Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Fenotypeanalyser og Isolering av murine hematopoetiske stamceller og Lineage-engasjerte stamfedre

doi: 10.3791/3736 Published: July 8, 2012

Summary

En metode for å analysere fordelingen av benmarg blodkreft stamfedre i flowcytometri samt å effektivt isolere høyrenset blodkreft stamceller (HSCs) er beskrevet. Isolasjonen prosedyren er hovedsakelig basert på magnetisk anrikning av c-Kit + celler og celle sortering for å rense HSCs for cellulære og molekylære studier.

Abstract

Benmargen er det viktigste stedet der HSCs og mer modne blodceller avstamning stamfedre bor og differensiere i en voksen organisme. HSCs utgjør et minutt celle populasjon av pluripotent celler i stand til å generere alle blodceller linjene for en levetid 1. Den molekylære disseksjon av HSCs homeostase i benmargen har viktige implikasjoner i hematopoiesis, onkologi og regenerativ medisin. Vi beskriver merking protokollen med fluorescerende antistoffer og det elektroniske gating prosedyren i flowcytometri å score blodkreft progenitor undergrupper og HSCs distribusjon i enkelte mus (Fig. 1). I tillegg beskriver vi en metode for å utstrekning berike blodkreft stamfedre samt langsiktig (LT) og kortsiktige (ST) rekonstituering HSCs fra sammenslåtte benmarg cellesuspensjoner av magnetisk anrikning av celler uttrykker c-Kit. Den resulterende celleforberedelsen kan brukes til å sortere utvalgte undergrupper for in vitro ogin vivo funksjonelle studier (Fig. 2).

Begge trabekulært osteoblaster 2,3 og sinusformet endotelet 4 utgjør funksjonelle nisjer støtter HSCs i benmargen. Flere mekanismer i osteoblastaktivitet nisje, blant en undergruppe av N-cadherin + osteoblaster 3 og samhandling av reseptoren tyrosin kinase Tie2 uttrykt i HSCs med sin ligand angiopoietin-1 5 enig i å bestemme HSCs quiescence. "Dvale" i benmargen er avgjørende for å beskytte HSCs fra replikering og eventuell utmattelse ved overdreven sykling aktivitet seks. Eksogene stimuli som virker på cellene i det medfødte immunsystemet som Toll-like receptor ligander 7 og interferon-alfa 6 kan også indusere proliferasjon og differensiering av HSCs inn avstamning engasjerte stamfedre. Nylig har en befolkning på sovende mus HSCs innenfor LIN - c-Kit + SCA-1 + CD150 + CD48 - CD34 - befolkningen har blitt beskrevet åtte. Sortering av celler basert på CD34 uttrykk fra hematopoetiske stamceller-beriket cellesuspensjon som beskrevet her tillater isolering av både stillestående selv fornye LT-HSCs og ST-HSCs 9. En lignende prosedyre basert på nedbryting av avstamning positive celler og sortering av LT-HSC med CD48 og Flk2 antistoffer har vært beskrevet tidligere 10. I den foreliggende rapporten gir vi en protokoll for fenotypisk karakterisering og ex vivo cellesyklus analyse av hematopoetiske stamceller, som kan være nyttig for å overvåke hematopoiesis i ulike fysiologiske og patologiske forhold. Videre beskriver vi en FACS sortering prosedyre for HSCs, som kan brukes til å definere faktorer og mekanismer som regulerer deres selvfornyelse, ekspansjon og differensiering i cellebiologi og signaltransduksjon analyser så vel som for transplantasjon.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Utarbeidelse av cellesuspensjon fra benmargen

  1. Avlive musen og plassere dyret i en rustfri kjele og spray 70% etanol på sin buk og rygg. Samle femur og tibia fra bakbena, og ryggsøylen.
  2. Nøyaktig fjerne alle myke vev rester fra ryggsøylen med en skarp spiss saks og fra ben bein med en kompress. Oppbevar bein i en 50 ml Falcon rør med 30 ml RPMI medium som inneholder 10% varme inaktivert fosterets storfe serum (FBS), supplert med 50 mM β-mercaptoethanol, 100 mikrometer MEM Non-essensielle aminosyrer, 1 mm MEM Sodium Pyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 mikrogram / ml streptomycin og 100 U / ml penicillin.
  3. Dekk bunnen av en tidligere sterilisert mørtel med sterile filtre.
  4. Overfør bein inn i morter og dekke dem med et lag av filtre for å montere en friksjon overflate.
  5. Forbered en 50 ml Falcon rør utstyrt med en Falcon filter.
  6. Knuse beinmed hjelp av en stampe inntil få en homogen cellesuspensjon.
  7. Overfør suspensjon inn i røret.
  8. Legg til mørtelen 5 ml fersk RPMI komplett medium å vaske og høste de gjenværende cellene.
  9. Gjenta de to siste punktene før de homogeniserte knoklene vises tydelig.
  10. Overfør og filtrere i en ny tube cellesuspensjonen for å eliminere gjenværende vev rusk.
  11. Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon. Pass på ikke å forstyrre den cellepelleten.

