Summary
De inenting van
Abstract
De Trypanosoma cruzi acute infecties die in de kindertijd lijken asymptomatisch, maar ongeveer een derde van de chronisch geïnfecteerd gevallen blijkt de ziekte van Chagas tot drie jaar of later. Auto-immuniteit en parasieten doorzettingsvermogen zijn concurrerende theorieën om de pathogenese van de ziekte van Chagas 1, 2 uit te leggen. Om verschillende rollen gespeeld door parasiet persistentie en auto-immuniteit in de ziekte van Chagas we inoculeren de T. cruzi in de luchtkamer van bevruchte eieren. De volwassen kip immuunsysteem is een strakke biologische barrière tegen T. cruzi en de infectie wordt vernietigd bij ontwikkeling van het immuunsysteem door het einde van de eerste week groei 3. De kuikens zijn parasiet vrij bij het uitkomen, maar ze behouden geïntegreerd parasiet mitochondriaal DNA kinetoplast (kDNA) minicircle in hun genoom worden overgebracht naar hun nageslacht. Documentatie van de kDNA minicircle integratie in de kip genoom werd verkregen door een Targeted prime TAIL-PCR, Southern hybridisaties, klonen, en sequencing 3, 4. De kDNA minicircle integraties scheuren open reading frames voor transcriptie en immuunsysteem factoren, fosfatase (GTPase), adenylaatcyclase en phosphorylases (PKC, NF-kappa B activator, PI-3K) geassocieerd met cel-fysiologie, groei en differentiatie 3, 5 - 7 en genfuncties. Ernstige myocarditis als gevolg van afwijzing van target heart vezels door effectoren cytotoxische lymfocyten is te zien in de kDNA gemuteerde kippen, met een inflammatoire cardiomyopathie vergelijkbaar met dat bij de mens de ziekte van Chagas. Met name hartfalen en spierzwakte aanwezig zijn bij volwassen kippen met kDNA breuk van het dystrofine-gen op chromosoom 1 8. Vergelijkbare genotipic wijzigingen worden geassocieerd met weefselvernietiging uitgevoerd door effectoren CD45 +, CD8γδ +, CD8α lymfocyten. Dus deze protozoaire infectie kan induceren genetisch gestuurde auto-immuunziekte.
Protocol
1. De groei van Parasieten
- Grow trypomastigote vormen van T. cruzi Berenice en β-galactosidase tot expressie Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 in muizen spiercellen (L6) gekweekt in Dulbecco minimaal essentieel medium met 10% FSB, 100 IU / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, en 250 nM L-glutamine (pH 7,2), 5% CO 2 bij 37 ° C. De vrijzwemmende trypomastigotes in het supernatant medium werd gebruikt om eieren te inoculeren.
- Grow Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 voorraad gekweekt in DMEM met 20% FBS. De Lb promastigote vorm in de exponentiële groeifase werd eieren 9 inoculeren.
2. Parasite Inenting in bevruchte kippeneieren
- Inoculeer een schorsing van 100 T. cruzi trypomastigotes in 10 ul kweekmedium door een 2 mm diameter gaten in de eischaal boven de luchtkamer van faseX vruchtbare eieren. De invasie en de replicatie van de virulente parasieten in de cellen van embryo's worden weergegeven in de Video-S1. De controlegroepen zijn: a) controle kippen, b) mock controle eieren die 10 pl kweekmedium c) fase X bevruchte eieren geënt met een suspensie van 100 Lb promastigoten in 10 ul kweekmedium T.. cruzi en Lb behoren tot de kinetoplastid familie. Respectievelijk deze protozoa groeien vrij in het cytoplasma of in parasitophorous vacuole van gastheercellen 10.
- Dicht gaten met plakband.
- Incubeer de T. cruzi-besmette eieren en mock-en niet-geïnfecteerde controle monsters op 37,5 ° C en 65% luchtvochtigheid gedurende 21 dagen.
- Bewaar de kuikens die de incubator gedurende 24 uur uitkomen en vervolgens bij 32 ° C gedurende drie weken.
3. Het verkrijgen van monsters voor DNA-extractie
- Perifere mononucleaire cellen werden verkregen van kippen: a)uitgebroed van T. cruzi geënte eieren; b) de controles, c) bespot ontvangen van 10 pi kweekmedium, d) geboren uit Lb geënte eieren, witte bloedcellen van kippen worden verwerkt voor DNA-extractie volgens een standaard protocol 11.
- Ook halen DNA van sperma van de hanen, en van onvruchtbare eicellen (<5 mm) verzameld van kippen uit eieren is geënt met T. cruzi, en van kippen uitgebroed zijn van de controle eieren 3, 4.
- Uittreksel kDNA van de T. cruzi epimastigote vormt en ook van Lb promastigoten, zoals elders 9 beschreven.
4. Primers en probes gebruikt
De primers voor PCR-amplificaties en de thermische omstandigheden worden getoond in Tabel 1.
De probes die in Southern blot hybridisatie waren:
- Wild-type minicircle (~ 1,4 kb) sequenties purigeschied van T. cruzi epimastigote vormen;
- Minicircle fragmenten (362 bp) verkregen door NSI ik samenvattingen van het wild-type kDNA;
- Nucleair DNA (nDNA) herhalende volgorde (188 bp) verkregen door amplificatie van de parasiet DNA met de Tcz1 / 2 primers. De probes werden gezuiverd uit 1% agarose gels 3.
- Wild-type minicircle (~ 0,820 kb) sequenties van Lb promastigoten.
5. PCR-analyses
- Uitvoeren standaard PCR-procedure met genomische DNA van geïnfecteerde kuikens en niet-geïnfecteerde controle en spotten met behulp van T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 en kDNA S35/S36 13 primers. Ook lopen PCR met genomische DNA's van kippen uitgebroed uit Lb geïnfecteerde-eieren met behulp van de protozoaire specifieke Lb3 en Lb5 primers (tabel 1).
- Merk reactiemengsel met 100 ng template DNA, 0,4 uM van elk paar primers, 2 U Taq DNA polymerase, dNTP 0,2 mM en 1,5 mM MgCl
- Stel thermocycler programma 95 ° C gedurende 5 min, 30 cycli van 30 sec bij 95 ° C/30 sec bij 68 ° C / 1 min bij 72 ° C met 5 min uiteindelijke verlenging voor koeling.
- Analyseren de amplificatieproducten in 1,3% agarose gel, waarvan een positief geladen nylon membraan (GE Life Sciences) door de alkalische methode hybridisatie met probes gelabeld met [α-32P] dATP Random Primer Labeling (Invitrogen , Carlsbad, CA).
6. Genomic Southern blots
- Gebruik Mbo I en / of met Eco RI (Invitrogen) enzymen die een verlaging van minicircles geïntegreerd DNA van lichaamsweefsels maken.
- Digest DNA van niet-geïnfecteerde controle pluimvee en uit pluimvee uit eieren is geënt met virulente T. cruzi vormt.
- Onder voorbehoud van de samenvattingen van het DNA van T. cruzi envan kip monsters aan elektroforese in 0,8% agarose gel bij 50 V overnacht bij 4 ° C.
- Overdracht gescheiden DNA-banden aan positief geladen nylon membraan.
- Hybridiseren van de DNA-banden met radio-gelabelde kDNA probe.
- Tweemaal wassen membraan gedurende 15 min bij 65 ° C met 2X SSC en 0,1% SDS, tweemaal gedurende 15 min bij 65 ° C elk 0,2 x SSC en 0,1% SDS en autoradiogram voor variabele tijd.
7. Gerichte Prime TAIL-PCR
- Verkrijgen amplificatie van de kDNA minicircle geïntegreerd in het genoom kip door een gewijzigde TAIL-PCR, waarbij primers kDNA combineert met specifieke primer bevat twee in drie inloop cycli genest PCR, zoals weergegeven in figuur 1.
- Primaire cyclus: Elke reactiezone bevat 200 ng template DNA, 2,5 mM MgCl2 en 0,4 uM van kDNA primers (S34 of S67), 0,2 mM dNTP, 2,5 U Taq platina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Gebruik kDNA primers in combinatie met 0,04 pM Gg primers (GG1 tot Gg6, tabel 1), afzonderlijk. Stel temperaturen 57,9 tot 60,1 ° C voor kDNA primers en 59,9 tot 65,6 ° C voor CR-1 primer. Merk op dat deze temperaturen zijn hoger dan de (~ 45 ° C) die nodig zijn voor de willekeurige gedegenereerde primers gebruikt in de TAIL-PCR-10. Gebruik temperatuur en cycli (MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) beschreven in een vorige artikel 3.
- Middelbaar: verdunnen PCR uit primaire kringloop 01:40 (v / v) in water. kDNA primers S35 en S35 antisense vervangen het voorgaande, samen met dezelfde Gg primers.
- Tertiaire cyclus: verdunnen PCR producten van middelbaar 01:10 (v / v) in water en Gg primers met S67 antisense of S36 combineren afzonderlijk.
- Kloon de PCR-tertiaire cyclus producten: Clone direct in pGEM T makkelijk vector (Promega, Madison, WI)de producten van de laatste versterking die hybridiseren met kDNA sonde.
- Selecteer klonen door hybridisatie met kDNA sonde en volgorde.
- Valideer de tpTAIL-PCR in een mix van 300 pg van kDNA van T. cruzi met 200 ng DNA uit controlemonsters vogels nooit blootgesteld aan kDNA. De temperatuur en amplificatie cycli dezelfde gebruikt voor de test vogels DNA.
8. Ziekte van Chagas Clinic Manifestatie
- Monitor groei en ontwikkeling van kippen uitgebroed van T. cruzi besmette eieren en van gezonde controlepersonen uitgekomen van niet-geïnfecteerde eieren per dag voor sterfte en wekelijks voor de ziekte van manifestaties.
- Detect klinische afwijkingen in die kippen (figuur 2) en maak elektrocardiogram (ECG) opnames van de elektrische assen, hartslag en ritmestoornissen 3 te evalueren.
- Onderwerp kDNA-gemuteerde en regelt kippen maandelijks aan ECG-opnamen van augmented ventriculaire unipolar leidt aVF (linkerbeen), AVL (linkerarm), en AVR (rechterarm), en om te beoordelen afwijking van de gemiddelde elektrische as aan de linkerkant, dat is suggestief van hart uitbreiding 3.
9. Pathologie en immunochemische analyses
- Record hart en lichaamsgewicht indexen na de natuurlijke dood van kDNA gemuteerde kippen (figuur 3). Ook verkrijgen indexen voor de controle kippen van dezelfde leeftijd en geslacht.
- Neem secties van het hart, slokdarm, darmen, skeletspieren, longen, lever en nieren.
- Fix weefsel gebufferde 10% formaline (pH 7,4), sluit in paraffine en gesneden tot 4 urn dikke secties van hematoxyline-eosine (HE) kleuring en histologische analysen (figuur 3).
- Oogst en deelbaar weefsel van embryo's afkomstig zijn van eieren die geënt is met parasieten uiten β-galactosidase, en onder voorbehoud van X-Gal-vlek. 9
- Bevestig de andere helft van het embryo weefsels in 10% formaline, pH 7,4 en verder als in stap 9.3.
- Snijd dunne 4μm paraffine ingebed weefsel sectie en monteren op glasplaatje voor microscopisch onderzoek.
- Incubate secties geeft X-Gal-gekleurde blauwe cellen met menselijke chagasic antiserum (1:1024 verdunning) tegen anti-T. cruzi antigeen.
- Was secties handomdraai met PBS, pH 7,4, 5 minuten per stuk.
