Summary
Ve aşılama
Abstract
Bebeklik ve çocukluk döneminde edinilen Trypanosoma cruzi akut enfeksiyonları asemptomatik görünüyor, ama kronik olarak enfekte olguların yaklaşık üçte biri, üç yıl veya daha sonraki Chagas hastalığı görünür. Otoimmünite ve parazit sebat teorileri Chagas hastalığı 1, 2 patogenezini açıklamak için yarışıyor. Chagas hastalığı parazit kalıcılık ve otoimmünite oynadığı ayrı roller için biz T. aşılamak döllenmiş yumurta hava odasında cruzi. Olgun tavuk bağışıklık sistemi T. karşı sıkı bir biyolojik bariyer cruzi ve enfeksiyon büyüme 3'ün ilk hafta sonuna kadar bağışıklık sisteminin gelişimi üzerine kökü kazınmıştır. Civciv kuluçka döneminde parazit serbest, ancak parazit kinetoplast mitokondriyal DNA (kDNA) yavrularının aktarılır genom içinde minicircle entegre koruyabilirsiniz. Tavuk genomunda kDNA minicircle entegrasyon Dokümantasyon bir Targ elde edildiyönetişimi başbakan KUYRUK-PCR, Güney hibridizasyonları, klonlama ve sıralama 3, 4. KDNA entegrasyonlar minicircle rüptürü transkripsiyon ve bağışıklık sistemi faktörleri için açık okuma çerçeveleri, fosfataz (GTPaz), adenilat siklaz ve phosphorylases (PKC, NF-Kappa B aktivatör, PI-3K) hücre fizyolojisi, büyüme ve farklılaşma 3, 5 ile ilişkili - 7, ve diğer fonksiyonları geni. Effektörler sitotoksik lenfositler tarafından hedef kalp lifleri reddedilmesi nedeniyle şiddetli miyokardit insan Chagas hastalığı görülen benzer bir inflamatuar kardiyomiyopati gösteren, kDNA mutasyona uğramış tavukları görülür. Özellikle, kalp yetmezliği ve kas güçsüzlüğü kromozom 1 8 distrofin geninin kDNA rüptürü yetişkin tavuk mevcuttur. Benzer genotipik değişiklikler effektörler CD45 +, CD8γδ +, CD8α lenfositler tarafından yürütülen doku yıkımı ile ilişkilidir. Böylece bu protozoon enfeksiyon genetik güdümlü otoimmün hastalığı neden olabilir.
Protocol
1. Parazitler Büyüme
- T. trypomastigote formları büyüyecek cruzi Berenice ve β-galaktosidaz-eksprese Tulahuen T. mürin kas hücre cruzi MHOM/CH/00 C4 (L6)% 5,% 10 FSB, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 250 nM, L-glutamin (pH 7,2) ile Dulbecco minimum gerekli ortamda yetiştirilir 37 de CO 2 ° C. Süpernatant madde içinde serbest yüzer trypomastigotes tavuk yumurtalarının aşılamak için kullanılmıştır.
- Leishmania braziliensis (lb)% 20 FBS DMEM yetiştirilen LTB300 stoku büyür. Üstel büyüme aşamasında Lb promastigote formu yumurta 9 aşılamak için kullanılmıştır.
2. Gübreli Tavuk Yumurta parazit Aşılanması
- 100 T. bir süspansiyonu inoküle cruzi sahne hava haznesi üstüne yumurta kabuğu içine 2-mm çapındaki delikten kültür ortamı 10 ul yılında trypomastigotesX bereketli yumurta. Embriyo hücrelerine öldürücü parazitlerin istilası ve çoğaltma video S1 gösterilmiştir. Kontrol grubu aşağıdaki gibidir: a) kontrolü tavukları, b) Sahte kontrolü yumurta kültür aracı maddesi 10 ul alıcı; kültür aracı maddesi 10 ul içerisinde 100 Lb promastigotları bir süspansiyon ile inoküle c) Aşama X verimli yumurtaları T.. cruzi ve Lb kinetoplastida ailesine aittir. Sırasıyla, bu protozoans sitoplazmada veya ev sahibi hücrelere 10 parasitophorous vakuolde ücretsiz büyür.
