1. Tillväxt av parasiter Växa trypomastigote former av T. cruzi Berenike och β-galaktosidas-expression Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 i murin muskel-cell (L6) odlas i Dulbeccos minimalt essentiellt medium med 10% FSB, 100 lU / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin och 250 nM L-glutamin (pH 7,2), 5% CO2 vid 37 ° C. Frisimmandet trypomastigotes i supernatanten mediet användes för att inokulera hönsägg. Växa Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 lager odlades i DMEM med 20% FBS. Lb promastigote form i den exponentiella tillväxtfasen för att inokulera ägg 9. 2. Parasit Inokulering i befruktade hönsägg Inokulera en suspension av 100 T. cruzi trypomastigotes i 10 | il av odlingsmediet genom en 2 mm diameter hål i äggskalet på toppen av luftkammaren från stegX fertila ägg. Invasionen och replikation av de virulenta parasiter i embryot celler visas i bild S1. Kontrollgrupperna är som följer: a) kontroll kycklingar, b) mock kontroll ägg får 10 pl odlingsmedium, c) Stage X befruktade ägg inokulerade med en suspension av 100 lb promastigoter i 10 pl odlingsmedium T.. cruzi och Lb tillhör kinetoplastidsjukdomar familjen. Respektive dessa protozoer växer fritt i cytoplasman eller i parasitophorous vacuole av värdceller 10. Täta hål med tejp. Inkubera T. cruzi-infekterade ägg och mock och oinfekterade kontrollprover vid 37,5 ° C och 65% fuktighet under 21 dagar. Håll kycklingar som kläcks i inkubatorn i 24 h och därefter vid 32 ° C i tre veckor. 3. Att få ett prov för DNA-extraktion Perifera mononukleära celler erhölls från kycklingar: en)kläckts från T. cruzi inokulerade äggen, b) kontroller, c) hånar får 10 pl odlingsmedium, d) kläckt ur Lb inokulerade ägg, vita blodkroppar från kycklingar behandlas för DNA-extraktion enligt med ett standardprotokoll 11. Extrahera DNA också från sperma som samlats från tuppar och från ofruktbar oocyter (<5 mm) som insamlats från höns kläckta ur ägg inokulerade med T. cruzi, och från hönor kläckts från kontroll ägg 3, 4. Extrahera kDNA från T. cruzi epimastigote bildar och, dessutom, från Lb promastigoter, såsom beskrivits på annat håll 9. 4. Primers och prober Primrarna som användes för PCR-amplifieringar och de termiska förhållanden visas i tabell 1. De prober som används i Southern blot-hybridiseringar var: Vildtyp minicircle (~ 1,4 kb) sekvenser purierad från T. cruzi epimastigote former; Minicircle fragment (362 bp) erhölls genom Nsi I-kluvna fragment av vildtyp kDNA; Nukleärt DNA (nDNA) upprepad sekvens (188 bp) erhölls genom amplifiering av parasit-DNA med Tcz1 / 2-primrar. Sonderna renades från 1% agarosgeler 3. Vildtyp minicircle (~ 0,820 kb) sekvenser från LB promastigoter. 5. PCR Analyser Kör standard PCR förfarande med genomiska DNA från infekterade kycklingar och oinfekterade kontroller och hånar med T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 och kDNA s35/s36 13 primrar. Dessutom kör PCR med genomiska DNA från kycklingar som kläckts ur Lb infekterade-ägg med protozoiska specifika LB3 och Lb5 primers (tabell 1). Göra reaktionsblandningen med 100 ng mall-DNA, 0,4 ^ M av varje par av primrar, 2 E Taq DNA-polymeras, 0,2 mM dNTP, och 1,5 mM MgCb <sub> 2 i en 25 | il slutlig volym. Inställd termocykler för 95 ° C under 5 min, 30 cykler av 30 sek vid 95 ° C/30 sek vid 68 ° C / 1 min vid 72 ° C med 5 min slutlig extension vid kylning. Analysera amplifieringsprodukter i 1,3% agarosgel, vilken överförs till en positivt laddat nylonmembran (GE Life Sciences) med den alkaliska metoden för hybridisering med specifika prober märkta med [α-32 P] dATP med användning av Random Kit Primer Labeling (Invitrogen , Carlsbad, CA). 