются в соотношении 9:1, соответственно, сделать полный среднего НСК.
- 37 ° С водяной бане используется для разогрева среды.
- Соответствующее количество тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) оттаивают.
- Соответствующее количество акций фактором роста решений, включая эпидермальный фактор роста (ЭФР 10 мкг / мл), основной фактор роста фибробластов (FGF-б на 10 мкг / мл) и 0,2% раствор гепарина в фосфатный буферный раствор (PBS) размораживают.
- Ткань культуры фляги (T25, T75 и T175 или) которые необходимы для НСК расширения и дифференциации.
- Культура тканей рассматривается 96 и 24 также пластин и стекла покровные, необходимых для металлизации отсортированных клеток.
2. Изоляция и расширения (пассажей) в НСК
- Нейронных стволовых предшественников и находятся в изоляции и расширен с мышью бдождь, как описано в отдельных протоколах 1, 2, 3.
- Когда нейросферы (основную или пассированных нейросферы) готовы к субкультуре (150-200 мкм в диаметре), в среду, содержащую сферы переносится на соответствующий размер стерильную пробирку культуры тканей и центрифугировали при 800 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Супернатант среду удаляют и сферы ресуспендировали в 1 мл подогретого 0,05% трипсин-ЭДТА.
- После инкубации при 37 ° С на водяной бане 2-3 мин, равного объема сои ингибитор трипсина добавляется к суспензии клеток, чтобы остановить трипсина деятельности.
- Для того, чтобы трипсина был полностью инактивируется, клеточной суспензии осторожно пипеткой вверх и вниз 3-5 раз.
- После центрифугирования при 800 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин, супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в 1 мл полной среды НСК.
- 10 мкл клеточной суспензии смешивают с 90 мкл trypaя голубой выполнять клеток.
Примечание: другие соответствующие разведения клетки также могут быть использованы. - Затем клетки используются для субкультура 1, 2 или дифференциации, как описано ниже.
3. Дифференциация нейронных стволовых и прогениторных клеток, нейробластов анализ (НБА)
- Клетки в результате диссоциированных нейросферы высевают при концентрации 2-3 × 10 5 клеток / мл в полной среде НСК дополнена с 20 нг / мл ЭФР, 10 нг / мл bFGF, 1 мкл / мл 0,2% гепарина и 5% тепла инактивируется ФТС в соответствующие колбы культуре ткани размером. 5 мл среды для T25, 20 мл для T75 и 40 мл для T175 колбы.
Примечание: ФТС приведет к клеткам прочно прикрепляться к субстрату, и нет необходимости для покрытия колбы культуры НБА. - КультЮр колбы затем инкубировали при 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в течение 3-4 дней. Этот период называется распространение этап, в ходе которого НСК потомство прикрепляться к субстрату и распространяются в виде монослоя клеток.
- Когда культура превращается 90-95% сливной среда каждой колбе переключается на полной среде НСК с добавлением 5% FCS без факторов роста.
- Культура колбы снова инкубировали при 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 еще 3-4 дня. Этот период называется дифференциацией этап, в ходе которого предшественники нейронов появляются в верхней части монослоя астроцитов и размножаться, чтобы колонии незрелых нервных клеток. В день 4-5 стадии дифференцировки, культуры готова к изоляции нейробластов клеток с использованием технологии проточной цитометрии.
4. Сотовые Подготовка к проточной цитометрии
Trypsiniзации
- Культура дифференциации НСК потомство в день 4-5 стадии дифференцировки промывают один раз с соответствующим количеством PBS (2 мл на T25, 4 мл для T75 и 8 мл для T175 колбы) для удаления ФТС от культуры.
Примечание: ФТС блоков Трипсин-EDTA деятельности. - Затем, достаточное количество подогретого 0,05% трипсина-ЭДТА (2 мл на Т25, 4 мл для T75 и 8 мл колбу T175) добавляется в каждую колбу, чтобы покрыть клеточный монослой и инкубировали в течение 1-2 мин в 37 ° C увлажненном инкубаторе.