- Yapışkan bant ile delikler kapatılmalıdır.
- T. inkübe cruzi-enfekte yumurta ve sahte olan ve olmayan kontrol örneklerinde 37.5 ° C ve 21 gün boyunca% 65 nem.
- Üç hafta boyunca 32 ° C'de 24 saat ve daha sonra için inkübatör içinde yumurtadan civciv tutun.
3. DNA ekstraksiyonu için alınması Örnekleri
- Periferik kan mononükleer hücreler tavuklardan elde edilmiştir: a)T. civcivler cruzi aşılanmış yumurta, b) kontrolleri, c) kültür ortamında 10 ul alan taklit eder; d) Lb inoküle yumurtalardan; tavuklardan Beyaz kan hücreleri standart bir protokol 11 ile göre DNA ekstraksiyonu için işlenir.
- Horozları gelen, ve T. inokule yumurtalardan tavuk toplanan üremiyorlardı oosit (<5 mm) toplanan meni sıvısının da DNA ayıklayın cruzi, ve kontrol yumurta 3, 4 den kuluçkadan tavukları den.
- T. gelen kDNA ayıklayın cruzi epimastigote başka 9 tarif edildiği gibi, Lb promastigotları gelen, aynı zamanda, formları ve.
4. İkinci Astarlar ve Probları
PCR büyütmesi ve termik koşullar için kullanılan primerler Tablo 1 'de gösterilmiştir.
Southern blot hibridizasyonları kullanılan probları edildi:
- Yabani tip minicircle (~ 1.4 kb) puri sıralarıT. gelen tanımladı cruzi epimastigote formları;
- Ben vahşi tip kDNA ve sindirir Nsi elde edilen parçaları (362 bp) Minicircle;
- Nükleer DNA (nDNA) tekrarlayan dizisi (188 bp) Tcz1 / 2 primer ile parazit DNA amplifikasyon elde. Probları% 1 agaroz jel 3 den saflaştırıldı.
- Lb promastigotları gelen vahşi tip minicircle (~ 0.820 kb) sekansları.
5.. PCR Analizleri
- Enfekte ve enfekte olmayan civciv kontrolleri genomik DNA'lar ile standart PCR yöntemi çalıştırın ve T. ile alay cruzi nDNA Tcz1 / 2 ve 12 kDNA s35/s36 13 primerler. Ayrıca, protozoon özel Lb3 ve Lb5 primerler (Tablo 1) kullanılarak Lb virüslü-yumurtalardan tavuk genomik DNA'lar ile PCR çalıştırın.
- 100 ng şablon DNA primerleri, 2 U Taq DNA polimeraz, 0.2 mM dNTP, her bir çifti 0.4 uM ve 1.5 mM MgCİ ile reaksiyon karışımı hale
- 68 ° 72 C / 1 dak ° C soğutma 5 dakika önce son uzatma ile az 95 az 5 dakika, 30 saniye 30 döngüleri ° C/30 saniye için 95 termalcycler programı ° C ayarlayın.
- Etiketli spesifik probları ile melezleştirme için alkali yöntemiyle bir pozitif yüklü naylon membran (GE Life Sciences) transfer edilir% 1.3 agaroz jeli, in amplifikasyon ürünleri analiz [α-32P] Rastgele Primer Labeling Kit (Invitrogen kullanılarak dATP , Carlsbad, CA).
6. Genomik Southern blot
- Mbo I ve / veya Eco RI (Invitrogen) vücut dokularının DNA örnekleri entegre minicircles tek kesim yapmak enzimler kullanın.
- Enfekte olmamış kontrolü tavuklardan ve tavuklardan Digest DNA öldürücü T ile inoküle yumurtalardan cruzi oluşturur.
- Konu T. DNA digests cruzi vetavuk test örnekleri 4 ° C'de 50 V gece boyunca% 0.8 agaroz jel elektroforez
- Pozitif yüklü naylon membrana ayrılmış DNA bantları aktarın.
- Radyo etiketli kDNA prob ile DNA bantları melezler.
- 65, 15 dakika süre ile iki kez yıkanır membran ° 2X SSC ve% 0.1 SDS ile C, iki kez 65 azından 15 dakika süreyle ° C'de 0,2 X SSC ve% 0.1 SDS ve zaman değişken süreler için autoradiograph her.
