Summary
这个视频协议，表明了新方法的产生和后续的纯化，根据自己的身体（大小和内部的粒度）和荧光性能，使用流式细胞仪技术从可再生来源的神经干细胞（NSCs）的神经祖细胞。
Abstract
神经干细胞（NSCs）可以分离和扩大规模大，使用的神经球法和中枢神经系统（CNS）的三个主要类型的细胞分化，即星形胶质细胞，少突胶质细胞和神经元。这些特点使神经干细胞和祖细胞在体外研究，如药物筛选，神经毒理学和电，也为许多神经系统疾病的细胞替代疗法的一个宝贵的可再生的细胞来源。然而，在实践中，国科会的后代，低生产的神经元和少突胶质细胞和星形胶质细胞的分化限制其临床应用后优势的异质性。在这里，我们描述了一个新颖的方法，利用荧光激活细胞分选（FACS）技术，从国科会的后代小鼠未成熟神经元的生成和随后净化。使用这种方法，一个非常丰富的神经祖细胞的人口可达到机智豪特任何明显的星形胶质细胞和真正的国科会污染。该程序包括分化E14小鼠神经节隆起，使用的神经球检测其物理（大小和内部的复杂性）和荧光性能，使用流式细胞仪技术的基础上，由未成熟的神经细胞的分离和富集分离和扩大NSC的后代。总体而言，它需要5-7天，产生神经球和6-8天来区分国科会的后代和分离高纯度未成熟的神经细胞。
Protocol
1。细胞培养之前基本设置
- 国科会NeuroCult基础培养基和NeuroCult国科会扩散补充，以9:1的比例混合，分别作出完整的国科会介质。
- 37℃水浴用于热身介质。
- 适量热灭活胎牛血清（FCS）的解冻。
- 适量股票生长因子解决方案，包括表皮生长因子（表皮生长因子在10微克/毫升），碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF的10微克/毫升）和0.2％肝素溶液磷酸缓冲液（PBS）解冻。
- 组织培养瓶（的T25，T75和T175）国科会扩大和分化的需要。
- 组织培养处理96和24孔板和盖玻片电镀排序细胞所需要的。
2。隔离和扩展的神经干细胞（传代）
- 神经干细胞和祖细胞的分离和扩大小鼠B下雨作为单独的协议1 2 3描述。
- 当神经球（小学或传代神经球）是亚文化（直径在150-200微米），培养基的领域转移到一个适当大小的无菌组织培养管，离心5分钟，在800转（110克）在室温下。
- 培养上清液中被删除，球都在重新悬浮预热的0.05％胰蛋白酶EDTA 1毫升。
- 培养在37℃水浴2-3分钟后，大豆胰蛋白酶抑制剂的加入同等体积的细胞悬液，以阻止胰蛋白酶的活性。
- 为了确保已完全灭活的胰蛋白酶，轻轻洗涤后的细胞悬液，下降了3-5倍。
- 在800转（110克），5分钟后离心，上清液被删除，在1毫升完整的国科会培养基重新悬浮细胞。
- 90μl的trypa的混合细胞悬液10μLñ蓝进行细胞计数。
注：也可用于其他合适的细胞稀释。 - 继代1，2或分化的细胞，然后使用如下所述。
3。神经干细胞和祖细胞的分化， 神经母细胞含量（NBA的）
- 分离神经球的细胞被镀在2-3×10 5细胞/毫升完整的国科会20毫微克/毫升表皮生长因子，10 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子，1微升/毫升0.2％肝素和5％的培养基中的浓度。热灭活在一个适当大小的组织培养瓶中FCS。 5毫升用于介质的T25，20毫升的T75和T175瓶40毫升。
注 ：FCS将导致细胞牢固地连接到基板和有没有需要对NBA文化的涂层烧瓶。 - 邪教余吕杏茜瓶，然后在37℃培养箱孵化培养，用5％的CO 2为3-4天。这一时期被称为增殖阶段 ，在此期间，国科会的后代基板的重视，为单层细胞增殖。
- 当文化成为90-95％汇合，每个烧瓶介质切换到完整的国科会与5％胎牛血清培养基生长因子没有任何补充。
- 再次，培养瓶在37℃培养箱孵化培养，用5％的CO 2，另一3-4天。这一时期被称为分化阶段 ，其间的神经祖细胞星形细胞单层上出现和增殖，使未成熟的神经细胞的殖民地。分化阶段4-5天，文化是分离的神经母细胞采用流式细胞仪技术准备。