- Колба проверяется под микроскопом, чтобы оценить эффект Трипсин-EDTA на культуру. Колба затем провел с одной стороны, и ударил крепко С другой стороны, чтобы выбить из клетки в нижней части колбы.
- Равные объемы соевого ингибитора трипсина добавляется в колбу, чтобы утолить трипсина деятельности. Клеточную суспензию осторожно пипеткой вверх и вниз для обеспечения инактивации трипсина и добиться однородной одной клеткиподвеска.
Примечание: Кроме того, среда с добавлением 5% FCS может быть использован, чтобы утолить трипсина деятельности. - Чтобы удалить не-диссоциированных сгустки, суспензии клеток проходит через 40-мкм размер ячейки фильтра.
- Клеточной суспензии центрифугируют при 800 оборотов в минуту (110г) в течение 5 мин, супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в соответствующем объеме полной средней НСК.
- Конечный объем клеточной суспензии регулируется таким образом, что плотность клеток не превышает 2-3х10 6 -cells/ml. Высокая плотность клеток может привести к блокировке потоков в машине проточной цитометрии.
- Если вы хотите, чтобы изолировать нервных клеток только на основе их физических свойств, теперь вы можете приступить к сортировке FACS, как описано в части 4.
- Перед сортировкой, пропидия йодида (PI, Sigma, 500 мкг / мл в PBS) добавляется в концентрации 1 мкл / мл клеточной суспензии, чтобы исключить мертвые клетки.
Живой челл immunolabeling
Для достижения высокой чистоты из нервных клеток, собранных одной клетки из культуры НБА могут быть окрашены для PSA-NCAM (маркер ранних незрелых нейронов предшественников), а затем положительных клеток от нейронов населения могут быть выделены с помощью FACS машины.
- После выполнения клеток, суспензии отдельных клеток из культуры НБА разделены на четыре группы:
- Клетки только группы, служит в качестве контроля для настройки параметров и ворота (0,5-1 х 10 6 клеток).
- Клетки плюс ИП, служит в качестве контроля для настройки параметров и ворота (0,5-10 х 10 6 клеток). ИП негативные клетки из этой группы также могут быть отсортированы на основе клеток физических характеристик.
- Вторичный одиночку (Изотип контрольной) группе, которая также служит в качестве контроля для настройки параметров и ворота (1-2 х 10 6 клеток).
- Immunolabeling группа (8-10 х 10 6 клеток), который окрашивается на PSA-NCAM для достижениядальнейшей очистки от незрелых нервных клеток. Чтобы исключить мертвые клетки на сортировку, П. добавляется к этой группе.
- Для начала immunolabeling, клетки центрифугировали при 800 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин. Супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в 100 мкл полной среды НСК.
- Фикоэритрин (PE) сопряженных анти-PSA-NCAM антитело добавляется в соотношении 10 мкл / 5-10 х 10 6 клеток для клеточной суспензии для окрашенных для PSA-NCAM. Таким же образом, PE сопряженных мыши IgG1 изотипа контроль антител добавляют к клеточной суспензии контроль изотипа. Следуйте инструкциям на листе антител спецификации по концентрации антител, которые будут использоваться. Клеточной суспензии затем смешивается мягко и выдерживают при комнатной температуре в течение 10-15 мин в темноте.
- Клеточных суспензий (PSA-NCAM и труб Изотип управления), затем центрифугировали при 800 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин, супернатант удаляли и клетки повторно suspended в 1 мл полной среды НСК.
- Для удаления излишков неограниченной антитела из образцов, шаг 4 повторяется 2-3 раза.
- После повторного приостановления клеток в соответствующем объеме среды, пропидия йодида (PI, Sigma, 500 мкг / мл в PBS) добавляется в концентрации 1 мкл / мл суспензии клеток (клеток, а также ИП, изотип контроля и PSA- NCAM окрашенных образцов), чтобы исключить мертвые клетки, когда анализировали с помощью проточной цитометрии.
- 15 мл стерильной сокол пробирки 1 мл полной среды готовы собирать отсортированный клетки от различных клеточных популяций.
5. Флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS) незрелых нейронов
- Машина FACS устанавливается на основании его пользователем инструкцией по установке поток техник эксперт цитометрии.
- Фосфатного буфера (PBS) или любые другие соответствующие решения dependinг по инструкции производителя, могут быть использованы в качестве оболочки жидкости на 28 PSI через сопла 90 мкм.
- Перепад давления в системе регулируется таким образом, что скорость рода триггер не превышает 2500 события / сек.
- Суспензии клеток из клеток только группа проходит через машину FACS.
- Во-первых, клетки (событий), строятся с учетом их размеров (Forward Scatter (FSC), свет) по сравнению с внутренней сложности (бокового рассеяния (SSC), свет), чтобы отличить различных клеточных популяций. Для этого напряжение параметры FSC и SSC должны быть скорректированы таким образом, что клетки можно увидеть в сюжете проточной цитометрии.
- Чтобы исключить клетки сгустки и дублеты, клетки сначала построена на основе вперед площадь рассеяния (FSC-А) по сравнению с длительностью импульса вперед рассеяния (FSC-W) и одной клеточной популяции является закрытый, как численность населения 1 (P1). Тогда P1 клетки строятся на основе сторону разброс области (SSC-А) по сравнению с боковой разброс длительности импульса (FSC-З) и на этот раз одной клетки револьверред, как численность населения 2 (P2). Установив эти два последовательных ворот, сгустки или дублетов (высокий импульс FSC ширина и высокие SSC ширины импульса) в настоящее время исключена.
- Чтобы исключить мертвые или поврежденные клетки, единичные клетки (P2) строятся на основе PI реактивность по сравнению с FSC-и ни одного живого населения ячейки закрытого.
- Одноместный живые клетки строятся на основе ФСБ против SSC различать популяции клеток в зависимости от размера ячейки и внутренней детализации. На данном этапе две основные популяции клеток являются закрытого ФСБ как низкий низкий SSC (P3) и ФСБ высоких SSC высокий (P4) клеточных популяций.
- Чтобы отсортировать PSA-NCAM иммуно-реактивного незрелых нервных клеток из ФСБ низкой SSC низкий населения, в первую ФСБ низкой SSC низкий населения от управления (клетки плюс ИП и изотипа контроль) группы строится на основе иммунореактивности PE против FSC-и отрицательные Клетки закрытого (С-5), а затем положительных клеток с PSA-NCAMокрашенные группы населения, как закрытого 6 (Р6).
- После настройки всех необходимых ворота, клетки интересы разбиты на 15 мл стерильной культуры тканей пробирки 1мл НСК среды.
- Сортировать клетки затем центрифугировали при 1200 оборотов в минуту (240 г) в течение 5 мин.
- Супернатант отбрасывают и осадок ресуспендировали в соответствующий объем средства массовой информации (в зависимости от размера гранул) и клеток не производится.
- Затем клетки помещали в поли-L-орнитин покрытый 96-луночных планшетах с плотностью 20-30 х 10 3 клеток / лунку в 200-250 мкл полной среды НСК с 5% FCS и 20 нг / мл рекомбинантного человеческого BMP4 5 .
Примечание: для покрытия 96 лунок, 100 мкл раствора поли-L-орнитин рабочих (1,5 мл Poly-O и 8,5 мл стерильной PBS) добавляется в каждую лунку и пластину инкубируют при 37 ° C инкубатор, по крайней мере один час. Затем, Poly-O удаляется и каждый хорошо промывают три раза стерильной PBS(Пусть PBS остаться в яме в течение 10 минут каждый раз). Используйте 500 мкл поли-L-орнитин рабочего раствора / хорошо, если 24-луночных планшетах используется.