7. Başbakan KUYRUK-PCR Hedefli
- KDNA amplifikasyonuna 2 ayarlar özel astar ile kDNA primerler birleştiren bir modifiye KUYRUK-PCR tekniği ile tavuk genomuna entegre minicircle üç yürüyüş-PCR iç içe döngüleri, Şekil 1'de gösterilmiştir. Edinin
- Primer döngüsü: Her bir reaksiyon 200 ng şablon DNA, 2.5 mM MgCl2 ve kDNA primerler (S34 veya S67) 0.4 mM, 0.2 mM dNTP, 2.5 U Taq platin (Invitrogen, Carlsbad, C içerirA). Ayrıca, Gg primerler (Gg1 için GG6, Tablo 1) 0.04 uM ile kombinasyon halinde kDNA primerler kullanabilir. 57.9 den 60.1 sıcaklığa ayarlayın ° kDNA astar ve 59.9 ile 65.6 ° C CR-1 astar C. Bu sıcaklıklarda daha yüksek olduğunu unutmayın (~ 45 ° C) KUYRUK-PCR 10 kullanılan keyfi dejenere primerler için gereklidir. Sıcaklık ve bir önceki yazıda 3 açıklanan döngüleri (MyCycle aleti, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) kullanın.
- İkincil döngüsü: Su ilköğretim döngüsü 01:40 (v / v) PCR ürünleri sulandırınız. kDNA primerler S35 ve S35 antisens aynı Gg primerler ile birlikte, bir önceki olanlar değiştirilir.
- Tersiyer döngüsü: Su ikincil döngüsü 1:10 (v / v) PCR ürünleri inceltilir ve ayrı ayrı, S67 antisens veya S36 ile Gg primerler birleştirir.
- Clone doğrudan pGEM T kolay vektör (Promega, Madison, WI): PCR üçüncül döngüsü ürünler Cloneson amplifikasyon ürünleri bu kDNA probu ile melezler.
- KDNA probu ve sırası ile hibridizasyon ile klonlar seçin.
- T. gelen kDNA 300 pg oluşan bir karışım içerisinde tpTAIL-PCR doğrulamak kontrolü kuşlardan DNA 200 ng cruzi kDNA maruz asla. Sıcaklık ve amplifikasyonu döngüleri testi kuşların DNA için kullanılır aynıdır.
8. Chagas Hastalığı Kliniği Tezahür
- T. civcivler tavuk büyüme ve gelişme izleyin cruzi yumurta bulaşmış ve sağlıklı kontrollerin mortalite ve hastalık belirtileri için haftalık günlük enfekte olmayan yumurtalardan.
- Bu tavukların klinik anormallikler (Şekil 2) Algılama ve elektrokardiyografi (EKG) kayıtları elektrik baltalar, kalp hızı ve aritmi 3 değerlendirmek olun.
- Konu kDNA-mutasyona uğramış ve artırılmış ventriküler un EKG kayıtları aylık tavukların kontrolipolar aVF (sol bacak), aVL (sol kol) ve aVR (sağ kol) yol açar ve kalp büyümesi 3 düşündüren olan, sola ortalama elektriksel eksen sapması değerlendirmek.
9. Patoloji ve İmmunokimyasal Analizleri
- KDNA mutasyona uğramış tavuklar doğal ölümlerinden sonra Record kalp ve vücut ağırlığı indeksleri (Şekil 3). Aynı yaş ve cinsiyet kontrolü tavuklar için de indeksler edinin.
- Kalp, yemek borusu, bağırsak, iskelet kası, akciğer, karaciğer, böbrekler ve bölümleri atın.
- Doku parafin gömmek, (pH 7.4)% 10 tamponlu formalin ve 4 mikron Hematoksilen-Eosin (HE) boyama ve histolojik analizler (Şekil 3) kalınlığında kesitler kesilerek düzeltildi.
- Embriyolardan Hasat ve bisect dokular X-Gal-leke için β-galaktosidaz ifade parazitler ile aşılanmış yumurta, ve konu civcivler. 9
- 1 embriyo dokuların diğer yarısı FixFormalin% 0, pH 7.4 ve 9.3 adım gibi devam edin.