4。流式细胞仪对细胞的制备
trypsinization
- 区分国科会的后代分化阶段4-5天洗一次文化与适量的PBS（2毫升，4毫升的T75的T25和T175瓶8毫升）从文化FCS。
注：FCS的块胰蛋白酶-EDTA的活动。 - 然后，足量预温的0.05％胰蛋白酶-EDTA（2毫升，4毫升的T75的T25和T175瓶8毫升）添加到每个烧瓶覆盖单层细胞培养在1-2分钟37°C间湿润的孵化器。
- 烧瓶中被选中，在显微镜下评估胰蛋白酶-EDTA对文化的影响。烧瓶中，然后用一只手，并举行袭击另一方面坚决驱逐从烧瓶底部的细胞。
- 添加到等量的大豆胰蛋白酶抑制剂瓶解渴胰蛋白酶的活性的。细胞悬液轻轻吸管上下，以确保胰蛋白酶失活，并实现了均匀的单细胞停牌。
注：另外，5％胎牛血清培养基可以用来解渴胰蛋白酶的活性。 - 要删除非游离团块，细胞悬液通过40微米大小的滤网。
- 细胞悬液，然后在5分钟800转（110克）离心，上清液被删除，并在适当的音量一个完整的国科会中小型重新悬浮细胞。
- 调整的最终体积细胞悬液，使细胞密度不超过2-3X10 6 -cells/ml。高密度可能会导致在流式细胞仪机流堵塞。
- 如果您想隔离神经细胞，根据其物理性质，化学性质，只是，现在你可以进行排序为第4部分中描述的流式细胞仪。
- 在排序之前，碘化丙啶（PI，Sigma公司，500微克/毫升的PBS）1微升/毫升细胞悬液，以排除死细胞的浓度增加。
住CEL升免疫标记
要达到的纯度较高的神经细胞，收获单细胞可以从NBA文化的PSA-NCAM的（早期不成熟的神经祖细胞的标志），然后从神经元的人口阳性细胞染色可以使用流式细胞仪机分离。
- 从NBA文化的单细胞悬液进行细胞计数后，分成四组：
- 细胞组，作为调整控制参数和门（0.5-1×10 6细胞）。
- 细胞加PI，作为调整控制参数和门（0.5-10×10 6细胞）。从本组PI阴性细胞也可以排序基于物理特性的细胞。
- 中学单（同型对照组），也为调整控制参数和门（1-2×10 6细胞）。
- 免疫标记组（8-10×10 6个细胞），是为PSA-NCAM的染色来实现未成熟的神经细胞的进一步净化。排除经分拣，死细胞，PI以及添加到该组。
- 要启动免疫标记，细胞离心5分钟800转（110克）。除去上清100μL完整的国科会中小型重新悬浮细胞。
- 藻红蛋白（PE）标记的抗PSA-NCAM的抗体添加比例的10微升/ 5-10×10 6细胞被染色的PSA-NCAM的细胞悬液。以同样的方式，被添加到一个PE标记的小鼠IgG1的同型对照抗体的同型对照细胞悬液。按照指示要使用的抗体浓度抗体规范表。细胞悬浮液，然后轻轻混匀，室温孵育10-15分钟，在黑暗。
- 细胞悬液（PSA-NCAM和同型对照管），然后在5分钟800转（110克），离心，上清液被删除，细胞重新-suspended在1毫升完整的国科会介质。
- 从样本中删除多余的联合国有限的抗体，第4步重复2-3次。
- 经过重新悬浮细胞，在适当的介质体积碘化丙啶（PI，Sigma公司，在PBS的500微克/毫升），加入1微升/毫升细胞悬液（细胞加PI，同型控制和浓度的PSA NCAM的染色样品），以排除死细胞，流式细胞仪分析。
- 15毫升无菌猎鹰管完全培养基中含有1毫升准备收集排序从不同的细胞群的细胞。
5。荧光激活细胞分类（FACS）对未成熟神经元
- 流式细胞仪机设置基于其用户手册通过流式细胞仪设备专业技术人员的指令。
- 磷酸盐缓冲液（PBS）或任何其他适当的解决方案dependin制造商的指示克，可以作为鞘液在28 PSI通过90微米的喷嘴。
- 调整系统上的压力差，这样的排序触发率不超过2500次/秒。
- 从单细胞的细胞悬液组运行通过流式细胞机。
- 首先，细胞（事件）策划，根据他们的大小（前向散射光（FSC）的）与内部的复杂性（侧散射（SSC）光）来区分不同的细胞群。这样做，FSC和SSC电压参数应进行调整，使细胞可以在流式细胞仪的阴谋。