6. Genomiska Southern Blöts Använda Mbol och / eller med Eco RI (Invitrogen) enzymer som gör enkel-snitt i minicircles integrerade i DNA-prover av kroppens vävnader. Digest DNA från infekterade kontroll kycklingar och från kycklingar kläckts från ägg som ympats med virulent T. cruzi bildas. Utsätta digereringar av DNA från T. cruzi ochfrån kyckling testprover för elektrofores i 0,8% agarosgel vid 50 V över natten vid 4 ° C. Överföra separerade DNA-band till positivt laddade nylonmembran. Hybridisera DNA-banden med radioaktivt märkt kDNA sond. Tvätta membranet två gånger i 15 min vid 65 ° C med 2X SSC och 0,1% SDS, två gånger under 15 min vid 65 ° C var och en med 0,2 X SSC och 0,1% SDS och autoradiograf för variabla tidsperioder. 7. Riktad Prime TAIL-PCR Erhålla amplifiering av kDNA minicircle integreras i kyckling-genomet genom en modifierad Svans-PCR-teknik, som kombinerar kDNA primrar med specifik primer innehåller 2 i tre walk-in cykler innesluten PCR, såsom visas i figur 1. Primära cykeln: Varje reaktion innefattar 200 ng mall-DNA, 2,5 mM MgCl2 och 0,4 | iM av primrama kDNA (S34 eller S67), 0,2 mM dNTP, 2,5 U Taq-Platinum Invitrogen (, Carlsbad, CA). Använda kDNA primers i kombination med 0,04 | iM av Gg primrar (GG1 till Gg6, tabell 1), var för sig. Inställd temperatur från 57,9 till 60,1 ° C under kDNA primrar och från 59,9 till 65,6 ° C under CR-1-primer. Observera att dessa temperaturer är högre än de som (~ 45 ° C) som krävs för de degenererade godtyckliga primers som användes i svansen-PCR 10. Använd temperatur och cykler (MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) som beskrivs i ett tidigare papper 3. Sekundärskolan: Späd PCR-produkter från primär cykel 1:40 (v / v) i vatten. kDNA primers S35 och S35 antisense ersatte tidigare, tillsammans med samma Gg primers. Tertiär cykel: Späd PCR produkter från sekundärskolan 1:10 (v / v) i vatten och kombinera Gg primers med S67 antisense-eller S36, separat. Klona PCR tertiära cykelprodukter: Klon direkt i pGEM T lätt-vektorn (Promega, Madison, WI)produkter i sista förstärkning som hybridisera med kDNA sond. Välja kloner genom hybridisering med kDNA sond och sekvens. Validera tpTAIL-PCR i en blandning av 300 pg av kDNA från T. cruzi med 200 ng DNA från kontrollprover fåglar utsätts aldrig kDNA. De temperatur-och amplifiering cykler är samma som används för test fåglarnas DNA. 8. Chagas sjukdom Clinic Manifestation Övervaka tillväxt och utveckling av kycklingar kläcktes från T. cruzi smittade ägg och friska kontroller kläcktes från icke-infekterade ägg dagligen för dödlighet och vecka för sjukdomar manifestationer. Upptäcka kliniska avvikelser i dessa kycklingar (figur 2) och gör Elektrokardiograf (EKG) inspelningar för att utvärdera de elektriska axlar, priser hjärta och arytmier 3. Ämne kDNA-muterat och kontrollerar kycklingar varje månad för att EKG-inspelningar av augmented ventrikulär unipolar leder aVF (vänster ben), AVL (vänster arm) och AVR (höger arm), och att bedöma avvikelse genomsnittliga elektriska axel till vänster, vilket tyder på hjärtförstoring 3. 9. Patologi och Immunokemisk Analyser Spela hjärta och kropp index vikt efter naturliga död kDNA muterade kycklingar (Figur 3). Skaffa index även för kontroll kycklingar i samma ålder och kön. Ta sektioner från hjärtat, matstrupen, tarmar, skelettmuskulatur, lungor, lever och njurar. Fix vävnad i buffrad 10% formalin (pH 7,4), bädda i paraffin och skärs till 4 m tjocka sektioner för Hematoxylin-Eosin (HE) färgning och histologiska analyser (Figur 3). Harvest och delningsspår vävnader från embryon kläckts från ägg inokulerade med parasiter som uttrycker β-galaktosidas, och om inte X-Gal-fläck. 