- Vlek blauwe cellen van de embryo weefsels door tweede incubatie met fluoresceïne-geconjugeerd konijnen anti-humaan IgG.
- Was secties met PBS (stap 8), mount met dekglas en let op de blauwe cellen licht-groen op na onderzoek onder UV licht bij 502 nm golflengte, 200x vergroting, voor colocalizing T. cruzi in cellen van embryo's.
10. Fenotype cellen van het immuunsysteem in hartafwijkingen
- Fenotype immune effectoren cellen in weefselcoupes van het hart van kDNA-positieve en van de controle kDNA-negatieve kippen.
- Plaats de dia's metweefselsectie ingebed in paraffine bij 65 ° C gedurende 30 minuten tot was voorafgaande aan indiening in vier maal te wassen smelten 100% tot 70% xyleen en in absolute ethanol PBS gedurende 5 min elk.
- Spoel de dia's in gedestilleerd water, lucht droog, en behandelen met specifieke monoklonale antilichamen (fluoresceïne-of R-phycoerythrin-geconjugeerde monoklonale antilichamen) die u van SouthernBiotech, Birmingham, AL.
- Gebruik de muis anti-kip Bu-1 (Bu-1 een en Bu-1 b-allelen, de heer 70-75 kDa) Mab AV20 naar monomorfe determinant herkennen op de B-cel antigenen van inteelt kippen.
- Gebruik de muis anti-CD45 kip, Ig-isotype IgM1 κ die specifiek zijn voor kippen thymus lineage cellen (de heer 190-215-KDa variant).
- Gebruik de muis anti-kip TCRγδ + (heer 90-kDa heterodimeer) Mab die specifiek zijn voor thymus afhankelijk CD8α + T-cellen.
- Gebruik de muis anti-kip Mab CD-8 die specifiek zijn voor kip α-keten (de heer 34 kDa) e herkennene CD8 cellen thymocyten, milt, en andere weefsels.
- Gebruik de muis anti-kip KuL01 uitsluitend te herkennen monocyten / macrofagen van het fagocytensysteem.
- Was de dia driemaal met 0,1 M PBS, pH 7,4, 5 min elk na incubatie met de specifieke anti-fenotype antilichaam 90 min in een vochtige kamer.
- Monteer de dia met gebufferde glycerine voor het examen onder een TL-licht microscoop met emissie-filter met een golflengte van 567 en 502 nm, respectievelijk rood en groen fluorescentie-gelabelde cellen (figuur 4) op te sporen.
11. Gegevens Analyses
- Gebruik de kip genoom database ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) voor BLASTN sequentie-analyses.
- Gebruik clustalw uitlijningen om e-waarde scores te bepalen.
- Maken gebruik van de GIRI herhaal maskeren algoritme censor ( http://girinst.org/censor/index.php ) voor het lokaliseren van verschillende klassen van herhalingen in chimère sequenties.
- Gebruik van de Kinetoplastid Insertion en verwijdering Sequence Search Tool (KISS) om potentiële gRNAs identificeren in de kDNA sequenties, met behulp van WU-BLASTN-gemodificeerde-matrix 3.
- Gebruik T. cruzi sequenties http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas om te zoeken in gRNAs in de kDNA-gastheer-DNA hersenschimmen. 11,6) Gebruik Student's t en de Kolmorov-Smirnov testen, respectievelijk om significante verschillen tussen de afwijkingen van elektrische assen en tussen hart / lichaamsgewicht indexen verkregen in de experimentele en controlegroepen op te sporen en op te sporen sterfte ratio's significant verschillen tussen de groepen uitgekomen kippen van T. cruzi inoculated eieren en van de controles.