- 为了排除细胞团块和双峰，细胞首先绘制基于前向散射面积（FSC - A）与前向散射脉冲宽度（FSC瓦）和单细胞人口人口1（P1）的门。然后绘制的P1细胞的基础上侧散射（SSC - A）区与侧散射脉冲宽度（FSC瓦），这个时间的单细胞GAT人口2（P2）。在建立连续这两个闸门，团块或双峰（高FSC脉冲宽度和高SSC脉冲宽度）被排除在外。
- 排除死亡或受损的细胞，单细胞（P2）的绘制基于PI与FSC标准和单个活细胞的数量是门的反应。
- 基于FSC与SSC的绘制单个活细胞来区分不同的细胞群体，根据细胞的大小和内部粒度。在这个阶段，两个主要的细胞群的门FSC 低南南合作低 （P3）和FSC 高南南合作高 （P4）的细胞群。
- PSA-NCAM免疫反应未成熟的神经细胞来自FSC的低 SSC 低人口，首先是FSC的低 SSC从控制人口低 （加PI和同型对照细胞）排序绘制基于体育阳性的与金管会的一个负细胞门（小五），然后从PSA-NCAM的阳性细胞染色组是作为人口6（六）门。
- 细胞的利益调整所有需要的大门后，整理成15毫升无菌组织培养含1毫升国科会介质管。
- 排序的细胞，然后离心5分钟1200转（240克）。
- 被丢弃上清和沉淀重新悬浮在适当体积中等（颗粒大小而定）和细胞计数执行。
- 细胞，然后镀在聚-L-鸟氨酸涂层的96孔板/ 200-250μl完整的国科会介质的密度在20-30×10 3细胞，用5％FCS和20 ng / ml的重组人BMP4的5 。
注：大衣96孔，100μL聚-L-鸟氨酸的工作解决方案（1.5毫升聚-O和8.5毫升无菌PBS），每孔加入板至少在37℃培养箱培养小时。然后，聚邻删除，每口井洗3次，用无菌PBS（让我们留在PBS以及在每个时间为10分钟）。使用聚-L-鸟氨酸的工作方案/如果使用24孔板500μL。
- 固定细胞，然后在不同时间点后排序，用冷的4％多聚甲醛和适当的神经元和神经胶质细胞标志物免疫组化染色评估排序从不同的细胞群的细胞表型。
6。代表结果
在神经母细胞检测（NBA）的分化培养，重视组织文化基板镀细胞成长为单层。根据初始细胞接种密度，文化将打开到90-95％汇合文化后3-4天。在这个阶段，主要是星形细胞单层可以是与小圆4,5顶部的神经祖细胞（ 图1）可视化下。切换中一种生长因子的培养基后，神经祖细胞开始除以迅速，并在4-5天的星形细胞单层（ 图2）上的未成熟神经母细胞产生的集群。流游离NBA文化的流式细胞仪分析分化阶段4-5天，显示了两个主要的细胞群; FSC 低南南合作低和FSC 高南南合作高根据细胞大小（FSC）和内部粒度（SSC）（ 图3）。排序细胞的免疫荧光分析表明，在FSC的低 SSC（超过75％，其中表达β-Ⅲ微管蛋白） 低人口主要位于神经细胞，而细胞排序从FSC 高 SSC 高人口大多阳性星形胶质细胞GFAP（ 图4）。未成熟的神经细胞的进一步净化了附近同质性（97％）可以实现的PSA-NCAM的红外细胞正选择从FSC 低 SSC 低人口（ 图3，4）。从E14小鼠神经节隆起分离出神经干细胞生成的丰富的神经细胞获得1 GABA能表型分化和后快递的DARPP-32，中棘神经元的标志，（ 图5）。
图1。神经母细胞从E14小鼠神经干细胞增殖期4天的检测文化。此单层培养由平坦的星形细胞（箭头）下一轮的神经祖细胞的顶端（箭头）。原放大倍率20倍。
）相衬，B）的免疫荧光染色： 图2神经母细胞从E14小鼠神经干细胞分化阶段4天的检测文化。 在 A注意未成熟的神经细胞（集群箭头在 B微管蛋白染色星形细胞单层的顶端（箭头，GFAP在B染色））。原放大倍率20倍。
图3代表排序图：A） FSC与SSC的排序前的双峰和死细胞的排斥情节，B，C）。排序地块双峰排除基于FSC和SSC脉冲宽度，D）。基于碘化丙啶免疫排斥死亡，受损细胞E）。 FSC与SSC的双峰和死亡的细胞排斥的阴谋后，显示标记作为FSC 低 SSC 低 ，FSC 高南南合作高人口的两个主要群体，F，G）的 。排序地块隔离从FSC 低 SSC 低人口的PSA-NCAM的红外未成熟细胞。
