Summary
इस वीडियो प्रोटोकॉल पीढ़ी और neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के बाद शुद्धि तंत्रिका स्टेम सेल का एक अक्षय स्रोत (एनएससी) से उनकी शारीरिक (आकार और आंतरिक granularity) और गुण फ्लोरोसेंट प्रवाह cytometry प्रौद्योगिकी का उपयोग के आधार पर के लिए एक उपन्यास विधि को दर्शाता है.
Abstract
तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) और अलग किया जा सकता है में विस्तार बड़े पैमाने पर, neurosphere परख का उपयोग कर और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) प्रणाली के तीन प्रमुख प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव, अर्थात्, astrocytes oligodendrocytes, और न्यूरॉन्स. इन विशेषताओं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और पूर्वपुस्र्ष को दवा स्क्रीनिंग, neurotoxicology, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के रूप में इन विट्रो अध्ययन में और भी कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में सेल प्रतिस्थापन उपचार के लिए के लिए एक अमूल्य कोशिकाओं के अक्षय स्रोत बनाते हैं. अभ्यास में, तथापि, एनएससी संतान, न्यूरॉन्स और oligodendrocytes का कम उत्पादन है, और भेदभाव के बाद उनके नैदानिक अनुप्रयोगों सीमा astrocytes की प्रबलता की विविधता है. यहाँ, हम murine एनएससी संतान से अपरिपक्व न्यूरॉन्स प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) तकनीक का उपयोग कर की पीढ़ी और बाद में शुद्धीकरण के लिए एक उपन्यास पद्धति का वर्णन. इस पद्धति का उपयोग करना, अत्यधिक समृद्ध neuronal पूर्वपुस्र्ष सेल आबादी बुद्धि प्राप्त किया जा सकता हैकिसी भी ध्यान देने योग्य अस्थिकणिका और प्रामाणिक एनएससी संदूषण hout. प्रक्रिया एनएससी संतान अलग और E14 माउस ganglionic neurosphere परख का उपयोग eminences, उनके (आकार और आंतरिक जटिलता) और शारीरिक फ्लोरोसेंट प्रवाह cytometry प्रौद्योगिकी का उपयोग गुण के आधार पर अलगाव और अपरिपक्व neuronal कोशिकाओं के संवर्धन के बाद से विस्तार की भिन्नता शामिल है. कुल मिलाकर, यह 5-7 दिनों के लेता है neurospheres और 6-8 दिनों उत्पन्न करने के लिए एनएससी संतान अंतर और अत्यधिक शुद्ध अपरिपक्व neuronal कोशिकाओं को अलग.
Protocol
1. बुनियादी सेल संस्कृति के लिए आगे बढ़ने से पहले सेट अप
- एक 9:01 के अनुपात में NeuroCult एनएससी बेसल मध्यम और NeuroCult एनएससी प्रसार पूरक मिश्रित कर रहे हैं, क्रमशः, पूरा एनएससी मध्यम.
- 37 ° C पानी के स्नान मध्यम गर्म करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- गर्मी निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) की उचित मात्रा में thawed है.
- स्टॉक वृद्धि कारक epidermal वृद्धि कारक (EGF 10 / μg एमएल), बुनियादी तंतुप्रसू संबंधी वृद्धि कारक (ख FGF 10 / μg एमएल) और 0.2% फॉस्फेट में हेपरिन समाधान सहित समाधान की उचित राशि बफर खारा (पीबीएस) thawed रहे हैं.
- टिशू कल्चर बोतल (T25, T75 या T175) एनएससी विस्तार और भेदभाव के लिए की जरूरत है.
- टिशू कल्चर 96 और 24 प्लेट अच्छी तरह से इलाज किया और कांच coverslips हल कोशिकाओं चढ़ाना के लिए की जरूरत है.
2. अलगाव, एनएससी और विस्तार (Passaging)
- तंत्रिका स्टेम और progenitors अलग और माउस ख से विस्तार कर रहे हैंबारिश के रूप में अलग प्रोटोकॉल 1 2 3 में वर्णित है.