12. Representatieve resultaten
De inenting van 100 virulent T. cruzi trypomastigotes in de luchtkamer van vruchtbare kippeneieren niet vermindert aanzienlijk de ratio's van kuikens in leven. Ongeveer 60% uitkomen gezonde kuikens en 40% kunnen embryo vloeibaar maken of het embryo dood te ondergaan bij het uitkomen. De overlevende kuikens behouden de kDNA minicircle volgorde geïntegreerd in het genoom. Er wordt echter verwacht dat een aantal kuikens zal met cardiomegalie en het niet sterven in de weken na het uitkomen. De resterende kuikens groeien naar buiten gezonde volwassenen. In alle stadia van het leven het DNA uit het bloed mononucleaire cellen zullen opleveren PCR-amplificatie van kDNA, maar niet nDNA. De doelgerichte-prime TAIL-PCR 3, 4 producten die worden gekloond en de volgorde ziet u de kDNA minicircles vooral geïntegreerd in coderende gebieden van macrochromosomes 1 tot 5. De kippen die meerdere kDNA integrations in genen die coderen voor de celgroei en-differentiatie, immuunsysteem regelgeving factoren, en DNA-herstel kandidaat zijn om afstoting van het zelf te onderzoeken weefsels (figuur 3) te ondergaan. Bijvoorbeeld, de kip waarin kDNA mutatie breuk van het dystrofinegen (figuur 5), dat codeert voor een eiwit dat de cytoskelet bindt aan de celmembraan, een kandidaat autoimmuun inflammatoire cardiomyopathie en mislukking ontwikkelen.
Deze genomische veranderingen worden niet gezien in kuikens uitgebroed uit Lb besmette eieren. Er zijn verschillen tussen de T. cruzi en Lb kDNA minicircles; De T. cruzi k DNA minicircle gemiddeld 1,4 kb structuur met vier variabele regio (VR) afgewisseld met geconserveerde gebieden (CR) elk presenteren CSB1, CSB2 en CSB3 regio's, waar CA-rijke gebogen DNA worden beschouwd als specifieke sites voor de aanvang van de replicatie, transcriptie, recombinatie en laterale DNA-transfer
| Grondverf | Doel-DNA | Volgorde | Tm * |
| S 34 | T. cruzi kDNA | 5 'ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3' | 57,9 |
| S 67 | T.cruzi kDNA | 5 'TTT GGT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' | 60,1 |
| S 35 | T. cruzi kDNA | 5 'ATA TAC ATG GGG (T / G) GA GAT GC 3' | 59,4 |
| S 36 | T. cruzi kDNA | 5 'ATT GGT TCG GGG GTT GGT G 3' | 57,9 |
| Lb3 | Lb kDNA | 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3' | 55,9 |
| Lb5 | Lb kDNA | 5 'CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3' | 61,4 |
| Gg 1 | Gallus gallus | 5 'AGC TGA TAA TCC CAG AGG AGC 3' | 60,1 |
| Gg2 | G. gallus | 5 'AGC CTG CTC TGCTTT GAA A 3 ' | 56,8 |
| GG3 | G. gallus | 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3' | 60,1 |
| GG4 | G. gallus | 3 'GCT CTG CCT TTA GGA TCA GCT 5' | 64,2 |
| Gg5 | G. gallus | 3 'AGC AAC TCA GCG ACC TCC TT 5' | 62,3 |
| Gg6 | G. gallus | 3 'CTG GCA TTA TGA TTC ACA GGC A 5' | 60,4 |
Tabel 1. Primes gebruikt in de PCR-amplificaties. * Tm = gemiddelde uitgloeitemperatuur ° C.
Figuur 1. De tp TAIL-PCR-strategie gebruikt om Trypanosoma cruzi kDNA integratie te detecteren in de Gallus gallus genoom. A) een chimeer sequentie met een fragment van kDNA minicircle geconserveerd (donkerblauw) en variabele (lichtblauw) gebieden geïntegreerd in de locus NW_001471687.1 op chromosoom 4 (AY237306) van de kip 10 genoom (groen) werd gebruikt om de gastheer te verkrijgen specifieke primer sets (GG1 tot Gg6). B) De tp TAIL-PCR-amplificaties werden geïnitieerd (primaire cyclus) door hybridiseren van de minicircle specifieke S34 S67 of primers in combinatie met de kip-specifieke GG1 aan Gg6 primers. Verdunde producten die sjabloon voor de secundaire cyclus met de S35 (sense / antisense) primers en de combinaties van Gg primers. In de tertiaire cyclus een verdunning van de secundaire producten werd onderworpen aan amplificatie met kDNA S36 S67 of antisense primers in combinatie met de Gg primers. C) De amplificatieproducten werden gescheiden in 1% agarose gels en overgebracht naar nylon membranen, gehybridiseerd met de probe specifiek kDNA. Monsters die positief signaal werden gebruikt voor klonering van de aansluitpunt bepalen. De combinaties van kDNA en gerichte GG1 te Gg6 wordt boven op de gel. De sequentiële PCR-reacties versterkt doel kDNA-host DNA sequenties met kDNA minicircles (blauw) en het aviaire-sequentie (groen). (Herdrukt van PLoS Neglected Tropical Diseases 3).
Figuur 2. Klinische verschijnselen van verminderde hartfunctie in een 9-maanden oude kip genetisch gemodificeerde door de integratie van de mitochondriale kDNA minicircle van T. cruzi. De arme bloedoxygenatie van de mitochondriale kDNA gemuteerde kip met een paarse kam in contrast met de heldere rode kam van de controle 9-maanden oude chicken vrij van schade aan het hart. (Modified van PLoS Neglected Tropical Diseases 3).
Figuur 3. Gross en microscopische pathologie in Gallus gallus met kDNA mutaties. A) Cardiomegalie in een 9-maanden oude kip die overleed aan hartfalen. B) Controle hart van een niet-geïnfecteerd 9-maanden oude duivin. C) Verwerping van target heart cellen door cytotoxische lymfocyten: Een minimale afwijzing eenheid met labo van de target cellen door het immuunsysteem van lymfocyten is afgebeeld (cirkel). D) controle hart histologie (Gewijzigde van PLoS Neglected Tropical Diseases 3).
Figuur 4. Immunocytochemische analyses van het immuunsysteem cellen geïnfiltreerd het hart van kDNA gemuteerde kip in figuur 3. A) CD45 + lymfocyten geïdentificeerd (pijlen) in het hart van lelingen door fycoerythrine gemerkte specifieke monoklonale antilichaam. B) CD8 + γδ immuun lymfocyten (pijlen) betrokken bij ernstig letsel van het hart. C) Overvloedige CD8α + T-cellen aanwezig zijn in ernstige beschadigingen met hart-cel labo. De inzetstukken geven de afwezigheid van cellen van het immuunsysteem in de controlegroep niet-geïnfecteerde kip hart (Modified van PLoS Neglected Tropical Diseases 3).
Figuur 5. Chagas-achtige gedilateerde inflammatoire cardiomyopathie in een F2 nakomelingen met kDNA integratie in het dystrofine-gen. A) Dilated hart in een 10-maanden oude kippen bezetten het grootste deel van de borstholte (gewicht van het hart = 16 g). B) Dark ronde mononucleaire cellen infiltreert en vernietigt het myocard van de kDNA-gemuteerde kip. C) De normale grootte van het hart (gewicht 7 g) van een 10-maanden oude controle kip. D) De normale histologie van een controle-kip hart. (Modified van PLoS Neglected Tropical Ziekten 3).
Figuur 6. Vergelijkende pathologie in kDNA-gemuteerde kip en bij de mens de ziekte van Chagas. A) Ernstige myocarditis en target heart cel labo in de kDNA-gemuteerde kip. B) Ernstige myocarditis en doelcel labo door het immuunsysteem van lymfocyten in het geval van Chagas hart-en vaatziekten. C) Verwerping van hartcellen door het immuunsysteem van lymfocyten in de kDNA-gemuteerde kip. D) Afwijzing van het hart cellen door het immuunsysteem van lymfocyten in de menselijke ziekte van Chagas. Gekleurd door hematoxiline en eosine. (Modified van Memorias doen Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 14).
Discussion
In tegenstelling tot zoogdieren gevoelig voor een leven lang T. cruzi infecties, kippen niet reageren op T. cruzi-infectie. Het grote voordeel van de kip modelsysteem is de verwijdering van de infectie in de beginfase van de embryonale immuunsysteem. Aldus is de enige parasiet DNA dat in de kip lichaam opgenomen op verschillende loci.
Het gebruik van de optimale hoeveelheid van virulent T. cruzi trypomastigotes te inoculeren vruchtbare ei is de belangrijkste stap naar het verkrijgen van de integratie van de kDNA minicircles in het kippenembryo genoom. Het tarief van de levende kuikens uitbroeden van eieren die geënt is met 100 trypomastigotes is vier keer hoger dan die verkregen met 500 parasieten. Er moet worden genomen om de parasieten suspensie inoculeren in 10 pi kweekmedium in het ei luchtkamer. Er mag geen lekkage van eiwit zijn. Onder optimale omstandigheden, de intracellulaire parasitaire infectie vindt plaats widunne een paar uur na incubatie en parasieten vermenigvuldigen in de gastheer cellen opbrengst voor een week, daarna de infectie wordt geëlimineerd door de aangeboren afweer. De kDNA integratie vereist een levende infectie, en de inoculatie van naakte minicircles in vroege embryo kippeneieren niet leidt tot integratie. De kDNA-positieve embryo's en controles moeten worden gehuisvest onder gecontroleerde omstandigheden bij 37,5 ° C en 65% luchtvochtigheid. De kuikens worden in kooien twee weken bij 33 ° C kamertemperatuur. Daarna worden de kippen worden gehouden in kooien op in zwevende rekken van elkaar gescheiden door 1.5 meter breedte gangpaden in een kamer bij 22 ° C met gefilterde lucht en positieve druk onder constante uitputting om het dierenwelzijn te scheppen. De volwassenen worden gevoed kip-chow en drink drinkbaar stromend water tot volle wasdom en volwassenheid te bereiken, eieren leggen op vijf maanden oud. Onderhoud van hygiënische procedures zijn essentieel voor de reproduceerbaarheid van de resultaten bij het werken met T. cruzi ingeëntin vruchtbare kippeneieren.
In de kip modelsysteem T. cruzi infecties worden uitgeroeid na de ontwikkeling van het immuunsysteem in de vroege periode van embryo groei. Bovendien aan zijn infectie zijn, mogen de kuikens die uitkomen van T. cruzi geënte eieren, in een gebrek aan specifieke antilichamen, tolerant zijn tegen de parasiet antigenen. De afwijzing van het doel hartcellen door cytotoxische lymfocyten (minimaal afwijzing eenheid, figuur 3) is te zien in de kDNA-gemuteerde kippen met genotype wijzigingen en afbraak van de immunologische bewaking 3. De genotypisch gemodificeerd T-cellen aanwezig versnelde verworpen zelf weefsels in het lichaam. De belangrijkste laesie site is het hart, dat is een kenmerk van de ziekte van Chagas. De overgang van een fysiologische (surveillance) om een fysiopathologische staat wordt gezien in de kDNA-gemuteerde kip met klonaal proliferatie van cytotoxische lymfocyten 3.
Tzijn transkingdom model systeem toont een parasiet veroorzaakte, genetisch aangedreven auto-immuunziekte (Figuur 6), die voortvloeien uit genoom wijzigingen door de T. cruzi kDNA minicircle integraties. Deze wijzigingen worden niet gezien in kuikens uitgebroed uit Lb-geïnoculeerde eieren.
Dit fenomeen duidt erop dat de experimentele behandeling van de auto-immune inflammatoire cardiomyopathie in kDNA-gemuteerde kippen kunnen drug onderdrukking van beenmerg van specifieke T-cel fenotype te infiltreren in de hartspier en transplantatie van histocompatible gezond beenmerg nodig hebben om de afwijzing van zelf-weefsel te voorkomen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We zijn dank verschuldigd aan Nancy R. Sturm, afdeling Immunologie, Microbiologie en Moleculaire Biologie, David Geffen School of Medicine, University of California in Los Angeles, voor kritische lezing van het manuscript. De Nationale Raad van Onderzoek-CNPq, en de Stichting voor Onderzoek en Ontwikkeling-FAPDF, Brazilië, ondersteund de studie. Wij danken de technische hulp van Alessandro O. Souza, Maria C. Guimaro, Ciro Cordeiro, Ana de Cassia Rosa, Roseneide Alves en Rafael Andrade, van de Universiteit van Brasilia, Brazilië.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase Recombinant | Invitrogen | 11615-010 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-030 | |
| Random Primers DNA Labeling System | Invitrogen | 18187-013 | |
| EcoRI | Invitrogen | 15202-021 | |
| MboI | Invitrogen | 15248-016 | |
| dNTP Set, 100mM Solutions | GE Healthcare | 28-4065-51 | |
| Amersham Hybond - N+ -- Cat n. | GE Healthcare | RPN303B | |
| PlasmidPrep Mini Spin kit | GE Healthcare | 28-9042-70 | |
| NsiI | Sigma-Aldrich | R5884 1KU | |
| DNA, Sodium Salt Fish Sperm | AMRESCO | 0644-10G | |
| Mouse anti-chicken Bu-1b | SouthernBiotech | 8370-02 | |
| Mouse anti-chicken CD45 | SouthernBiotech | 8270-08 | |
| Mouse anti-chicken TCRγδ | SouthernBiotech | 8230-08 | |
| Mouse anti-chicken CD8α | SouthernBiotech | 9220-02 | |
| Mouse anti-chicken monocyte/macrophage | SouthernBiotech | 8420-02 | |
| MyCycle Termocycler | Bio-Rad | 580BR 5501 |
References
- Teixeira, A. R. Pathogenesis of chagas' disease: parasite persistence and autoimmunity. CMR. 24, 592-630 (2011).
- Teixeira, A. R. Chagas disease. Postg. Med. J. 82, 788-798 (2006).
- Teixeira, A. R. Trypanosoma cruzi in the chicken model: Chagas-like heart disease in the absence of parasitism. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1000 (2011).
- Hecht, M. M. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 5, e9181 (2010).
- Xing, Z. Roles of the ERK MAPK in the regulation of proinflammatory and apoptotic responses in chicken macrophages infected with H9N2 avian influenza virus. J. Gen. Virol. 91, 343-351 (2010).
- Kim, H. B. NIK and IKKbeta interdependence in NF-kappaB signalling--flux analysis of regulation through metabolites. Biosystems. 99, 140-149 (2010).
- Karakhanova, S. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets. Eur. J. Immunol. 40, 254-266 (2010).
- Finsterer, J. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
- Nitz, N. Heritable integration of kDNA minicircle sequences from Trypanosoma cruzi into the avian genome: insights into human Chagas disease. Cell. 118, 175-186 (2004).
- Simpson, L. Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates. Int. Rev. Cytol. 99, 1-19 (1986).
- Bonney, K. M. Heat-killed Trypanosoma cruzi induces acute cardiac damage and polyantigenic autoimmunity. PLoS One. 6, e14571 (2011).
- Moser, D. R. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27, 1477-1482 (1989).
- Sturm, N. R. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol. Biochem. Parasitol. 33, 205-214 (1989).
- Teixeira, A. R. Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 463-491 (2006).
- Yurchenko, V. Y. Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes. J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).
- Simpson, L. The genomic organization of guide RNA genes in kinetoplastid protozoa: several conundrums and their solutions. Mol. Biochem. Parasitol. 86, 133-141 (1997).
- Thomas, S. A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters. Int J. Parasitol. 36, 1217-1226 (2006).
