Summary
Denna video protokoll visar en ny metod för generering och efterföljande rening av neuronala progenitorceller från en förnybar källa av neurala stamceller (NSC) baserat på deras fysikaliska (storlek och granularitet inre) och fluorescerande egenskaper med användning av tekniken flödescytometri.
Abstract
Neurala stamceller (NSC) kan isoleras och expanderas i stor skala, med användning av neurosfären analysen och differentieras till de tre huvudsakliga celltyperna i det centrala nervsystemet (CNS); nämligen, astrocyter, oligodendrocyter och neuroner. Dessa egenskaper gör neurala stam-och progenitorceller en ovärderlig förnybar celler för in vitro-studier som drog screening, neurotoxikologi och elektrofysiologi och också för cell substitutionsterapi hos många neurologiska sjukdomar. I praktiken har dock heterogenitet NSC avkomma, låg produktion av nervceller och oligodendrocyter och dominans astrocyter efter differentiering begränsa deras kliniska tillämpningar. Här beskriver vi en ny metod för generering och efterföljande rening av omogna nervceller från mus NSC avkommor med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) teknik. Med denna metod kan en höganrikat neuronal stamceller population uppnås witHout någon märkbar astrocyt och bona fide NSC förorening. Förfarandet omfattar en differentiering av NSC avkommor isolerade och expanderat från E14 mus ganglieblockerande höjder med hjälp av neurosfären analysen, följt av isolering och anrikning av omogna nervceller baserat på deras fysiska (storlek och interna komplexitet) och fluorescerande egenskaper med hjälp av teknik flödescytometri. Sammantaget tar det 5-7 dagar att skapa neurosfärer och 6-8 dagar för att skilja NSC avkomma och isolera renat omogna nervceller.
Protocol
1. Grundläggande Konfigurera innan du fortsätter to Cell Culture
- NeuroCult NSC Basal Medium och NeuroCult NSC Prolifereringssvar Supplements blandas vid ett 9:1-förhållande, respektive, för att göra fullständig NSC-medium.
- En 37 ° C vattenbad användes för att värma upp mediet.
- Lämplig mängd värme inaktiverat fetalt kalvserum (FCS) tinas.
- Lämplig mängd av faktor stock tillväxtlösningar inkluderande epidermal tillväxtfaktor (EGF vid 10 | ig / ml), basisk fibroblast-tillväxtfaktor (b-FGF vid 10 | ig / ml) och 0,2% heparin-lösning i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tinas.
- Vävnadsodlingsflaskor (T25, T75 eller & T175) behövs för NSC expansion och differentiering.
- Vävnadsodlingsbehandlade 96 och 24 brunnars plattor och täckglas behövs för plätering sorterade celler.
2. Isolering och Expansion (Passage) av NSC
- Neurala stam-och progenitorceller isoleras och expanderas från mus bregn som beskrivs i separata protokoll 1, 2 3.
- När neurosfärer (antingen primära eller passeras neurosfärer) är redo för subkultivering (150-200 pm i diameter), är mediet som innehåller sfärerna överfördes till en lämplig storlek steril vävnadsodling röret, och centrifugerades vid 800 rpm (110 g) under 5 minuter vid rumstemperatur.
- Supernatanten avlägsnas mediet och sfärerna återsuspenderas i 1 ml av förvärmd 0,05% trypsin-EDTA.
- Efter inkubation i en 37 ° C vattenbad under 2-3 minuter, en lika stor volym av sojaböntrypsin-inhibitor tillsattes till cellsuspensionen för att stoppa trypsinaktiviteten.
- För att säkerställa att trypsin helt har inaktiverats, är cellsuspensionen försiktigt pipetterades upp och ned 3-5 gånger.
- Efter centrifugering vid 800 rpm (110 g) under 5 minuter, supernatanten avlägsnades och cellerna återsuspenderas i 1 ml komplett NSC-medium.
- 10 pl av cellsuspensionen blandades med 90 pl av trypan blue för att utföra en celltal.
Obs: Andra lämpliga celler spädningar kan också användas. - Cellerna används därefter för subkultur 1, 2 eller differentiering såsom beskrivs nedan.
3. Differentiering av neurala stam-och stamfaderceller, The Neuroblast Assay (NBA)
- Celler som härrör från dissocierade neurosfärerna pläterades vid en koncentration av 2-3 x 10 5 celler per ml i komplett NSC-medium kompletterat med 20 ng / ml EGF, 10 ng / ml bFGF, 1 pl / ml av 0,2% heparin och 5% värmeinaktiverat FCS i en lämplig storlek vävnadsodlingskolv. 5 ml medium används för T25, 20 ml för T75 och 40 ml för T175-kolvar.