- 4μm ince parafin doku bölümünde kesin ve mikroskobik inceleme için cam slayt üzerine monte edin.
- Anti-T. karşı insan chagasic antiserum (1:1024 dilüsyon) ile X-Gal-lekeli mavi hücreleri gösteren inkübe bölümleri cruzi antijen.
- PBS, pH 7.4, 5 ile çırpıda her dk bölümleri yıkanır.
- Bir floresein-konjuge tavşan anti-insan IgG ile ikinci inkübasyon tarafından embriyonun dokularda mavi hücreler Leke.
- Coverslip ile PBS (adım 8) ile montaj bölümleri yıkayın ve T. colocalizing için 502 nm dalga boyu, 200x büyütme, UV ışığı altında inceleme sonucunda yeşil ışık-up mavi hücreler gözlemlemek embriyo hücrelerinde cruzi.
10. Kalp Lezyonlarında Fenotip Bağışıklık Sistemi Hücreleri
- KDNA pozitif gelen ve kontrol kDNA negatif tavuklardan kalp doku kesitlerinde Fenotip effektörler bağışıklık hücreleri.
- Ile slaytlar yerleştirin5 dk her biri için 100 ila% 70% ksilen ve daha sonra mutlak etanol PBS içinde dört yıkama in verilmesinden önceki balmumu eritmek için 30 dakika süreyle 65 ° C'de parafin içine gömülmüş doku bölümü.
- Distile su, hava kuru slaytları durulayın ve SouthernBiotech, Birmingham, AL elde edilen spesifik monoklonal antikorlar (floresein veya R fikoeritrin-konjuge monoklonal antikorlar) ile tedavi.
- Anti-tavuk Ayşe-1 (Bu-1 ve Bu-1 b alleli, Bay 70-75 kDa) Mab AV20 kendilenmiş tavukların B hücre antijenleri monomorfik belirleyici tanımak için farenizi kullanın.
- Anti-CD45 tavuk, fare Ig izotip IgM1 κ tavuk timus soyu hücreleri (Bay 190 215-kDa varyant) özgü.
- Fare anti-tavuk TCRγδ + (Bay 90-kDa heterodimeri) Mab timus bağımlı CD8α + T hücreleri özgü.
- Anti-tavuk Mab CD-8 tavuk α zinciri (Bay 34 kDa) özgü inci tanımak farenizi kullanıntimositlerin, dalak, kalp ve diğer dokularda e CD8 hücreleri.
- Sadece fagosit sisteminin monosit / makrofajlar tanımak için fare anti-tavuk KuL01 kullanın.
- 0,1 M PBS, pH 7.4, 5 dakika nemli bir odada 90 dakika boyunca belirli bir anti-fenotip antikoru ile birlikte, her inkübasyonun ardından ile kayar üç kez yıkanır.
- Kırmızı ve yeşil floresan etiketli hücreleri (Şekil 4) tespit etmek, sırasıyla, emisyon dalga boyu 567 filtresi ve 502 nm ile bir floresan ışık mikroskobu altında sınavı için tamponlu gliserin ile slayt birleştirin.
11. Veri Analizleri
- Tavuk genom veritabanı (kullanın http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 BLASTn dizisi analizleri için).
- E-değer puanları belirlemek için ClustalW diziler kullanın.
- GI istihdamRI tekrar maskeleme algoritması (Censor http://girinst.org/censor/index.php kimerik dizileri tekrarlar farklı sınıflar lokalizasyonu için).
- WU-Blastn-modifiye-matrix 3 yardımıyla, kDNA dizileri potansiyel gRNAs tanımlamak için kinetoplastida Ekleme ve Silme Sıra Arama Aracı (KISS) kullanır.
- T. kullanın cruzi dizileri http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas kDNA-konak DNA kimeralar yılında gRNAs aramak-in. 11.6) Kullanım Student t ve deney ve kontrol grupları elde edilen elektrik eksen sapmaları arasında ve kalp / vücut ağırlığı indeksleri arasında önemli farklılıklar tespit etmek ve mortalite oranları yumurtadan tavuk gruplar arasında önemli farklılıklar tespit etmek için sırasıyla Kolmorov-Smirnov testi, T. gelen cruzi iyumurta noculated ve denetimleri.