9 Fixera den andra hälften av embryoceller vävnader i 10% formalin, pH 7,4 och fortsätt som i steg 9,3. Klipp 4 nm tunna paraffininbäddad vävnadssnittet och montera på glasskiva för mikroskopisk undersökning. Inkubera sektioner som visar X-Gal-färgade blåa celler med humant chagasic antiserum (1:1024 utspädning) mot anti-T cruzi-antigen. Tvätta sektioner trice med PBS, pH 7,4, 5 min vardera. Fläck blå celler i embryot vävnader genom andra inkubering med en fluorescein-konjugerad kanin-anti-humant IgG. Tvätta avsnitt med PBS (steg 8), montera med täckglas och observera de blå cellerna ljus-up gröna efter granskning under UV ljus vid 502 nm våglängd, 200x förstoring, för colocalizing T. cruzi i embryoceller. 10. Fenotyp immunsystemceller i hjärtat lesioner Fenotyp immuneffektorer celler i vävnadssnitt av hjärtat från kDNA-positiva och från kontroll kDNA-negativa kycklingar. Placera glasen ivävnadssektion inbäddades i paraffin vid 65 ° C under 30 min för att smälta vaxet föregående att lämnas i fyra tvättar i 100% till 70% xylen och sedan i absolut etanol PBS under 5 min vardera. Skölj glasen i destillerat vatten, lufttorka och behandla med specifika monoklonala antikroppar (fluorescein-eller R-fykoerytrin-konjugerade monoklonala antikroppar) som erhållits från SouthernBiotech, Birmingham, AL. Använd mus-anti-kyckling Bu-1 (Bu-1 a och BU-1-alleler b, Mr 70-75 kDa) Mab AV20 att erkänna monomorf avgörande på B-celler antigenerna av inavlade kycklingar. Använd mus-anti-kyckling CD45, Ig isotyp IgM1 κ specifika kyckling bräss härstamning celler (Herr 190 till 215-kDa variant). Använd mus-anti-kyckling TCRγδ + (Mr 90-kDa heterodimer) Mab som är specifik för bräss beroende CD8a + T-celler. Använd mus-anti-kyckling Mab CD-8 som är specifik för kyckling α-kedja (Mr 34 kDa) erkänner: ee CD8-celler i tymocyter, mjälte, hjärta och andra vävnader. Använd mus-anti-kyckling KuL01 att enbart känna igen monocyter / makrofager i fagocytsystemet. Tvätta sliden tre gånger med 0,1 M PBS, pH 7,4, 5 min vardera efter inkubation med specifika anti-fenotypen antikropp under 90 min i en fuktig kammare. Montera bilden med buffrad glycerol för tentamen under ett lysrör mikroskop med utsläpp filter av våglängd 567 och 502 nm, respektive att upptäcka röda och grön fluorescens-märkta celler (Figur 4). 11. Dataanalyser Använd databasen kycklingen genomet ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) för BLASTN sekvensanalyser. Använd clustalw inriktningar för att bestämma e-värde poäng. Anställa GIRI upprepa maskering algoritmen CENSOR ( http://girinst.org/censor/index.php ) för lokalisering av olika klasser av upprepningar i chimära sekvenser. Anställa kinetoplastidsjukdomar Insättning och borttagning sekvens Sök Tool (KISS) för att identifiera potentiella gRNAs i kDNA sekvenser, med hjälp av WU-blastn-modifierad matris 3. Använda T. cruzi sekvenser http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-~~HEAD=NNS 2164-8-133-s1.fas att söka in gRNAs i kDNA-värd DNA-chimärer. 11,6) Använd Students t och Kolmorov-Smirnov test, respektive, för att upptäcka signifikanta skillnader mellan avvikelser av elektriska axlar och mellan hjärt / kroppsvikt index som erhållits i experiment-och kontrollgrupper, och för att upptäcka dödlighet förhållandet signifikanta skillnader mellan grupper av kläckta kycklingar från T. cruzi inoculated ägg och från kontroller. 12. Representativa resultat Inokulering av 100 virulenta T. cruzi trypomastigotes i luften kammare fertila kycklingägg minskar inte signifikant förhållandet mellan kycklingar, som kläckts vid liv. Cirka 60% kläcks friska kycklingar och 40% kan genomgå embryo kondensering eller embryo död på kläckning. De överlevande kycklingar behålla kDNA minicircle sekvensen integreras i genomet. Det förväntas att en del kycklingar kommer att dö med hjärtförstoring och fel i veckorna efter kläckning. De återstående kycklingarna kommer att växa till utåt friska vuxna. I alla skeden av livet DNA extraherat från sina mononukleära blodceller kommer att ge PCR-amplifiering av kDNA, men inte nDNA. Den riktade-prime TAIL-PCR 3, 4 produkter som klonas och sekvens visar kDNA minicircles främst att integreras i kodande regioner i macrochromosomes 1 till 5. Hönsen visar flera kDNA integrations i gener som kodar för celltillväxt och differentiering, immunsystem faktorer reglering och DNA-reparation är kandidater att genomgå avstötning av själv målvävnader (Figur 3). Till exempel är det kyckling visar kDNA mutation med bristning av dystrofingenen (figur 5), som kodar ett protein som binder till cytoskelettet till cellmembranet, en kandidat för att utveckla autoimmun inflammatorisk kardiomyopati och misslyckande. Dessa genomiska modifieringar inte sett på kycklingar som kläckts från Lb infekterade ägg. Det finns skillnader mellan T. cruzi och Lb kDNA minicircles; Den T. cruzi k DNA minicircle genomsnittet 1,4 kb struktur med fyra variabla region (VR) med mellanliggande bevarade regioner (CR) varje presentera CSB1 och CSB2 och CSB3 regioner, där CA-rika böjda DNA anses specifika platser för initiering av replikering, transkription, rekombination, och för lateral DNA-överföring <supp 3> 4. I motsats innehåller Lb kDNA minicircle (medelstorlek 820 bp) enstaka CR följt av VR. CR har bevarats CSB1 (GGGCGT) och CSB2 (CCCCGTTC) block, som skiljer sig från de i T. cruzi minicircles 15, 16 och 17. Med tanke på att Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) visar 12 nätter homologi till T. cruzi är det tänkbart att antingen Lb kDNA minicircle integrerar på ett mycket låg frekvens, vilket kanske inte är synliga genom de tekniker som används, eller att det kan eventuellt inte integrera i kyckling genomet alls. Primer Mål-DNA Sekvens Tm * S 34 T. cruzi kDNA 5 'ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3' 57,9 S 67 T.cruzi kDNA 5 'GGT TTT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' 60,1 S 35 T. cruzi kDNA 5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' 59,4 S 36 T. cruzi kDNA 5 'GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3' 57,9 LB3 Ib kDNA 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3' 55,9 Lb5 Ib kDNA 5 'CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3' 61,4 Gg 1 Gallus gallus 5 'AGC TGA TCC TAA AGG CAG AGC 3' 60,1 GG2 G. gallus 5 'CTG AGC CTC TGCTTT GAA En 3 ' 56,8 Gg3 G. gallus 5 'TTT Luftfartsverket AGC AGA GGC TCG G 3' 60,1 Gg4 G. gallus 3 'GCT CTG CCT TTA GGA TCA GCT 5' 64,2 Gg5 G. gallus 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' 62,3 Gg6 G. gallus 3 'CTG TTA GCA TGA GGC TTC ACA A 5' 60,4 Tabell 1. Primes användes i PCR-amplifieringar. * Tm = genomsnittlig glödgningstemperatur ° C. Figur 1. TP Svans-PCR-strategi användes för att detektera Trypanosoma cruzi kDNA integrering i Gallus gallus-genomet. A) En chimär sekvens med ett fragment av kDNA minicircle bevarade (mörkblå) och variabla (ljusblå) regioner integreras i locus NW_001471687.1 vid kromosom 4 (AY237306) av