Notera: FCS kommer att orsaka att cellerna för att stadigt fästa till substratet och det finns inget behov för beläggning av flaskor för NBA kultur. - Culture-kolvar inkuberas sedan i ett 37 ° C fuktad inkubator med 5% CO2 under 3-4 dagar. Denna period kallas spridning, under vilket NSC avkomma fäster vid substratet och tillväxa som ett monoskikt av celler.
- När kulturen blir 90-95% sammanflytande, mediet i varje kolv sätts till den fullständiga NSC-medium kompletterat med 5% FCS utan tillväxtfaktorer.
- Odlingsflaskor åter inkuberades i en 37 ° C fuktad inkubator med 5% CO2 under ytterligare 3-4 dagar. Denna period kallas differentiering, under vilket neuronala stamceller visas ovanpå ett astrocytisk monoskiktet och föröka göra kolonier av omogna nervceller. På dag 4-5 av differentiering stadium är kulturen färdig för isolering av de neuroblast celler med användning av tekniken flödescytometri.
4. Cellberedning för flödescytometri
Trypsinisation
- Kulturen av differentiering NSC avkomma på dag 4-5 av differentiering steg tvättas en gång med en lämplig mängd PBS (2 ml för T25, 4 ml för T75 och 8 ml för T175-kolv) för att avlägsna FCS från kulturen.
Obs: FCS blockerar Trypsin-EDTA aktivitet. - Sedan sätts en tillräcklig mängd av förvärmd 0,05% trypsin-EDTA (2 ml för T25, 4 ml för T75 och 8 ml för T175-kolv) sattes till varje kolv för att täcka cellmonoskiktet och inkuberades under 1-2 min i en 37 ° C fuktad inkubator.
- Kolven kontrolleras under mikroskop för att utvärdera effekten av trypsin-EDTA på kulturen. Kolven hölls sedan med en hand och slog fast med den andra handen för att lösgöra cellerna från botten av kolven.
- Lika stor volym av sojaböntrypsin-inhibitor tillsätts till kolven för att släcka trypsinet aktivitet. Cellsuspensionen försiktigt pipetteras upp och ned för att säkerställa trypsin inaktivering och för att uppnå en homogen enda cellsuspension.
Anmärkning: Alternativt skulle medium kompletterat med 5% FCS användas för att släcka trypsinet aktivitet. - Att avlägsna icke-dissocierade klumpar är cellsuspensionen passera genom en 40-im-storlek filternät.
- Cellsuspensionen centrifugeras sedan vid 800 rpm (110g) i 5 min, supernatanten avlägsnades och cellerna återsuspenderas i en lämplig volym av komplett NSC-medium.
- Den slutliga volymen av cell-suspensionen justeras så att celltätheten inte överstiger 2-3x10 6 -cells/ml. Hög celltäthet kan orsaka ström stopp i flödescytometri maskinen.
- Om du vill isolera neuronala celler precis utifrån deras fysiska egenskaper, nu kan du gå vidare till FACS sortering som beskrivs i del 4.
- Före sortering, är propidiumjodid (PI, Sigma, 500 | ig / ml i PBS) tillsattes vid en koncentration av 1 | il / ml av cellsuspension för att utesluta döda celler.
Live CELl immunomärkning
För att uppnå en högre renhet av neuronala celler, skördades enda cell från NBA kulturen kan färgas för PSA-NCAM (en markör för tidig omogna neuronala progenitorceller) och sedan de positiva celler från den neuronala populationen kan isoleras med användning av FACS-maskinen.
- Efter att ha utfört ett celltal är enkelcellsuspension från NBA kulturen delas in i fyra grupper:
- Celler enbart grupp, fungerar som en kontroll för att justera parametrar och grindar (0,5-1 x 10 6 celler).
- Celler plus PI fungerar som en kontroll för att justera parametrar och grindar (0,5-10 x 10 6 celler). PI negativa celler från denna grupp kan även sorteras baserat på cellernas fysiska egenskaper.
- Sekundär enbart (isotypkontroll) grupp som också fungerar som en kontroll för att justera parametrar och grindar (1-2 x 10 6 celler).