- जब neurospheres (या तो प्राथमिक या passaged neurospheres) उपसंस्कृति (व्यास में 150-200 माइक्रोन) के लिए तैयार हैं, मध्यम युक्त क्षेत्रों के एक उचित आकार बाँझ ऊतक संस्कृति ट्यूब के लिए स्थानांतरित कर रहा है, और 5 मिनट के लिए 800 से अधिक आरपीएम (110 ग्राम) में Centrifuged कमरे के तापमान पर.
- सतह पर तैरनेवाला मध्यम निकाल दिया है और क्षेत्रों के पूर्व गर्म 0.05% trypsin - EDTA के 1 मिलीग्राम में फिर से निलंबित कर दिया.
- 2-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ऊष्मायन के बाद, सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के एक बराबर मात्रा सेल निलंबन के लिए जोड़ा जाता है trypsin गतिविधि को रोकने.
- सुनिश्चित करें कि trypsin पूरी तरह से निष्क्रिय किया गया है, सेल निलंबन धीरे से ऊपर pipetted है और नीचे 3-5 बार.
- 5 मिनट के लिए 800 आरपीएम (110 ग्राम) पर centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटा दिया है और कोशिकाओं पूरा एनएससी मध्यम के 1 मिलीग्राम में फिर से निलंबित कर दिया.
- सेल निलंबन की 10μl trypa के 90 μl साथ मिलाया जाता हैपता नीले सेल गिनती का प्रदर्शन करने के लिए.
नोट: अन्य उपयुक्त कक्ष dilutions के भी इस्तेमाल किया जा सकता है. - कोशिकाओं तो उपसंस्कृति 1, 2 के लिए या भेदभाव के लिए उपयोग किया जाता है के रूप में नीचे वर्णित है.
3. तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और पूर्वपुस्र्ष के भेदभाव, Neuroblast, परख (एनबीए)
- अलग neurospheres से उत्पन्न कोशिकाओं 2-3 एक्स 5 10/20 एनजी / मिलीलीटर EGF, 10 एनजी / एमएल bFGF, 1 / हेपरिन 0.2% की μl मिलीग्राम और 5% के साथ पूरा एनएससी पूरक मध्यम में कोशिकाओं मिलीलीटर की एकाग्रता में चढ़ाया जाता है गर्मी एक उपयुक्त आकार टिशू कल्चर फ्लास्क में एफसीएस निष्क्रिय. 5 मिलीलीटर मध्यम T25, T75 के लिए 20 मिलीलीटर और T175 बोतल के लिए 40 मिलीलीटर के लिए प्रयोग किया जाता है.
नोट: एफसीएस कोशिकाओं को मजबूती से सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने के लिए कारण और वहाँ एनबीए संस्कृति के लिए बोतल कोटिंग के लिए कोई ज़रूरत नहीं है जाएगा. - पंथउरे बोतल तो 3-4 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर में incubated. इस अवधि के प्रसार मंच कहा जाता है, जिसके दौरान एनएससी संतान सब्सट्रेट करने के लिए देते हैं और कक्षों की एक monolayer के रूप में पैदा.
- जब संस्कृति 90-95% संगामी, प्रत्येक कुप्पी का माध्यम बन जाता है पूरा एनएससी मध्यम बिना किसी वृद्धि कारक है FCS 5% के साथ पूरक करने के लिए बंद है.
- संस्कृति बोतल फिर से एक और 3-4 दिनों के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर में incubated. इस अवधि में भेदभाव मंच कहा जाता है, जिसके दौरान neuronal progenitors एक astrocytic में monolayer शीर्ष पर दिखाई देते हैं और अपरिपक्व neuronal कोशिकाओं की कालोनियों पैदा. भेदभाव चरण के 4-5 दिन पर, संस्कृति neuroblast प्रवाह cytometry प्रौद्योगिकी का उपयोग कोशिकाओं के अलगाव के लिए तैयार है.
4. फ्लो के लिए सेल तैयार
Trypsinization
- भेदभाव चरण के 4-5 दिन के पर एनएससी संतान फर्क करने की संस्कृति को एक बार के पीबीएस का एक उचित मात्रा (T25 के लिए 2 मिलीग्राम, T75 के लिए 4 मिलीग्राम और 8 T175 कुप्पी के लिए मिलीलीटर) संस्कृति से एफसीएस को दूर करने के साथ धोया जाता है.
नोट: एफसीएस trypsin - EDTA गतिविधि को रोकता है. - फिर, पूर्व गर्म 0.05% trypsin EDTA (2 T25 के लिए मिलीग्राम, T75 के लिए 4 मिलीग्राम और 8 T175 कुप्पी के लिए मिलीग्राम) की एक पर्याप्त राशि प्रत्येक कुप्पी करने के लिए जोड़ा है सेल monolayer को कवर करने के लिए और एक 1-2 मिनट के लिए incubated रहे 37 ° सी humidified इनक्यूबेटर.
- कुप्पी trypsin EDTA की संस्कृति पर प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए खुर्दबीन के नीचे की जाँच की है. कुप्पी तो एक हाथ से आयोजित किया जाता है और दूसरे हाथ से मजबूती से मारा कुप्पी के नीचे से कोशिकाओं को जगह देना.
- सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के बराबर मात्रा कुप्पी trypsin गतिविधि बुझाना करने के लिए जोड़ा जाता है. सेल निलंबन धीरे से ऊपर pipetted है और नीचे trypsin निष्क्रियता को सुनिश्चित करने के लिए और एक समरूप एकल कक्ष प्राप्तनिलंबन.
नोट: वैकल्पिक रूप से, 5% है FCS साथ पूरक मध्यम trypsin गतिविधि बुझाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. - गैर - अलग clumps को हटाने के लिए, सेल निलंबन 40 माइक्रोन आकार के एक जाल फिल्टर के माध्यम से पारित हो जाता है.
- सेल निलंबन फिर 5 मिनट के लिए 800 आरपीएम (110g) में Centrifuged है, सतह पर तैरनेवाला निकाल दिया है और कोशिकाओं पूरा एनएससी मध्यम के एक उचित मात्रा में फिर से निलंबित कर दिया.
- सेल निलंबन के अंतिम मात्रा समायोजित किया जाता है ताकि सेल घनत्व 6 2 - 3x10 -cells/ml से अधिक नहीं है. उच्च घनत्व सेल धारा प्रवाह cytometry मशीन में रुकावट पैदा कर सकता है.
- यदि आप सिर्फ उनके भौतिक गुणों पर आधारित के लिए neuronal कोशिकाओं को अलग करना चाहते हैं, अब आप FACS छँटाई रूप में भाग 4 में वर्णित करने के लिए आगे बढ़ सकते हैं.
- छँटाई के पहले, Propidium आयोडाइड (पीआई, सिग्मा, 500 / पीबीएस में μg मिलीलीटर) 1 μl मिलीग्राम / सेल निलंबन की मृत कोशिकाओं को बाहर के एक एकाग्रता में जोड़ा जाता है.
सेल लाइवएल immunolabeling
Neuronal कोशिकाओं के एक उच्च शुद्धता, एनबीए संस्कृति से एकल कक्ष (जल्दी अपरिपक्व neuronal progenitors के एक मार्कर) पीएसए - NCAM के और उसके बाद neuronal जनसंख्या से सकारात्मक कोशिकाओं के लिए काटा कलंकित किया जा सकता प्राप्त करने के FACS मशीन का उपयोग कर अलग किया जा सकता है.
- एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करने के बाद, एनबीए संस्कृति से एकल कक्ष निलंबन चार समूहों में विभाजित है:
- अकेले कोशिकाओं के समूह, मानकों और फाटक (0.5-1 एक्स 10 6 कोशिकाओं) को समायोजित करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है.
- कोशिकाओं से अधिक पीआई, मानकों और फाटक (0.5-10 एक्स 10 6 कोशिकाओं) को समायोजित करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. इस समूह से पीआई नकारात्मक कोशिकाओं कोशिकाओं शारीरिक विशेषताओं के आधार पर हल किया जा सकता है.
- माध्यमिक अकेला (निर्धारण नियंत्रण) समूह भी है कि मानकों और फाटक (1-2 एक्स 10 6 कोशिकाओं) को समायोजित करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है.
- Immunolabeling समूह (8-10 एक्स 10 6 कोशिकाओं) कि पीएसए NCAM के लिए दाग को प्राप्त करने के लिएअपरिपक्व neuronal कोशिकाओं के आगे शोधन. छँटाई पर मृत कोशिकाओं को बाहर, PI इस समूह के लिए जोड़ा जाता है के रूप में अच्छी तरह से.
- Immunolabeling शुरू, कोशिकाओं के 5 मिनट के लिए 800 आरपीएम (110 ग्राम) Centrifuged कर रहे हैं. सतह पर तैरनेवाला निकाल दिया है और कोशिकाओं पूरा एनएससी माध्यम के 100 μl में फिर से निलंबित कर दिया.
- (पीई) phycoerythrin संयुग्मित एंटीबॉडी विरोधी पीएसए - NCAM के सेल निलंबन के लिए पीएसए NCAM के लिए कलंकित किया जा करने के लिए 10 / μl 5-10 x 10 6 कोशिकाओं के अनुपात में जोड़ा जाता है. उसी तरह, एक पीई संयुग्मित माउस IgG1 निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी निर्धारण नियंत्रण कक्ष निलंबन के लिए जोड़ा जाता है. एंटीबॉडी विनिर्देश शीट पर एंटीबॉडी की एकाग्रता के लिए इस्तेमाल किया जा के बारे में निर्देशों का पालन करें. सेल निलंबन फिर धीरे से मिलाया जाता है और अंधेरे में 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर incubated रहे.
- सेल निलंबन (पीएसए NCAM और निर्धारण नियंत्रण ट्यूब) फिर 5 मिनट के लिए 800 आरपीएम (110 ग्राम) में में Centrifuged कर रहे हैं, सतह पर तैरनेवाला निकाल दिया है और कोशिकाओं को फिर से suspeपूरा एनएससी मध्यम के 1 मिलीग्राम में nded है.
- नमूने से अतिरिक्त संयुक्त राष्ट्र घिरा एंटीबॉडी को दूर करने के लिए कदम 4 2-3 बार दोहराया है.
- पुनः के बाद मध्यम के एक उचित मात्रा में निलंबित कोशिकाओं, Propidium आयोडाइड (पीआई, सिग्मा, 500 / पीबीएस में μg मिलीलीटर) 1 सेल निलंबन की μl / मिलीलीटर (कोशिकाओं से अधिक पीआई, निर्धारण नियंत्रण और एकाग्रता में जोड़ा पीएसए NCAM से सना हुआ नमूने) मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए जब प्रवाह cytometry से विश्लेषण किया.
- 15 मिलीलीटर बाँझ बाज़ पूरा मध्यम के 1 मिलीग्राम से युक्त ट्यूबों के लिए अलग सेल आबादी से हल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए तैयार हैं.
5. अपरिपक्व न्यूरॉन्स के प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS)
- FACS मशीन प्रवाह cytometry सुविधा विशेषज्ञ तकनीशियन के माध्यम से उपयोगकर्ता पुस्तिका अनुदेश के आधार पर सेट कर दिया जाता है.
- फास्फेट (पीबीएस) खारा या किसी भी अन्य उचित समाधान dependin के बफरनिर्माता के निर्देशों पर जी, एक 90 माइक्रोन नोक के माध्यम से 28 साई पर म्यान तरल पदार्थ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- प्रणाली पर दबाव अंतर है कि इस तरह के प्रकार ट्रिगर दर 2500 की घटनाओं / दूसरे से अधिक नहीं है निकाला जाता है.
- अकेले कोशिकाओं से सेल निलंबन समूह के FACS मशीन के माध्यम से चलाया जाता है.
- सबसे पहले, कोशिकाओं (घटनाओं) उनके आकार (फॉरवर्ड (FSC) स्कैटर प्रकाश) बनाम आंतरिक जटिलता (साइड स्कैटर प्रकाश (एसएससी)) के लिए अलग सेल आबादी भेद के आधार पर प्लॉट किए जाते हैं. ऐसा करने के लिए, FSC और एसएससी के लिए वोल्टेज पैरामीटर समायोजित किया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं प्रवाह cytometry साजिश में देखा जा सकता है.
- सेल clumps और दोहरी बाहर कोशिकाओं पहले आगे तितर बितर क्षेत्र (FSC-A) बनाम आगे तितर बितर पल्स चौड़ाई (FSC डब्ल्यू) और एकल कक्ष जनसंख्या 1 आबादी (P1) के रूप में gated है के आधार पर प्लॉट किए जाते हैं. फिर P1 कोशिकाओं ओर बिखराव क्षेत्र (एसएससी ए) बनाम ओर बिखराव पल्स चौड़ाई (FSC डब्ल्यू) और इस समय एकल कक्षों तमंचा रहे हैं के आधार पर प्लॉट किए जाते हैं2 जनसंख्या (p2) के रूप में एड. इन दो लगातार फाटकों के clumps, या दोहरी (उच्च FSC पल्स चौड़ाई और उच्च एसएससी पल्स चौड़ाई) की स्थापना बाहर रखा जा रहा है.
- मृत या क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को बाहर, एकल कक्षों (p2) FSC एक और एक जीवित कोशिका जनसंख्या gated है बनाम पीआई जेट के आधार पर प्लॉट किए जाते हैं.
- एकल जीवित कोशिकाओं FSC बनाम एसएससी पर आधारित प्लॉट किए जाते हैं के लिए अलग सेल सेल आकार और आंतरिक कणिकता है पर आधारित आबादी के भेद. इस चरण में दो मुख्य सेल आबादी FSC कम एसएससी (पी 3) कम और FSC उच्च एसएससी (पी 4) उच्च सेल आबादी के रूप में gated हैं.
- वर्गीकरण करने के लिए पीएसए NCAM FSC कम एसएससी कम आबादी से इम्युनो - प्रतिक्रियाशील अपरिपक्व neuronal कोशिकाओं, पहले FSC नियंत्रण से कम एसएससी कम जनसंख्या (प्लस PI और निर्धारण नियंत्रण कोशिकाओं) समूह पे immunoreactivity पर आधारित FSC एक बनाम साजिश रची है और नकारात्मक कोशिकाओं gated हैं (P5), और फिर पीएसए NCAM से सकारात्मक कोशिकाओंदाग समूह 6 आबादी (P6) के रूप में gated हैं.
- सभी की जरूरत फाटक समायोजन करने के बाद, हितों की कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर बाँझ ऊतक संस्कृति 1ml एनएससी मध्यम युक्त ट्यूबों में क्रमबद्ध हैं.
- क्रमबद्ध करें कोशिकाओं को फिर 5 मिनट के लिए 1200 आरपीएम (240 ग्राम) में Centrifuged कर रहे हैं.
- सतह पर तैरनेवाला त्याग और गोली मध्यम (गोली के आकार पर निर्भर करता है) और एक सेल गिनती का एक उचित मात्रा में फिर से निलंबित कर दिया है प्रदर्शन.
- कोशिकाओं तो कर रहे हैं / अच्छी तरह से पूरा एनएससी मध्यम 200-250 μl में 20-30 एक्स 10 3 कोशिकाओं के घनत्व पाली - के एल ornithine लेपित 96 अच्छी तरह से प्लेट में 5% है FCS और 20 एनजी / मिलीलीटर से पुनः संयोजक मानव BMP4 5 से मढ़वाया .