12. Temsilcisi Sonuçlar
100 virülan T. inokülasyon bereketli tavuk yumurta hava odasına cruzi trypomastigotes canlı yavruları anlamlı oranları azaltmaz. Yaklaşık% 60 sağlıklı civciv yumurtadan çıkar ve% 40 kuluçka döneminde embriyo sıvılaştırma veya embriyo ölüm meydana gelebilir. Kalan civcivler genom entegre kDNA minicircle sırasını korur. Ancak bazı civcivler yumurtadan çıktıktan hafta kardiyomegali ve başarısızlık ile ölmek bekleniyor. Kalan civcivler zahiren sağlıklı yetişkinler ulaşacak. Yaşamın her aşamasında kendi kan mononükleer hücrelerden çıkartılan DNA kDNA PCR amplifikasyonu verim, ancak nDNA olmayacaktır. Hedefli-prime KUYRUK-PCR 3, 4 klonlanmış ürünler ve sıra kDNA 5 macrochromosomes 1 bölgelerinde kodlama ağırlıklı olarak entegre minicircles gösterecektir. Birden kDNA i gösteren tavukhücre büyümesi ve farklılaşması, bağışıklık sistemini düzenleme faktörleri ve DNA tamirinde kodlayan genlerin içine ntegrations kendine hedef dokularda (Şekil 3) reddedilmesi geçmeye adaydır. Örneğin, hücre zarı ile hücre iskeletinin bağlayan bir protein kodlama, distrofin gen (Şekil 5) rüptürü kDNA mutasyon gösteren tavuk otoimmün inflamatuar kardiyomiyopati ve kalp yetmezliği gelişir için bir adaydır.
Bu genomik değişiklikler Lb enfekte yumurtalardan civciv görülme değildir. T arasında farklılıklar vardır cruzi ve Lb kDNA minicircles; T. dört değişken bölge (VR) ile cruzi k DNA minicircle ortalama 1.4 kb yapısı CA zengin bükük DNA replikasyonu başlaması için belirli siteleri kabul edildiği korunmuş her CSB1 sunan bölgeler (CR), CSB2 ve CSB3 bölgeler, transkripsiyon, tarafından serpiştirilmiş rekombinasyon ve lateral DNA transferi için
| Astar boya | Hedef DNA | Dizi | Tm * |
| S 34 | T. cruzi kDNA | 5 'ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3' | 57.9 |
| S 67 | T.cruzi kDNA | 5 'GGT TTT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' | 60.1 |
| S 35 | T. cruzi kDNA | 5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' | 59.4 |
| S 36 | T. cruzi kDNA | 5 'GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3' | 57,9 |
| Lb3 | Lb kDNA | 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3' | 55.9 |
| Lb5 | Lb kDNA | 5 'CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3' | 61.4 |
| Gg 1 | Gallus gallus | 5 'AGC TGA TTK TAA AGG CAG AGC 3' | 60.1 |
| Gg2 | Gallus G. | 5 'CTG AGC CTC TGCTTT GAA A 3 ' | 56.8 |
| Gg3 | Gallus G. | 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3' | 60.1 |
| Gg4 | Gallus G. | 3 'GCT CTG MKK TTA GGA TCA GCT 5' | 64.2 |
| Gg5 | Gallus G. | 3 'AGC AAC TCA KHK TTK ACC TT 5' | 62.3 |
| GG6 | Gallus G. | 3 'CTG TTA DHA TGA GGC TTC ACA A 5' | 60.4 |
Tablo 1. Primes PCR Büyütmelerinin kullanılır. * Tm = ortalama tavlama sıcaklığı ° C
Şekil 1. Tp KUYRUK-PCR stratejisi Gallus gallus genomuna Trypanosoma cruzi kDNA entegrasyon algılamak için kullanılır. A) kDNA bir parçası olan bir kimerik dizisi tavuk 10 genomu (yeşil) kromozom 4 (AY237306) de odağı NW_001471687.1 entegre korunmuş (koyu mavi) ve değişken (açık mavi) bölgeleri minicircle ana elde etmek için kullanıldı spesifik primer setleri (Gg1 için GG6). B) tp KUYRUK-PCR amplifikasyon tavuk özgü Gg1 için GG6 primerler ile birlikte minicircle özgü S34 ya da S67 primer tavlama tarafından (birincil çevrim) başlandı. Seyreltilmiş ürünleri S35 (duygusu / antisens) astar ve Gg primerlerin kombinasyonları ile ikincil çevrimi için şablon sağladı. Üçüncül döngüsünde ikincil ürün bir seyreltme Gg astar ile kombinasyon halinde kDNA S36 veya S67 antisens primerlerle amplifikasyon tabi tutuldus. C) Bu amplifikasyon ürünleri% 1 agaroz jel ayrılmış ve naylon membrana transfer, özel kDNA prob ile hibridize edildi. Pozitif sinyal gösteren örnekleri entegrasyon noktasının belirlenmesi için klonlanması için kullanılmıştır. KDNA kombinasyonları ve Gg1 için GG6 hedeflenen jeli üzerinde gösterilir. Sıralı PCR reaksiyonları kDNA minicircles (mavi) ve kuş dizisi (yeşil) ile hedef kDNA-konak DNA dizileri çoğaltıldı. (Tropikal Hastalıklar 3 İhmal PLoS den yeniden basılmıştır).
Şekil 2. Genetik mitokondriyal kDNA entegrasyonu tarafından değiştirilmiş 9 aylık tavuk bozulmuş kalp fonksiyonu klinik belirtileri T. gelen minicircle cruzi. Kontrolü 9 aylık chicke ve parlak kırmızı tarağı ile mor bir tarak karşıtlıkları gösteren mitokondriyal kDNA mutasyona uğramış tavuk zayıf kan oksijenasyonun kalp hasarı ücretsiz. (Tropikal Hastalıklar 3 İhmal PLoS modifiye edilmiştir).
Şekil 3. KDNA mutasyonları olan Gallus gallus patoloji Brüt ve mikroskopik. A) kardiyomegali kalp yetmezliği nedeniyle öldü 9 aylık dişide. Bir Noninfekte 9 aylık tavuktan B) Kontrol kalp. C) sitotoksik lenfositler tarafından hedef kalp hücrelerinin Reddetme: bağışıklık lenfositler tarafından hedef hücrelerin lyses ile minimal ret birim (daire) tasvir edilmiştir. D) Kontrol kalp histolojisi (Tropikal Hastalıklar 3 İhmal PLoS modifiye edilmiştir).
Şekil 4. Şekil 3'te gösterildiği gibi kDNA-mutasyona uğramış tavuk kalp sızmakta bağışıklık sistemi hücreleri İmmünositokimyasal analizi. A) CD45 + lenfosit kalp le (oklar) tespitBir phycoerythrin-etiketli spesifik monoklonal antikoru tarafından lezyonlar. B) CD8 + kalp şiddetli imha dahil γδ bağışıklık lenfositler (oklar). C) Bol CD8α + T hücreleri kalp hücresi lyses şiddetli lezyonlar mevcut. Ekler kontrolü enfekte tavuk kalp (Tropikal Hastalıklar 3 İhmal PLoS modifiye edilmiştir) bağışıklık sistemi hücrelerinin olmadığını göstermektedir.
Şekil 5. Distrofin gen kDNA entegrasyonu ile F2 yavrularında dilate kardiyomiyopati inflamatuar Chagas-gibi. Toraks (kalp ağırlığı = 16 g) büyük kısmını işgal 10 aylık tavuk A) Genişlemiş kalp. B) Karanlık yuvarlak mononükleer hücre infiltrasyonlar ve kDNA-mutasyona uğramış Dişideki miyokard yok. 10 aylık kontrolü tavuk C) Normal kalp büyüklüğü (ağırlığı 7 gram). Bir kontrol tavuk kalp D) Normal histoloji. (PLoS gelen Modifiye İhmal TropicHastalıklar al 3).