2. Fenotypeanalyser

  1. Resuspender og vaske cellene enkelte mus i 15 mL PBS og 2% FBS.
  2. Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon. Pass på ikke å forstyrre pelleten.
  3. Heng pellet i 5 mL PBS og 2% FBS og telle celler.
  4. 1 Overføring × 10 6 celler / brønn i 96 en brønner rund bunnplate.
  5. Sentrifuger platen på 1500 rpm i 5 min.
  6. Forbered en blanding av mAbs rettet mot følgende overflaten markører. Fortynn dem som angitt i PBS og 2% FBS å farge cellene.
    • CD4, CD8, CD3 og CD45R, CD19, GR1, Ter119, NK1.1 konjugert til PE-Cy5 1:200
    • c-Kit konjugert til APC 1:100
    • Sca1 konjugert til biotin 01:50
    • CD34 konjugert til FITC 01:50
    • FcγR konjugert til PE 1:100
    • IL-7R konjugert til PE-Cy7 1:100
  7. Kast supernatanten og tilsett 50 mL av mAbs miks til hver brønn. Distansere inn enkeltceller ved pipettering.
  8. Inkuber cellene for 20 min i mørke ved 4 ° C.
  9. Vask cellene to ganger med 150 mL PBS og 2% FBS.
  10. Sentrifuger platen på 1500 rpm i 5 min og kast supernatanten ved å snu platen.
  11. Fortynn streptavidin i PBS og 2% FBS som indikert å farge cellene.
    • Streptavidin conjugated til APC-Cy7 1:300
  12. Tilsett 50 mL av løsningen til hver brønn. Distansere i single cellesuspensjonen ved pipettering.
  13. Inkuber cellene i 10 min i mørke ved 4 ° C.
  14. Vask cellene to ganger med 150 mL PBS og 2% FBS.
  15. Sentrifuger platen på 1500 rpm i 5 min og kast supernatanten.
  16. Resuspender celler i 100 mL PBS og 2% FBS.
  17. Tilegne prøver på FACS.

3. Magnetic Anrikning av c-Kit + celler

  1. Forbered en bufferløsning som inneholder PBS, 7,2 pH, 0,5% bovint serum albumin (BSA), og 2 mM EDTA.
  2. Resuspender cellen pellet av bein squash stammer fra minst 10 mus i 1 mL bufferløsning som inneholder c-Kit MAB konjugert til APC utvannet 01:50.
  3. Inkuber cellene for 20 min i mørke ved 4 ° C.
  4. Vask to ganger cellene med 40 mL buffer løsning.
  5. Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min og fjern forsiktig than supernatanten ved aspirasjon. Pass på ikke å forstyrre pelleten.
  6. Resuspender cellepelleten og tilsett 50 mL av Anti-APC MicroBeads for hver avlives musen direkte til pellets.
  7. Bland godt og inkuber i 20 min i mørke ved 4 ° C.
  8. Vask cellene ved å legge 40 mL bufferløsning og sentrifuger ved 1500 rpm i 5 min. Aspirer supernatanten helt.
  9. Resuspender cellepelleten i multiplum av 4 mL bufferløsning hver tredje mus avlives.
  10. Plasser MACS LS kolonner i magnetfelt av en egnet MACS separator. Bruk en kolonne hver tredje mus avlives.
  11. Forbered kolonner ved å skylle med 4 mL buffer løsning.
  12. Påfør cellesuspensjon på kolonnene.
  13. Samle umerkede celler som passerer gjennom og vaske kolonne med 4 mL buffer løsning. Utfør vaske skritt ved å legge 4 mL bufferløsning tre ganger. Legg til ny buffer når kolonnen reservoaret tømmes.
  14. Fjern kolonner fra separator og Place hver på toppen av 15 ml falcon rør.
  15. Pipetter 4 mL bufferløsning på hver kolonne. Skyll ut magnetisk merkede celler ved å skyve stempelet inn i kolonnen.
  16. Sentrifuger rørene på 1500 rpm i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon.
  17. Resuspender hver pellet med 1 mL bufferløsning og gruppe pellets i en enkelt 15 ml falk tube.