图4。代表从细胞显微照片从不同的人群排序电镀后的一天。）FSC的低 SSC的低人口（超过75％，这些细胞是神经元）。 二 ）FSC的高 SSC的高人口（大多数这些细胞是星形胶质细胞）C）的PSA-NCAM的排序从FSC 低 SSC的低人口（几乎所有的排序细胞是神经元）的细胞。原来放大20倍。
图5。排序未成熟的神经细胞分化为GABA能神经元（A）和明示的DARPP-32（B）中等棘神经元的标志。
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Discussion
隔离定义的神经细胞群（即神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞）的能力可能会解决一些与临床应用神经干细胞（NSCs）的相关障碍。首先，它使我们的供体细胞的人口开始充分体现。第二，它可以让我们使用一个特定的细胞类型或不同类型的细胞组合，与特定的比例，根据疾病的性质或阶段。最后，使用高浓缩铀的预分化的神经细胞的祖细胞，可以显着降低可能不受控制地增殖和肿瘤的形成与使用异构神经前体细胞含有真正的国科会6。一般会导致5-10％的神经细胞和80％以上的星形胶质细胞对神经干细胞分化。使用NBA的方法分化，神经细胞的比例将上升到20-30％，但仍然有大量的星形胶质细胞和其他干和Progenitor细胞在文化，这可能不是理想的，如果打算研究在体外纯神经细胞或神经系统疾病的动物模型研究其治疗效果。在这个协议中，我们采取了区分国科会后代的物理和荧光性质的内在差异优势，净化未成熟的神经细胞。流式细胞仪净化方法增加的比例从20-30％到75-97％的神经细胞没有检测星形胶质细胞和未分化的真正的神经干细胞和祖细胞。
这种方法应用到人类神经干细胞可能有利于神经细胞在神经系统疾病的替代疗法。这种方法也可能是有用的， 在体外研究中，需要高度纯化的神经祖细胞，如药物筛选，神经毒理学，发育研究和电。
为了能够一贯GEnerate高品质E14小鼠神经节隆起产生的神经干细胞的未成熟神经元，我们建议：
- 不要让球长得过大。大神经球，与更多的细胞死亡和神经能力少。
- 不超过2-3分钟trypsinize领域。留下超过3分钟的胰蛋白酶对细胞造成损害，并降低他们的神经效率。
- 不要让增殖单层变得过度融合。这可能会干扰他们的正常分化过程。总是，切换媒介文化时达到约90％汇合。
- 为了让文化在排序前一天的介质变化。这个条件培养基可以收集一天的排序和用于电镀细胞。此媒介包含了很多身份不明的可溶性因子的星形细胞，这将有助于排序的未成熟神经细胞的生存，并获得一个更加成熟的表现型。
- 由于这件T弊端陈征宇，传递细胞悬液，流式细胞仪机虽然可以与一些风险，包括可能破坏细胞，并导致细胞死亡后，排序和真菌或细菌污染的剪切力相关。为了避免剪切力造成的损害，我们建议在适当的速度排序的细胞，使用权的鞘液（PBS是建议）和大小合适的喷嘴（90-100微米），不要让排序触发率超过2500次/秒。为了避免污染，确保仪器已被清除之前，排序正确使用消毒试剂，并在您的收集介质使用抗生素。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
这项工作是从斯特里特基金会的资金支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Biosciences | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | Dako | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega Corp. | G7121 | |
| *To make HEM, mix 1 x 10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
References
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