Şekil 6. KDNA-mutasyona uğramış tavuk ve insan Chagas hastalığı Karşılaştırmalı patoloji. KDNA-mutasyona uğramış tavuk A) Şiddetli miyokardit ve hedef kalp hücresi lyses. Chagas kalp hastalığı durumunda bağışıklık lenfositleri tarafından B) Şiddetli miyokardit ve hedef hücre lyses. KDNA-mutasyona uğramış tavuk bağışıklık lenfositler tarafından kalp hücrelerinin C) Reddi. Insan Chagas hastalığı immün lenfositler tarafından kalp hücrelerinin D) Reddi. Hematoksilen ve Eosin ile boyandı. (Memorias den modifiye yapmak Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 14).
Discussion
Ömrü uzun T. duyarlı memelilerde aksine cruzi enfeksiyonları, tavuk T. refrakter olan cruzi enfeksiyonu. Tavuk model sisteminin en büyük avantajı embriyonik bağışıklık sisteminin gelişimi erken enfeksiyon ortadan kaldırılmasıdır. Böylece, tavuk vücut içinde kalan tek parazit DNA birkaç odakta entegre edilmiştir.
Virulent T. optimal miktar kullanılması cruzi bereketli yumurta aşılamak için trypomastigotes tavuk embriyo genomuna kDNA minicircles entegrasyonu alma yolunda kritik bir adımdır. 100 trypomastigotes ile Kuluçkalanan yumurtalardan canlı piliçler kuluçka oranı 500 parazit ile elde edilenden daha dört kat daha fazladır. Bakım yumurta hava odasına kültür ortamı 10 uL içinde parazit süspansiyon aşılamak için alınmalıdır. Yumurta beyazı hiçbir sızıntı olmamalıdır. Optimum şartlar altında hücre içi parazit enfeksiyonu yer alır wisonra enfeksiyon doğal bağışıklığın tarafından elimine edilir; birkaç saat bir hafta için konak hücreye gelirleri içinde kuluçka ve parazit çarpma sonrası ince. KDNA entegrasyon yaşayan bir enfeksiyon gerektirir ve erken embriyo tavuk yumurtası çıplak minicircles inokulasyonundan entegrasyonu yol açmaz. KDNA-pozitif embriyo ve kontroller 37.5 ° C ve 65% bağıl nemde kontrollü şartlar altında muhafaza edilmelidir. Civcivler 33 ° C oda sıcaklığında iki hafta boyunca kafeslerde tutulur. Bundan sonra tavuklar 22 bir odada 1,5 metre genişliğindeki koridor ayrılmış askıya raflarında kafeslerde tutulur ° C filtreli hava ve hayvan sağlığı koşulları sağlamak için sürekli yorgunluk altında pozitif basınç ile. Yetişkin tavuk yemi beslenen ve yaş beş ayda yumurta, tam büyüme ve olgunluğa ulaşmak için içme akan su içeceğiz. T. çalışırken hijyenik prosedürlerinin Bakım sonuçlarının tekrarlanabilirliği için gerekli olan cruzi aşılandıbereketli tavuk yumurtası içine.
Tavuk model sistem T. cruzi enfeksiyonları embriyonun büyüme erken dönemde bağışıklık sisteminin gelişiminden sonra eradike edilmiştir. Ayrıca, T. gelen yumurtadan civciv enfeksiyon-özgür olmak için cruzi parazit antijenlerine karşı hoşgörülü, spesifik antikor eksikliği, yumurta aşılandı. Sitotoksik lenfosit (minimal rejeksiyonu birimi, Şekil 3) tarafından hedef kalp hücrelerinin immünolojik rejeksiyon gözetim 3 genotipine modifikasyonlar ve dökümünü gösteren kDNA-mutasyona uğramış tavuklarda görülür. Genotipik değiştirilmiş T hücrelerinin vücutta kendini dokuların hızlandırılmış reddi sunuyoruz. Ana lezyon yerinde Chagas hastalığının bir özelliğidir kalbidir. Bir fizyopatolojik durumuna (gözetleme), fizyolojik ile geçit klonal sitotoksik lenfosit 3 proliferasyonunu gösteren kDNA-mutasyona uğramış tavuk görülür.
TOnun transkingdom model sistem T. genom değişiklikleri kaynaklanan, bir parazitin neden olduğu, genetik tabanlı otoimmün hastalık (Şekil 6) gösterir cruzi kDNA entegrasyonlar minicircle. Bu değişiklikler Lb-inoküle yumurtalardan civciv görülme değildir.