- Immunomärkning grupp (8-10 x 10 6 celler) som är färgad för PSA-NCAM för att uppnåytterligare rening av de omogna neuronala celler. För att utesluta döda celler vid sortering, är PI till denna grupp.
- För att starta immunomärkning, cellerna centrifugerades vid 800 rpm (110 g) under 5 minuter. Supernatanten avlägsnas och cellerna återsuspenderas i 100 | il total NSC-medium.
- Fykoerytrin (PE)-konjugerad anti-PSA-NCAM-antikropp tillsätts i ett förhållande av 10 pl / 5-10 x 10 6 celler till cellsuspensionen som skall färgas för PSA-NCAM. På samma sätt är en PE-konjugerad mus lgG1 isotypkontroll-antikropp tillsattes till isotypkontroll cellsuspensionen. Följ instruktionerna på antikroppen specifikationsblad om koncentrationen av antikroppar som ska användas. Cellsuspensionen blandas sedan försiktigt och inkuberades vid rumstemperatur under 10-15 min i mörker.
- Cellsuspensionerna (PSA-NCAM och isotyp rören kontroll) och därefter centrifugeras vid 800 varv per minut (110 g) under 5 minuter, supernatanten avlägsnades och cellerna är åter hjulupphnded i 1 ml komplett NSC-medium.
- Att avlägsna överskott av icke-avgränsas antikroppar från proverna, utförs steg 4 upprepades 2-3 gånger.
- Efter åter-suspendering av celler i en lämplig volym av medium, propidiumjodid (PI, Sigma, 500 | ig / ml i PBS) tillsätts vid en koncentration av 1 | il / ml av cellsuspensionerna (celler plus PI, isotyp-kontroll och PSA- NCAM-färgade prover) för att utesluta döda celler när de analyserades med flödescytometri.
- 15 ml sterilt Falcon-rör innehållande 1 ml av komplett medium framställes för att samla sorterade celler från olika cellpopulationer.
5. Fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) av omogna neuroner
- FACS Maskinen är inställd baseras på dess bruksanvisning instruktion via flödescytometri anläggningen sakkunnig tekniker.
- Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller andra lämpliga lösningar depending på tillverkarens instruktioner, kan användas som hölje fluiden vid 28 psi genom ett 90 | im munstycke.
- Differenstryck på systemet justeras så att den sortens avtryckaren inte överskrider 2500 evenemang per sekund.
- Cellsuspensionen från cellerna ensamma grupp köres genom FACS-maskinen.
- Först cellerna (händelser) plottas baserat på deras storlek (Forward Scatter (FSC) ljus) jämfört med intern komplexitet (Side Scatter (SSC) ljus) för att skilja olika cellpopulationer. För att göra detta bör spänningen parametrar för FSC-och SSC justeras så att cellerna kan ses i flödescytometri kurva.
- För att utesluta cellklumpar och dubbletter, de cellerna först ritas som baseras på den spridning område (FSC-A) jämfört med Forward Scatter pulsbredd (FSC-W) och en enda cell befolkningen är gated som befolkningen 1 (P1). Därefter P1-celler plottad baserat på sidospridning område (SSC-A) kontra sidoriktad spridning pulsbredd (FSC-W) och denna gång de enskilda cellerna är GATED som befolkningen 2 (P2). Efter att ha fastställt dessa två på varandra följande grindar, klumpar eller dubbletter (högt FSC pulsbredd och hög SSC pulsbredd) är uteslutna.
- Att utesluta döda eller skadade celler, de enskilda cellerna (P2) plottas baserat på PI reaktivitet jämfört med FSC-A och den enda levande cell befolkningen är gated.
- Enstaka levande celler ritas baserade på FSC kontra SSC att skilja olika cellpopulationer baserade på cellstorlek och interna precision. I detta skede två huvudsakliga cellpopulationer grindas som FSC låg SSC låg (P3) och FSC hög SSC hög (P4) cellpopulationer.
- Om du vill sortera PSA-NCAM immunoreaktiva omogna nervceller från FSC låga SSC låg befolkningstäthet, först FSC låga SSC låg befolkningstäthet från kontroll (celler samt PI-och isotyp kontroll) grupper plottas baseras på PE immunreaktivitet kontra FSC-A och den negativa celler är grindade (P5), och sedan positiva celler från PSA-NCAMbetsad gruppen är grindas som befolkningen 6 (P6).
- Efter justering alla nödvändiga portar, celler av intresse sorteras i 15 ml sterila rör vävnadsodling innehåller 1 ml NSC medium.