4. Sortering av hematopoetiske stamceller og Lineage engasjerte stamfedre

  1. Forbered en blanding av mAbs rettet mot følgende overflaten markører. Fortynn dem som angitt i 500 mL PBS og 2% FBS å farge cellene.
    • CD4, CD8, CD3 og CD45R, CD19, GR1, Ter119, NK1.1 konjugert til PE-Cy5 1:200
    • c-Kit konjugert til APC 1:100
    • SCA-1 konjugert til biotin 01:50
    • CD34 konjugert til FITC 01:50
    • FcγR konjugert til PE 1:100
  2. Sentrifuger røret fra previous seksjon ved 1500 rpm i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon.
  3. Legg til mAbs blandingen til pellets. Distansere i single cellesuspensjonen ved pipettering.
  4. Inkuber cellene for 20 min i mørke ved 4 ° C.
  5. Vask to ganger cellene med 14ml PBS og 2% FBS.
  6. Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min og kast supernatanten.
  7. Fortynn streptavidin som angitt i 500 mL PBS og 2% FBS å farge cellene.
    • Streptavidin konjugert til APC-Cy7 1:300
  8. Legg løsningen på røret. Distansere i single cellesuspensjonen ved pipettering.
  9. Inkuber cellene i 10 min i mørke ved 4 ° C.
  10. Vask to ganger cellene med 14 mL PBS og 2% FBS.
  11. Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min og kast supernatanten.
  12. Resuspender celler i 500 mL PBS og 2% FBS.
  13. Overfør og filtrere cellesuspensjon i en ny 5 ml tube for å Eliminate mobilnettet aggregater som kan forstyrre den sortering prosedyren.
  14. Tilsett 5 mL av 7-AAD (bruk den utvannet 1:100) til cellen suspensjon for å utelukke 7-AAD + døde celler fra de sorterte populasjoner.
  15. Sortere celler med en BD FACSAria etter følgende fenotyper:
    • LKS celler: Lin - c-Kit + SCA-1 +
    • LT-HSCs: LKS CD34 -
    • ST-HSCs: LKS CD34 +
    • GMPs: lin - c-Kit + SCA-1 lav FcγR høy CD34 +
    • Parlamentsmedlemmene: lin - c-Kit + SCA-1 lav FcγR lav CD34 -
    • CMPs: lin - c-Kit + SCA-1 lav FcγR lav CD34 +

5. Representative Resultater

Figur 1 viser og eksempel elektronisk gating prosedyren tilpoengsum vanlige lymfoide stamceller (CLPs) som Lin - / c-Kit LO / interleukin (IL)-7R + celler; Lin - / c-kit + / SCA-1 + (LKS) og Lin - / c-Kit + / Sca -1 Lo (c-Kit +) celler, fra c-Kit + gate er vanlige myeloide stamceller (CMPs) identifisert som FcγR lo CD34 + celler, granulocytt / monocytt stamfedre (GMPs) som FcγR hi CD34 + celler og megakaryocyte / erytrocyttantigener stamfedre (parlamentsmedlemmene) som FcγR lo CD34 - celler; fra LKS gate, LT-HSC og ST-HSC er identifisert som CD34 - og CD34 + celler, henholdsvis. Dette benmargen cellesuspensjon kan bli beriket for c-kit + celler med magnetiske perler (Fig. 2), LT-HSC og ST-HSC kan deretter sorteres etter CD34 uttrykk så vel som andre stamfedre henhold til fenotypen beskrevet ovenfor.

HSCs kan være ana lyzed i levende bildebehandling konfokalmikroskopi som vist i figur 4, hvor CD34 - celler ble farget med nucleotide-bindende sammensatte quinacrine 11 samt kjernekraft rød (DRAQ5). I HSCs, men ikke GMPs, quinacrine-positive vesikler er synlige i cytoplasma 12. Videre kan sortert HSCs brukes i funksjonelle eksperimenter som vist i figur 5, som viser økningen i cytosoliske Ca 2 + i LT-HSC ved aktivering av purinergic P2 reseptorer ved eksponering for adenosin-trifosfat (ATP) og ionomycin 12.

Figur 1
Figur 1. Representant prikk tomt analyse av Lin-BM celler. Electronic gating prosedyre ved strømningscytometer å identifisere og scorer blodkreft stamfedre og HSCs fra beinmarg cellesuspensjon beiset som beskrevet i protokollen teksten.

pload/3736/3736fig2.jpg "/>
Figur 2. En ordning for selektiv anrikning av c-Kit + celler fra benmargen.

Figur 3
Figur 3 Cellesyklus analyse av elektronisk gated LKS CD34 -. HSCs i friske kontroller og mus med IBD farget med Ki-67 antistoff og DAPI. Celler ble fikset og permeabilized med Lyse / Fiks og Perm buffere etterfulgt av farging med FITC konjugert Ki-67 og DAPI på en mikrogram / ml. Sykling celler er knapt om i det hele påvises i LKS CD34 - HSCs kupé av friske kontrollpersoner 12.