kyckling 10 genomet (grön) användes för att erhålla värden specifika primeruppsättningar (GG1 till Gg6). B) De tp Svans-PCR-amplifieringar initieras (primär körning) genom annealing av de minicircle-specifika S34 eller S67-primrar i kombination med de kyckling-specifika GG1 till Gg6 primrar. Utspädda produkter som mall för den sekundära cykeln med S35 (sense / antisense) primers och kombinationer av Gg primers. I den tertiära cykel en utspädning av de sekundära produkterna underkastades amplifiering med kDNA S36 eller S67 antisense-primrar i kombination med Gg primerns. C) Dessa amplifieringsprodukter separerades i 1% agarosgeler och överfördes till nylonmembran, hybridiserades med den specifika sonden kDNA. Prover med positiv signal användes för kloning för att bestämma punkten för integrering. Kombinationerna av kDNA och riktade GG1 att Gg6 visas på toppen av gelén. De sekventiella PCR-reaktioner amplifierade mål-kDNA-värd-DNA-sekvenser med kDNA minicircles (blå) och fågel-sekvensen (grönt). (Utdrag ur PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figur 2. Kliniska manifestationer av nedsatt hjärtfunktion i en 9-månader gammal kyckling genetiskt modifierad genom integrationen av den mitokondriella kDNA minicircle från T. cruzi. Den dåliga blodets syresättning av mitokondriella muterade kDNA kycklingen visar en lila kam kontrasterar med den ljusa röda kammen av kontroll 9-månader gammal chicken fri från skador på hjärtat. (Modifierad från PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figur 3. Gross och mikroskopisk patologi i Gallus gallus med kDNA mutationer. A) Hjärtförstoring i en 9-månader gammal hönan som dog av hjärtsvikt. B) Kontroll hjärtat från en icke-infekterade 9-månader gammal höna. C) Avslag på målceller hjärta av cytotoxiska lymfocyter: En minimal avslag enhet med lyserar i målceller genom immuna lymfocyter avbildas (cirkel). D) Kontroll hjärtat histologi (modifierat från PLoS Neglected Tropical Diseases 3). Figur 4. Immunocytokemiska analyser av immunsystemceller infiltrerande centrala kDNA-muterat kyckling som visas i figur 3. A) CD45 + lymfocyter identifierats (pilar) i hjärtat ledioxid med en fykoerytrin-märkt specifik monoklonal antikropp. B) CD8 ^ γδ immuna lymfocyter (pilar) är involverade i allvarlig destruktion av hjärtat. C) Rikliga CD8a + T-celler som finns i allvarliga skador med lyserar hjärta cell. Skären visar frånvaron av immunsystemceller med kontroll ej infekterade kycklingen hjärtat (modifierad från PLoS försummade tropiska sjukdomar 3). Figur 5. Chagas-liknande dilaterad kardiomyopati inflammatoriska i en F2 avkomma med kDNA integration i dystrofingenen. A) Dilated hjärta i ett 10-månader gammal kyckling som upptar det mesta av brösthålan (hjärta vikt = 16 g). B) Mörka runda mononukleära celler infiltrerar och förstör hjärtmuskulaturen av kDNA-muterade höns. C) Normal hjärtats storlek (vikt 7 g) av en 10-månader gammal styrning kyckling. D) Normal histologi av en kontroll kyckling hjärta. (Modified från PLoS försummade Tropical Sjukdomar 3). Figur 6. Jämförande patologi i kDNA muterade-kyckling och i human Chagas sjukdom. A) Svår myokardit och Target Heart lyserar celler i kDNA-muterade kyckling. B) Svår myokardit och rikta lyserar cellen genom immuna lymfocyter i ett fall av Chagas hjärtsjukdom. C) Avslag på hjärtceller som immuna lymfocyter i kDNA-muterade kyckling. D) Avslag på hjärtceller som immuna lymfocyter i humant Chagas sjukdom. Färgades genom hematoxilin och eosin. (Modifierad från Memórias gör Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 14).