- Sorterade celler centrifugeras sedan vid 1200 rpm (240 g) under 5 minuter.
- Supernatanten kastas och pelleten återsuspenderas i en lämplig volym av medium (beroende på storleken för kulan) och en cellräkning genomfördes.
- Cellerna stryks sedan ut i Poly-L-ornitin-belagda 96-brunnsplattor med en densitet av 20-30 x 10 3 celler / brunn i 200-250 pl komplett NSC-medium med 5% FCS och 20 ng / ml humant rekombinant BMP4 5 .
Anmärkning: för att belägga 96 brunnar, 100 | il av poly-L-ornitin arbetslösning (1,5 ml Poly-O och 8,5 ml steril PBS) tillsätts till varje brunn och plattan inkuberas i en 37 ° C inkubator under minst en timme. Därefter Poly-O avlägsnades och varje brunn tvättades tre gånger med steril PBS(Låt PBS kvar i brunnen under 10 minuter varje gång). Använda 500 | il av Poly-L-ornitin arbetslösning / brunn om 24-brunnars plattor används.
- Cellerna fixeras därefter vid olika tidpunkter efter sortering med användning av kall 4% paraformaldehyd och immunfargades med avseende på lämpliga neuronala och glia-cell-markörer för att bedöma fenotypen av sorterade celler från olika cellpopulationer.
6. Representativa resultat
I neuroblast analys (NBA) differentiering kultur, strukna cellerna fäster till den vävnadsodling substratet och växa som ett monoskikt. Beroende på initial cell plätering densitet, kommer odlingen att förvandlas till en 90-95% sammanflytande kultur efter 3-4 dagar. I detta skede kan ett monoskikt av främst astrocytiska celler vara visualiserade under med små runda neuronala stamceller ovanpå 4,5 (figur 1). Efter omkoppling mediet till en tillväxtfaktor medium, neuronala progenitorceller startadelar sig snabbt och genererar kluster av omogna neuroblast celler på toppen av astrocytisk monoskikt i 4-5 dagar (figur 2). Flödescytometrianalys av dissocierad NBA kulturen på dag 4-5 av differentiering steg, visar två cellpopulationer, FSC låg SSC låg-och FSC höga SSC högt baserat på cellstorlek (FSC) och intern kornighet (SSC) (Figur 3). Immuno-fluorescerande analys av de sorterade cellerna visar att de neuronala cellerna främst finns i FSC låga SSC låga populationer (med mer än 75% av dem som uttrycker β-III tubulin), medan sorterade celler från FSC höga SSC stor befolkning är mestadels GFAP immunoreaktiva astrocyter (Figur 4). Ytterligare rening av omogna nervceller upp till nära homogenitet (97%) kan uppnås med positiv selektion av PSA-NCAM IR cellerna från FSC låga SSC låg befolkningstäthet (Figur3, 4). Berikade neuronala celler som genereras från de NSCs isolerade från E14 mus ganglieblockerande eminens få en GABAergic fenotyp och uttrycker DARPP-32, en markör för medelstora neuroner, på differentiering (Figur 5).
Figur 1. Neuroblast analysen kultur från E14 mus neurala stamceller på dag 4 av proliferation scenen. Detta monoskiktodling består av platta astrocytiska celler (pilspetsar) under och runda neuronala progenitorceller (pilar) på toppen. Ursprunglig förstoring; 20 x.
. Figur 2 Neuroblast analysen kultur från E14 mus neurala stamceller på dag 4 av differentiering steg: A) faskontrast, B) immunfluorescensfärgning. Notera klustret av omogna neuronala celler (pilar i A B) på toppen av astrocytisk monolagret (pilspetsar i A, GFAP färgning i B). Ursprunglig förstoring; 20 x.
. Figur 3 Representativa sortera tomter: A). FSC mot SSC sorts plot innan uteslutning av dubbletter och döda celler. B, C). Sortera tomter för uteslutning av dubbletter baserade på FSC och SSC pulsbredd. D). Uteslutning av döda och skadade celler baserat på propidiumjodid immunreaktivitet.) E. FSC mot SSC plot efter uteslutande av dubbletter och döda celler, visar de två viktigaste populationerna märkta som FSC låga SSC låg och FSC höga SSC höga populationer. F, G). Sortera tomter för att isolera PSA-NCAM IR omogna celler från FSC låga SSC låg befolkningstäthet.