नोट: 96 कुओं, पाली - एल ornithine काम समाधान की 100 μl कोट (1.5 मिलीलीटर पाली हे और बाँझ पीबीएस के 8.5 मिलीग्राम) एक अच्छी तरह से जोड़ा जाता है और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली को कम से कम एक के लिए incubated है घंटा. फिर, पाली - हे हटा दिया है और बाँझ पीबीएस के साथ एक अच्छी तरह तीन बार धोया जाता हैपीबीएस 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से में हर समय रहना. पाली - एल ornithine समाधान / अच्छी तरह से अगर 24 अच्छी तरह से प्लेट का इस्तेमाल कर रहे हैं काम के 500 μl का प्रयोग करें.
- कोशिकाओं तो तरह ठंड 4% paraformaldehyde का उपयोग करने के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर तय की और उचित neuronal और glial सेल मार्कर के लिए immunostained अलग सेल आबादी से हल कोशिकाओं के phenotype का आकलन है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
Neuroblast परख (एनबीए) भेदभाव संस्कृति में, मढ़वाया कोशिकाओं ऊतक संस्कृति सब्सट्रेट के लिए देते हैं और एक monolayer के रूप में विकसित. प्रारंभिक सेल चढ़ाना घनत्व पर निर्भर करता है, संस्कृति एक 90-95% संगामी संस्कृति में 3-4 दिन के बाद बंद हो जाएगा. इस स्तर पर, मुख्य रूप से astrocytic कोशिकाओं की एक monolayer छोटे गोल 4,5 शीर्ष पर neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (चित्रा 1) के साथ कल्पना नीचे हो सकता है. वृद्धि कारक मुक्त मध्यम मध्यम स्विचन के बाद, neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं शुरूतेजी से विभाजित है और 4-5 दिन में astrocytic monolayer (चित्रा 2) के शीर्ष पर अपरिपक्व neuroblast के कोशिकाओं के समूहों उत्पन्न. FSC कम SSC कम और FSC उच्च एसएससी उच्च सेल आकार (FSC) और आंतरिक कणिकता (एसएससी) (चित्रा 3) पर आधारित है, अलग एनबीए संस्कृति के प्रवाह cytometry विश्लेषण भेदभाव चरण के 4-5 दिन पर, दो मुख्य सेल आबादी से पता चलता है. इम्यूनो फ्लोरोसेंट हल कोशिकाओं के विश्लेषण से पता चलता है कि neuronal कोशिकाओं को मुख्य रूप से के FSC कम एसएससी कम आबादी (उनमें से 75% से अधिक β-III ट्यूबिलिन व्यक्त के साथ) में स्थित हैं, जबकि FSC उच्च एसएससी उच्च जनसंख्या से हल कोशिकाओं ज्यादातर GFAP immunoreactive astrocytes (चित्रा 4). अपरिपक्व neuronal कोशिकाओं के आगे के पास एकरूपता (97%) के लिए शोधन FSC कम SSC कम जनसंख्या (चित्रा से पीएसए NCAM IR कोशिकाओं के सकारात्मक चयन के साथ प्राप्त किया जा सकता है3, 4). समृद्ध neuronal कोशिकाओं E14 माउस ganglionic eminences से अलग एनएससी से उत्पन्न एक GABAergic phenotype और भेदभाव पर व्यक्त DARPP-32, मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स की एक मार्कर, (चित्रा 5) का अधिग्रहण.
चित्रा 1. प्रसार चरण के 4 दिन पर E14 माउस तंत्रिका स्टेम सेल से Neuroblast परख संस्कृति. इस monolayer संस्कृति में फ्लैट astrocytic कोशिकाओं (तीर) नीचे और दौर शीर्ष पर neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (तीर) के होते हैं. मूल बढ़ाई, x 20.