- Клетки затем фиксировали в различные моменты времени после сортировки, используя холодную 4% параформальдегида и immunostained соответствующих нейронов и глиальных маркеров клетки для оценки фенотипа отсортированные клетки от различных клеточных популяций.
6. Представитель Результаты
В нейробластов анализа (НБА) дифференциация культуры, покрытие клеток прикрепляться к субстрату культуре ткани и растут в виде монослоя. В зависимости от начальной плотности покрытия ячейки, культура превратится в 90-95% сливной культуры через 3-4 дня. На данном этапе в основном монослоя клеток астроцитов могут быть визуализированы под с маленькими круглыми нейронных клеток-предшественников на вершине 4,5 (рис. 1). После включения среды на фактор роста свободной среды, нервных клеток предшественников началаделения быстро и создания групп незрелых клеток нейробластов в верхней части астроцитарных монослоя в течение 4-5 дней (рис. 2). Проточная цитометрия Анализ диссоциированных культуры НБА на день 4-5 стадии дифференцировки, показывает два основных клеточных популяций, FSC низкой SSC низких и высоких FSC SSC высокие на основе размера ячейки (FSC) и внутренней детализации (SSC) (рис. 3). Иммуно-флуоресцентного анализа отсортированных клеток показывает, что нервные клетки расположены в основном в ФСБ низкой SSC низкий населения (более 75% из них выразить β-III тубулина), а отсортированные клетки от ФСБ высокой SSC высокой плотностью населения в основном GFAP иммунореактивного астроцитов (рис. 4). Дальнейшая очистка незрелых нервных клеток до почти однородности (97%) может быть достигнута с положительным выбор PSA-NCAM клеток из ИК ФСБ низкой SSC низкий населения (рис.3, 4). Обогащенный нервных клеток полученные от НСК изолированы от E14 мыши ганглиозные возвышенности приобретают фенотип и ГАМК-экспресс DARPP-32, маркер средних нейронов колючих, по дифференциации (рис. 5).
Рисунок 1. Нейробластов анализа культуры от E14 мышей нервных стволовых клеток в день 4 стадии распространения. Это монослоя культуры состоит из плоских клеток астроцитов (наконечники стрел), под и вокруг нервных клеток предшественников (стрелки) на вершине. Оригинальный увеличение, 20 х.
На рис. 2 нейробластов анализа культуры от E14 мыши нервные стволовые клетки на 4-й день дифференциации стадии: а) фазового контраста, B) иммунофлуоресцентного окрашивания. Обратите внимание на группу незрелых нервных клеток (стрелки B) в верхней части астроцитарных монослоя (наконечники стрел в, GFAP Окрашивание в B). Оригинальный увеличение, 20 х.
Рисунок 3. Участки представитель рода: а). ФСБ против SSC вид участка до исключения дубликатов и мертвых клеток. B, C). Сортировать участков для исключения дубликатов на основе FSC и SSC импульса. D). Исключение из мертвых и поврежденных клеток на основе йодида иммунореактивности пропидия. E). ФСБ против SSC участок после исключения дубликатов и отмершие клетки, показывая две основные популяции обозначены как ФСБ низкой SSC низких и высоких ФСБ SSC высокой численностью населения. F, G). Сортировать участков выделить PSA-NCAM ИК незрелые клетки, из ФСБ низкой SSC низкий населения.
Рисунок 4. Представитель микрофотографии из клеток отсортированный из разных популяций одного дня после покрытия.) FSC низкой SSC низкой численности населения (более 75% этих клеток нейроны). B) FSC высокой SSC высокой плотностью населения (большинство из них клетки астроциты ). С) PSA-NCAM + отсортированные клетки от FSC низкой SSC низкий населения (почти все отсортированные клетки нейронов). Оригинальный увеличение, 20 х.
Рисунок 5. Отсортировано незрелых нейронов дифференцироваться в нейроны, ГАМК (А) и экспресс-DARPP-32 (B), маркер для средних колючих нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Возможность изолировать определенный нейронных клеточных популяций (например, нейроны, астроциты и олигодендроциты) может решить некоторые из препятствий, связанных с клиническим применением нервные стволовые клетки (НСК). Во-первых, она позволяет нам в полной мере характеризуют начиная населения донорских клеток. Во-вторых, она позволяет использовать определенный тип клеток или сочетание различных типов клеток в определенном соотношении, в зависимости от характера и стадии заболевания. Наконец, с помощью обогащенного предварительно дифференцированный нейронные клетки предшественники могут значительно уменьшить возможное неконтролируемое распространение и образование опухолей, связанных с использованием гетерогенных нейронных предшественников содержащие добросовестных НСК 6. Вообще дифференциации нервных стволовых клеток может привести к 5-10% нервных клеток и более 80% астроцитов. Используя метод НБА дифференциации, процент нервных клеток возрастет до 20-30%, но все еще есть много астроциты и другие стволовые и рrogenitor клеток в культуре, которая не может быть желательным, если бы намерены изучить чистый нервных клеток в пробирке или изучать их терапевтический эффект на животных моделях неврологических заболеваний. В этом протоколе мы воспользовались врожденные различия в физических и флуоресцентные свойства дифференциации НСК потомство, чтобы очистить незрелых нервных клеток 5. Наши проточной цитометрии очистки методология увеличивает процент нервных клеток от 20-30% до 75-97%, не обнаружено астроциты и не-дифференцированных добросовестных нейронных стволовых и прогениторных клеток.
Применение этой методики на человеческих НСК могут воспользоваться нейронной терапии клетки в неврологическое заболевание. Такой подход может оказаться полезным для лабораторного исследования, которые должны высокоочищенного нейронных клеток-предшественников, таких как наркотики, Нейротоксикология, развития исследований и электрофизиологии.
Для того, чтобы последовательно GEnerate высокого качества незрелых нейронов НСК полученные от E14 мыши ганглиозные возвышения, мы рекомендуем:
- Не позволяйте сферы становятся слишком большими. Большой нейросферы связано с более гибели клеток и менее нейрогенной способности.
- Не trypsinize сфере более 2-3 минут. Оставив трипсин более чем на 3 минуты приводит к повреждению клеток и уменьшает их нейрогенной эффективности.
- Не позволяйте пролиферирующих монослоя стать более-вырожденная. Это может помешать их нормальному процессу дифференциации. Всегда, когда переключение среднего культуры составляет около 90% слияния.
- Чтобы культура среднего изменения накануне рода. Это кондиционированной среды могут быть собраны в день сортировки и используются для покрытия клеток. Эта среда содержит много неизвестных растворимых факторов, из клеток астроцитов, которые помогут отсортированы незрелых нервных клеток, чтобы выжить и получить более зрелый фенотип.
- Как недостатки этого технологии, проходя суспензии клеток, хотя машина проточная цитометрия может быть связано с некоторыми рисками, включая поперечная сила, что может привести к повреждению клеток и вызывает гибель клеток на вид, а также грибковой или бактериальной загрязненности. Чтобы избежать повреждения поперечной силы, мы рекомендуем сортировки клетки с приемлемой скоростью, и с помощью правой жидкости оболочкой (PBS рекомендуется) и правого сопла размера (90-100 мкм), чтобы не допустить скорость рода триггером превышает 2500 события / сек. Чтобы избежать заражения, убедитесь, что прибор был очищен правильное использование дезинфицирующих реагентов до рода, а также использовать антибиотики в сборе среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансирование от Фонда Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Biosciences | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | Dako | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega Corp. | G7121 | |
| *To make HEM, mix 1 x 10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
References
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