Figur 4. Representativa mikrofoton från celler sorteras från olika populationer en dag efter plätering. A) FSC lågt SSC låg befolkningstäthet (mer än 75% av dessa celler är neuroner). B) FSC hög SSC stor befolkning (majoriteten av dessa celler är astrocyter ). C) PSA-NCAM + sorterade celler från FSC låg SSC låg befolkningstäthet (nästan alla av de sorterade cellerna är neuroner). Ursprunglig förstoring; 20 x.
Figur 5. Sortera omogna nervceller differentiera till GABAergic neuroner (A) och uttrycker DARPP-32 (B), en markör för medelstora neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att isolera definierade neurala cellpopulationer (dvs neuroner, astrocyter och oligodendrocyter) kan lösa vissa av de hinder som är förknippade med den kliniska tillämpningen av neurala stamceller (NSC). För det första kan det för oss att fullständigt karaktärisera utgångspopulation av givarceller. För det andra möjliggör för oss att använda en speciell celltyp eller en kombination av olika celltyper med ett specifikt förhållande, beroende på naturen eller stadium av sjukdomen. Slutligen kan med hjälp av mycket berikade pre-differentierade neurala celler stamceller dramatiskt minska möjliga okontrollerad spridning och tumörbildning i samband med att använda heterogena neurala prekursorer som innehåller äkta NSC 6. Generellt differentiering av neurala stamceller kommer att resultera i 5-10% neuronala celler och mer än 80 astrocyter procent. Använda NBA metoden för differentiering, kommer andelen av neuronala celler öka upp till 20-30%, men fortfarande finns det massor av astrocyter och andra stamceller och progenitor celler i kultur, vilket inte kan vara önskvärt om man skulle har för avsikt att studera rena nervceller in vitro eller för att studera deras terapeutiska effekt i djurmodeller av neurologiska sjukdomar. I detta protokoll, tog vi fördel av inneboende skillnader i fysiska och fluorescerande egenskaper differentiering NSC avkomma för att rena omogna nervceller 5. Vår flödescytometri reningen metodik ökar andelen neuronala celler från 20-30% till 75-97% utan detekterbara astrocyter och icke-differentierade bona fide neurala stamceller och progenitorceller.
Tillämpning av denna metod för att mänskliga NSCs kan dra neuronal terapi cell ersättning i neurologisk sjukdom. Detta tillvägagångssätt kan också vara användbart för in vitro-studier som behöver mycket rent neuronala stamceller som drog screening, neurotoxikologi, utvecklingsstudier och elektrofysiologi.
För att kunna genomgående GEnerate hög kvalitet omogna nervceller från NSC genereras från E14 mus ganglieblockerande höjder rekommenderar vi:
- Att inte låta områdena växa för stort. Stora neurosfärer är förknippade med mer celldöd och mindre neurogena förmågor.
- Inte Trypsinisera områdena i mer än 2-3 minuter. Leaving trypsin i mer än 3 minuter skadar cellerna och minskar deras neurogen effektivitet.
- Att inte låta prolifererande monolagret blir över-sammanflytande. Detta kan interferera med deras normala differentieringsprocessen. Alltid, växla mediet när kulturen når omkring 90% sammanflytning.
- För att ge kulturen ett medium förändring på dagen innan typ. Detta medium kan uppsamlas på dagen för slag och som används för utstrykning av celler. Detta medium innehåller en hel del oidentifierade lösliga faktorer från de astrocytiska celler som hjälper de sorterade omogna nervceller att överleva och få en mer mogen fenotyp.
- Som nackdelar med detta tEKNIK, passerar cellsuspension om flödescytometri maskin kunde vara förenad med vissa risker, bland annat klippning kraft som kan skada cellerna och orsaka celldöd vid typ och även svamp-eller bakterieangrepp. För att undvika skador genom klippning våld, rekommenderar vi att sortera cellen i en lämplig hastighet, och använder just skärmvätskan (PBS rekommenderas) och höger munstycken storlek (90-100 m) att inte låta den sortens avtryckaren takt än 2500 evenemang per sekund. För att undvika kontaminering, se till att instrumentet har rengjorts på rätt sätt med desinficerande reagenser före sortera och även använda antibiotika i din insamling medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes genom finansiering från Overstreet Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Biosciences | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | GIBCO, by Life Technologies | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | Dako | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega Corp. | G7121 | |
| *To make HEM, mix 1 x 10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
References
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