ए) चरण के विपरीत, बी) Immunofluorescent धुंधला:. आंकड़ा भेदभाव चरण के 4 दिन पर E14 माउस तंत्रिका स्टेम सेल से Neuroblast 2 परख संस्कृति. नोट अपरिपक्व तंत्रिका कोशिकाओं (क्लस्टर एक में तीर बी में β तृतीय ट्यूबिलिन astrocytic monolayer (ए, बी में GFAP धुंधला में तीर सिर) के शीर्ष पर) धुंधला हो जाना. मूल बढ़ाई, x 20.
. चित्रा 3 प्रतिनिधि तरह भूखंडों: एक). FSC बनाम दोहरी और मृत कोशिकाओं के बहिष्कार से पहले एसएससी तरह साजिश. बी, सी). दोहरी के बहिष्कार के लिए भूखंडों के आधार पर क्रमबद्ध FSC और एसएससी पल्स चौड़ाई डी. के आधार पर). मर चुका है और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के बहिष्करण Propidium आयोडाइड immunoreactivity पर आधारित ई.). FSC, बनाम एसएससी दोहरी और मृत कोशिकाओं के बहिष्कार के बाद साजिश, दो मुख्य FSC, कम से एसएससी कम और FSC उच्च एसएससी उच्च आबादी के रूप में चिह्नित आबादी दिखा एफ, जी). क्रमबद्ध करें भूखंडों FSC कम एसएससी कम आबादी से पीएसए NCAM IR अपरिपक्व कोशिकाओं को अलग करने के लिए की.
चित्रा 4 कोशिकाओं से प्रतिनिधि micrographs अलग आबादी से चढ़ाना के बाद एक दिन हल ए) FSC कम एसएससी कम जनसंख्या (इन कोशिकाओं को न्यूरॉन्स की 75% से अधिक) बी) FSC उच्च एसएससी (जनसंख्या के बहुमत इन कोशिकाओं. Astrocytes हैं ). सी) पीएसए NCAM FSC कम SSC कम आबादी (लगभग हल कोशिकाओं के सभी न्यूरॉन्स हैं) से हल कोशिकाओं. मूल आवर्धन, x 20.
संख्या 5. क्रमबद्ध करें अपरिपक्व न्यूरॉन्स GABAergic (ए) न्यूरॉन्स और एक्सप्रेस DARPP-32 (बी), मध्यम काँटेदार न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर में अंतर.
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Discussion
परिभाषित तंत्रिका कोशिका आबादी को अलग करने की क्षमता (यानी न्यूरॉन्स astrocytes और oligodendrocytes) के तंत्रिका स्टेम सेल के नैदानिक अनुप्रयोग (एनएससी) के साथ जुड़े बाधाओं का समाधान हो सकता है. सबसे पहले, यह हमें सक्षम बनाता है पूरी तरह से दाता कोशिकाओं की आबादी शुरू विशेषताएँ. दूसरा, यह हमें एक विशिष्ट अनुपात के साथ एक विशेष सेल प्रकार या विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का एक संयोजन का उपयोग करने के लिए अनुमति देता है, या बीमारी की प्रकृति के मंच पर निर्भर करता है. अन्त में, अत्यधिक समृद्ध पूर्व विभेदित तंत्रिका कोशिका progenitors का उपयोग नाटकीय रूप से संभव अनियंत्रित प्रसार और ट्यूमर गठन विषम तंत्रिका सदाशयी 6 एनएससी युक्त व्यापारियों का उपयोग करने के साथ जुड़े को कम कर सकते हैं. आम तौर पर तंत्रिका स्टेम सेल भेदभाव 5-10% neuronal कोशिकाओं और 80% से अधिक astrocytes में परिणाम देगा. एनबीए भेदभाव की विधि का प्रयोग, neuronal कोशिकाओं का प्रतिशत 20-30% तक वृद्धि लेकिन अभी भी वहाँ astrocytes के बहुत सारे और अन्य स्टेम और पी रहे हैंसंस्कृति में rogenitor के कोशिकाओं, जो वांछनीय नहीं हो सकता है अगर एक के लिए इन विट्रो में शुद्ध neuronal कोशिकाओं का अध्ययन या स्नायविक रोगों के पशु मॉडल में उनके उपचारात्मक प्रभाव का अध्ययन करने का इरादा हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम एनएससी संतान फर्क की शारीरिक और फ्लोरोसेंट गुणों में निहित मतभेद का फायदा उठाया अपरिपक्व neuronal कोशिकाओं 5 शुद्ध. हमारे प्रवाह cytometry शुद्धीकरण पद्धति नहीं detectable astrocytes और संयुक्त राष्ट्र से विभेदित सदाशयी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और पूर्वपुस्र्ष के साथ 20-30% से 75-97% करने के लिए neuronal कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ जाती है.
इस पद्धति के आवेदन मानव एनएससी के लिए स्नायविक रोग में neuronal सेल प्रतिस्थापन चिकित्सा लाभ हो सकता है. यह दृष्टिकोण भी इन विट्रो अध्ययन में है कि अत्यधिक दवा स्क्रीनिंग, neurotoxicology, विकास अध्ययन और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के रूप में neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को शुद्ध की जरूरत है के लिए उपयोगी हो सकता है.
लगातार जीई करने में सक्षम होनाE14 माउस ganglionic eminences से उत्पन्न एनएससी से उच्च गुणवत्ता अपरिपक्व न्यूरॉन्स nerate, हम अनुशंसा करते हैं:
- नहीं क्षेत्रों भी बड़े हो जाना. बड़े neurospheres अधिक कोशिका मृत्यु और कम तंत्रिकाजन्य क्षमता के साथ जुड़े रहे हैं.
- क्षेत्रों के लिए अधिक से अधिक 2-3 मिनट के लिए नहीं trypsinize. अधिक से अधिक 3 मिनट के लिए trypsin छोड़कर कोशिकाओं को नुकसान का कारण बनता है और उनके तंत्रिकाजन्य दक्षता कम हो जाती है.
- Proliferating के monolayer अधिक से मिला हुआ हो. यह अपने सामान्य भेदभाव प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. हमेशा की तरह, मध्यम स्विच जब संस्कृति के बारे में 90% confluency तक पहुँचता है.
- संस्कृति तरह से पहले दिन पर एक मध्यम परिवर्तन दे. यह वातानुकूलित माध्यम की तरह दिन पर एकत्र किया जा सकता है और चढ़ाना कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया. इस मध्यम astrocytic कोशिकाओं है कि हल अपरिपक्व neuronal कोशिकाओं को जीवित करने के लिए और एक अधिक परिपक्व phenotype के अधिग्रहण में मदद मिलेगी से अज्ञात घुलनशील कारकों की एक बहुत कुछ शामिल है.
- इस टी कमियांechnology, सेल निलंबन गुजर हालांकि प्रवाह cytometry मशीन कि कोशिकाओं को नुकसान का कारण हो सकता है प्रकार और भी कवक या जीवाणु संक्रमण पर कोशिका मृत्यु बाल काटना बल सहित कुछ जोखिम के साथ जुड़ा हो सकता है. बल कर्तन द्वारा क्षति से बचने के लिए, हम एक उचित गति से सेल छँटाई, और सही म्यान (पीबीएस सिफारिश की है) तरल पदार्थ और सही आकार नलिका (90-100 माइक्रोन) का उपयोग नहीं तरह ट्रिगर दर 2500 की घटनाओं / दूसरे से अधिक की सलाह देते हैं. संक्रमण से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि साधन ठीक से साफ किया गया है निस्संक्रामक अभिकर्मकों तरह से पहले का उपयोग कर बनाने के लिए और भी अपने एकत्रित मध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करें.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम Overstreet फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Biosciences | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | Dako | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega Corp. | G7121 | |
| *To make HEM, mix 1 x 10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
References
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