Bu olgu kendini doku reddi önlemek için ilaç miyokard infiltre spesifik T-hücre fenotipi kemik iliği progenitör baskılanması ve histocompatible sağlıklı kemik iliği nakli gerektirebilecek kDNA-mutasyona uğramış tavukları inflamatuvar otoimmün kardiyomiyopati bu deneysel tedavi öneriyor.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Nancy R. Sturm, İmmünoloji Anabilim Dalı, Mikrobiyoloji ve Moleküler Biyoloji, eleştirel okuma yazması için David Geffen Tıp Okulu, Los Angeles Kaliforniya Üniversitesi, borçluyuz. Araştırma-CNPq Ulusal Konseyi, Araştırma Geliştirme-FAPDF, Brezilya Vakfı, çalışma destekledi. Biz Brasilia, Brezilya Üniversitesi, Alessandro O. Souza, Maria C. Guimaro, Ciro Cordeiro Ana de Cassia Rosa, Roseneide Alves, ve Rafael Andrade teknik yardım ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase Recombinant | Invitrogen | 11615-010 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-030 | |
| Random Primers DNA Labeling System | Invitrogen | 18187-013 | |
| EcoRI | Invitrogen | 15202-021 | |
| MboI | Invitrogen | 15248-016 | |
| dNTP Set, 100mM Solutions | GE Healthcare | 28-4065-51 | |
| Amersham Hybond - N+ -- Cat n. | GE Healthcare | RPN303B | |
| PlasmidPrep Mini Spin kit | GE Healthcare | 28-9042-70 | |
| NsiI | Sigma-Aldrich | R5884 1KU | |
| DNA, Sodium Salt Fish Sperm | AMRESCO | 0644-10G | |
| Mouse anti-chicken Bu-1b | SouthernBiotech | 8370-02 | |
| Mouse anti-chicken CD45 | SouthernBiotech | 8270-08 | |
| Mouse anti-chicken TCRγδ | SouthernBiotech | 8230-08 | |
| Mouse anti-chicken CD8α | SouthernBiotech | 9220-02 | |
| Mouse anti-chicken monocyte/macrophage | SouthernBiotech | 8420-02 | |
| MyCycle Termocycler | Bio-Rad | 580BR 5501 |
References
- Teixeira, A. R. Pathogenesis of chagas' disease: parasite persistence and autoimmunity. CMR. 24, 592-630 (2011).
- Teixeira, A. R. Chagas disease. Postg. Med. J. 82, 788-798 (2006).
- Teixeira, A. R. Trypanosoma cruzi in the chicken model: Chagas-like heart disease in the absence of parasitism. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1000 (2011).
- Hecht, M. M. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 5, e9181 (2010).
- Xing, Z. Roles of the ERK MAPK in the regulation of proinflammatory and apoptotic responses in chicken macrophages infected with H9N2 avian influenza virus. J. Gen. Virol. 91, 343-351 (2010).
- Kim, H. B. NIK and IKKbeta interdependence in NF-kappaB signalling--flux analysis of regulation through metabolites. Biosystems. 99, 140-149 (2010).
- Karakhanova, S. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets. Eur. J. Immunol. 40, 254-266 (2010).
- Finsterer, J. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
- Nitz, N. Heritable integration of kDNA minicircle sequences from Trypanosoma cruzi into the avian genome: insights into human Chagas disease. Cell. 118, 175-186 (2004).
- Simpson, L. Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates. Int. Rev. Cytol. 99, 1-19 (1986).
- Bonney, K. M. Heat-killed Trypanosoma cruzi induces acute cardiac damage and polyantigenic autoimmunity. PLoS One. 6, e14571 (2011).
- Moser, D. R. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27, 1477-1482 (1989).
- Sturm, N. R. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol. Biochem. Parasitol. 33, 205-214 (1989).
- Teixeira, A. R. Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 463-491 (2006).
- Yurchenko, V. Y. Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes. J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).
- Simpson, L. The genomic organization of guide RNA genes in kinetoplastid protozoa: several conundrums and their solutions. Mol. Biochem. Parasitol. 86, 133-141 (1997).
- Thomas, S. A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters. Int J. Parasitol. 36, 1217-1226 (2006).