Figur 4
. Figur 4. Live avbildning konfokalmikroskopi av FACS sortert CD34 - HSCs og GMPs farget med nucleotide-bindende sammensatte quinacrine og kjernekraft rød (DRAQ5). De små kvadrantene viser quinacrine positive blemmer oppdaget i cytoplasma av HSCs men ikke GMPs.

Figur 5
Figur 5. Cytosoliske Ca 2 + forhøyede sortert HSCs lastet med Fura-2 og stimulert med ATP og ionomycin. Spor fra enkeltceller vises. Alle cellene var lydhør til ekstracellulær ATP viser fremtredende økning i cytosoliske Ca 2 + etter tilsetting av ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metoden beskrevet her muliggjør rask og nøyaktig analyse av hematopoiesis i enkelte mus (figur 1). Denne analysen i ulike eksperimentelle innstillinger, inkludert murine modeller av betennelse, autoimmunitet, immunsvikt, degenerative sykdommer, metabolske forstyrrelser og kreft, kan ta opp virkningen av patologiske tilstander på hematopoiesis. Figur 3 viser analysen av cellen sykling aktivitet på elektronisk gated LKS CD34 - celler fra friske mus og mus med inflammatorisk tarmsykdom (IBD) 13 ved farging med Ki-67 MAB og DAPI. Sistnevnte viste en betydelig økning av celler i S / G 2 / M faser av cellesyklus. Denne analysen i flowcytometri demonstrerer effekten av T-celle mediert inflammasjon på HSC sykling aktivitet 12.
Kombinasjon av magnetisk merking og berikelse av benmargceller uttrykke c-Kit med celle sortering i flyt cytometry tillater isolering av høyrent blodkreft avstamning stamfedre og HSCs. De innhentet celle populasjoner kan brukes i en rekke analyser for å studere cellebiologi (figur 4), signaltransduksjon (figur 5), developmentally regulert genuttrykk og in vitro, samt in vivo funksjonelle potensialet i forskjellige celle undergrupper. Ble faktisk magnetisk beriket c-Kit + celler brukt for å kunne innpode ikke-bestrålte verter å studere dynamisk variasjon av HSCs sykling aktivitet i steady state og betennelse 14. I våre hender prosedyren beskrevet her gir mer effektiv og raskere gjenoppretting av benmargceller enn bein spyling med en gjennomsnittlig yield på 200.000 LKS celler per mus. Den svært lite antall av sovende HSCs som kan isoleres fra sammenslåtte bein squash med flere mus utgjør en grense for eksperimentelle tilnærminger som krever flere celler. For å obviate til denne begrensningen, i mange tilfeller foreløpigestudier kan utføres på flere rikelig LKS celler å se for seg mer fokuserte og punktlig analyser som skal utføres i CD34 - sovende HSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa og Markus Manz for dyrebare råd. Dette arbeidet ble finansiert av det sveitsiske National Science Foundation, sveitsiske Cancer League og Fondazione Ticinese per la Ricerca sul Cancro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Gibco 42401
MEM NEAA 100X Gibco 11140
Sodium Pyruvate Gibco 11360
PenStrep Gibco 15070
PBS Gibco 20012
FBS Gibco 16000
Cell Strainer 40 μm BD Falcon 352340
7-AAD Staining solution BD Pharmingen 559925
Lyse/Fix buffer BD Pharmingen 558049
Perm buffer III BD Pharmingen 558050
Ki-67 BD Pharmingen 556026
DAPI Invitrogen D21490
CD4 (GK1.5) eBioscience 150041
CD8 (53-6.7) eBioscience 150081
CD3 (145-2C11) eBioscience 150031
CD45R (RA3-6B2) eBioscience 150452
CD19 (6D5) eBioscience 150193
Gr1 (RB6-8C5) eBioscience 155931
Tre119 (TER-119) eBioscience 155921
NK-1.1 (PK136) eBioscience 455941
c-Kit (2B8) eBioscience 171171
Sca-1 (D7) eBioscience 135981
CD34 (RAM34) eBioscience 110341
FcγR (2.4G2) eBioscience 553145
Anti-APC MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-855
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
  2. Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
  3. Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
  4. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  5. Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
  6. Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
  7. Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
  8. Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
  9. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  10. Lo Celso, C., Scadden, D., D, Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
  11. Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
  12. Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
  13. Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
  14. Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
Fenotypeanalyser og Isolering av murine hematopoetiske stamceller og Lineage-engasjerte stamfedre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors. J. Vis. Exp. (65), e3736, doi:10.3791/3736 (2012).More

Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors. J. Vis. Exp. (65), e3736, doi:10.3791/3736 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter