Summary
Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.
Abstract
Kemik iliği HKH'ler ve daha olgun kan hücrelerinin soy ataları ikamet ve yetişkin bir organizmanın bir farklılaşmanın temel sitedir. HKH'lerin ömür boyu 1 için tüm kan hücre soylarının yaratabilmeleridir pluripotent hücrelerin bir dakika hücre popülasyonu oluşturmaktadır. Kemik iliğindeki HKH'ler homeostazının moleküler diseksiyonu hematopoezisi, onkoloji ve rejeneratif tıp açısından önemli olmaktadır. Biz floresan antikor ve bireysel farelerde hematopoetik progenitör alt ve HKH'lerin dağılımı (Şekil 1) puan almak için akım sitometri içinde elektronik yolluk prosedürü ile etiketleme protokolü tanımlar. Ayrıca, yaygın hematopoietik öncü yanı sıra uzun vadeli (LT) ve c-Kit eksprese eden hücrelerin manyetik zenginleştirme tarafından toplanan kemik iliği hücre süspansiyonları gelen HKH'ler yeniden yapılandırılması kısa vadeli (ST) zenginleştirmek için bir metodu tanımlar. Elde edilen hücre hazırlanması için in vitro olarak seçilen alt sıralamak ve etmek için kullanılabilirİn vivo çalışmalar işlevsel (Şekil 2).
Hem trabeküler osteoblastlar 2,3 ve sinüzoidal endotel 4 kemik iliğinde HKH'ler destekleyen fonksiyonel niş oluşturmaktadır. N-kaderin + osteoblastlar 3 alt ve ligand anjiyopoietin-1 5 ile HKH'ler ifade reseptör tirozin kinaz Tie2 etkileşimi de dahil olmak üzere osteoblastik niş içinde çeşitli mekanizmalar HKH'ler sessizliğini belirlenmesinde hemfikir. Kemik iliğinde "Hazırda" aşırı bisiklet aktivitesi üzerine 6 çoğaltma ve sonunda yorgunluktan HKH'ler korumak için çok önemlidir. Böyle Toll-like reseptör ligandlar 7 ve interferon-α 6 gibi doğuştan gelen bağışıklık sistemi hücrelerinde etkili eksojen uyarılara da soyu adamış ataları içine yayılması ve HKH'lerin ayrımı uyarabilir. Son zamanlarda, lin içinde uyuyan fare HKH'ler nüfusu - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - nüfusu 8 tarif edilmiştir. Hücrelerin Sıralama burada açıklandığı gibi hematopoietik öncü zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu ile CD34 ekspresyonunun dayalı sağlar sakin kendini yenileyen LT-HKH'ler ve ST-HKH'ler 9 hem de izolasyon. Soyu pozitif hücrelerinin tükenmesine ve CD48 ve Flk2 antikorları ile birlikte LT-KYH sıralama göre benzer bir prosedür, daha önce 10 tarif edilmiştir. Bu yazıda fenotipik karakterizasyonu ve farklı fizyolojik ve patolojik şartlarda hematopoez izlemek için yararlı olabilir hematopoietik öncü, ex vivo hücre döngüsü analizi için bir protokol sağlar. Ayrıca, biz faktörleri ve hücre biyolojisi ve sinyal iletimi deneyleri yanı sıra transplantasyon için kendi kendini yenileme, genişleme ve farklılaşma düzenleyen mekanizmaları tanımlamak için kullanılabilir HKH'ler, prosedürü sıralama bir FACS açıklar.
Protocol
1. Kemik İliği gelen Hücre Süspansiyon hazırlanması
- Fare Euthanize ve karın ve geriye doğru olan paslanmaz pan ve sprey% 70 etanol içinde hayvan yerleştirin. Femur ve tibia arka bacak ve omurga toplayın.
- Doğru sivri uçlu makasla ve bir gazlı bez ile bacak kemiklerinden omurga tüm yumuşak doku artıkları çıkarın. 50 uM β-merkaptoetanol, 100 uM MEM olmayan amino asitler ile desteklenmiş% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 1 mM sodyum piruvat MEM, 2 içeren RPMI medyumu ile 30 ml bir 50 mL Falcon tüp içinde kemiklerin deposunda mM L-glutamin, 100 ug / ml streptomisin ve 100 U / ml penisilin.
- Steril filtrelerle önceden sterilize harç alt örtün.
- Harç haline kemikleri aktarılır ve bir sürtünme yüzeyine monte etmek için bir filtre katmanı ile kapsamaktadır.
- Falcon filtresi ile donatılmış bir 50 ml Falcon tüpü hazırlayın.
- Kemikler parçalamakhomojen bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar bir havaneli yardımıyla.
- Tüpüne süspansiyon aktarın.
- Kalan hücreler yıkayın ve hasat taze RPMI tam orta harç 5 ml ekleyin.
- Homojenize kemikleri net görünmesine kadar son iki nokta tekrarlayın.
- Geriye kalan kalıntı doku ortadan kaldırmak amacıyla hücre süspansiyonu transferi ve yeni bir tüp içinde filtre.
- 5 dakika 1.500 rpm'de santrifüj tüpü ve dikkatli aspirasyon ile süpernatantı kaldırın. Hücre pelletini rahatsız değil emin olun.
2. Fenotipik Analizi
- Yeniden süspanse ve PBS ile% 2 FBS 15 mL bireysel farelerin hücreleri yıkanır.
- 5 dakika 1.500 rpm'de santrifüj tüpü ve dikkatli aspirasyon ile süpernatantı kaldırın. Pelet rahatsız değil emin olun.
- 5 ml PBS ile% 2 FBS ve sayım hücrelerinde pelet askıya.
- Transferi 1 × 10 6 hücre / 96 kuyu yuvarlak altplakası.
- 5 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüje plakası.
- Aşağıdaki yüzey işaretleyicileri karşı yöneltilmiş mAbs bir karışımı hazırlayın. Bunların seyreltilir olarak PBS ile gösterilir ve% 2 FBS hücreleri leke.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 PE-Cy5 1:200 ile konjuge
- APC 1:100 c-Kit konjuge
- Biotin 1:50 konjuge SCA1
- FITC 1:50 konjuge CD34
- PE 1:100 konjuge FcγR
- PE-Cy7 1:100 IL-7R konjuge
- Süpernatant atın ve her kuyuya mAbs karması 50 uL ekleyin. Pipetleme tarafından tek hücrelere ayrışır.
- 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika süreyle inkübe hücreleri
- PBS 150 uL% 2 FBS ile iki kez yıkanır hücreleri.
- 5 dakika 1.500 rpm'de santrifüj plaka ve tersini plaka ile süpernatantı atın.
- PBS içinde streptavidin seyreltilir ve% 2 FBS gibi hücrelerin leke belirtti.
- Streptavidin conjuAPC-Cy7 1:300 için gated
- Her bir kuyucuğa solüsyonu 50 uL ekleyin. Pipetleme tarafından tek hücre süspansiyonu haline ayrışır.
- 4 ° C'de karanlıkta 10 dakika süreyle inkübe hücreleri
- PBS 150 uL% 2 FBS ile iki kez yıkanır hücreleri.
- 5 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüje plakası ve süpernatant atılır.
- PBS ile% 2 FBS 100 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- FACS numune edinin.
3. C-Kit + Hücrelerinin Manyetik Zenginleştirme
- PBS, pH 7.2, (BSA)% 0.5 sığır serum albümin, ve 2 mM EDTA ihtiva eden bir tampon çözeltisi hazırlayın.
- APC ile konjuge c-Kit mAb ihtiva eden tampon çözeltisi 1 mL, en azından 10 fareden türetilmiş kemik kabak hücre pelletini 01:50 seyreltilmiştir.
- 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika süreyle inkübe hücreleri
- Tampon solüsyonu, 40 mL ile iki kez yıkanır hücreleri.
- 5 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüje tüpü ve dikkatli bir şekilde t kaldırmakdiye aspirasyon süpernatant. Pelet rahatsız değil emin olun.
- Pastör pipetiyle hücre pelletini ve pelet doğrudan her ötanazi fare için Anti-APC mikroboncuk 50 ul ekleyin.
- İyice karıştırılır ve 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika inkübe edilir ve
- 5 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüj tampon çözeltisi ve 40 mL eklenerek hücrelerin yıkanır. Tamamen süpernatant aspire.
- Her üç fare ötanazi tampon çözelti 4 mL katları şeklinde Pastör pipetiyle hücre pelletini.
- Uygun bir MACS Ayırıcı manyetik alanda Yer MACS LS sütunlar. Her üç fare ötanazi 1 sütun kullanın.
- Tampon çözelti 4 mL ile durulama sütunlar hazırlayın.
- Sütunlar üzerine hücre süspansiyonu uygulayın.
- Geçmesine ve tampon çözelti 4 mL ile sütun yıkayın etiketsiz hücreleri toplayın. Tampon solüsyonu 4 mL üç kez ekleyerek yıkama adımları gerçekleştirmek. Kolon rezervuar boşaltılır yeni tampon ekleyin.
- Ayırıcı ve Plac sütunları çıkarıne 15 ml falcon tüpleri üstündeki her biri.
- Her sütun üzerine tampon solüsyonu 4 ml. Hemen sütuna pistonu iterek manyetik etiketli hücreleri temizler.
- 5 dakika 1.500 rpm'de santrifüj tüpleri ve dikkatli aspirasyon ile süpernatantı kaldırın.
- Tek bir 15 ml Falcon tüp içinde tampon çözelti ve grup peletlerin 1 mL her pelletini.
4. Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage kararlı progenitörlerin Sıralama
- Aşağıdaki yüzey işaretleyicileri karşı yöneltilmiş mAbs bir karışımı hazırlayın. Bunların seyreltilir gibi hücreler leke 500 uL% 2 ve PBS FBS gösterilir.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 PE-Cy5 1:200 ile konjuge
- APC 1:100 c-Kit konjuge
- Biotin 1:50 Sca-1 konjuge
- FITC 1:50 konjuge CD34
- PE 1:100 konjuge FcγR
- Previou gelen boru santrifüjes 5 dakika 1.500 rpm'de bölümü ve dikkatli aspirasyon ile süpernatantı kaldırın.
- Pelet için mAbs karışımı ekleyin. Pipetleme tarafından tek hücre süspansiyonu haline ayrışır.
- 4 ° C'de karanlıkta 20 dakika süreyle inkübe hücreleri
- 14 ml PBS içinde% 2 FBS ile iki kez yıkanır hücreleri.
- 5 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüje tüpü ve süpernatant atılır.
- Streptavidin ile seyreltilir olarak 500 uL PBS ile gösterilir ve% 2 FBS hücreleri leke.
- APC-Cy7 1:300 konjuge Streptavidin
- Tüp çözüm ekleyin. Pipetleme tarafından tek hücre süspansiyonu haline ayrışır.
- 4 ° C'de karanlıkta 10 dakika süreyle inkübe hücreleri
- 14 ml PBS ile% 2 FBS ile iki kez yıkanır hücreleri.
- 5 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüje tüpü ve süpernatant atılır.
- PBS ile% 2 FBS 500 uL içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Eli için yeni bir 5 mL tüp içinde hücre süspansiyonu aktarılır ve filtresıralama prosedürü ile karışabilir hücresel agrega minate.
- Sıralanır popülasyonlarının 7-AAD + ölü hücreleri çıkarmak amacıyla hücre süspansiyonu ila 7-Aad 5 uL (it 1:100 seyreltilmiş kullanım) ekleyin.
- Aşağıdaki fenotipleri göre BD FACSAria ile Sıralama hücreleri:
- LKS hücreleri: lin - c-Kit + Sca-1 +
- LT-HKH'ler LKS CD34 -
- ST-HKH'ler LKS CD34 +
- GMP: lin - c-Kit + Sca-1 düşük FcγR yüksek CD34 +
- AP üyeleri: lin - c-Kit + Sca-1 düşük FcγR düşük CD34 -
- CMPS: lin - CD34 c-Kit + Sca-1 düşük FcγR düşük +
5.. Temsilcisi Sonuçlar
1 gösterir ve elektronik perdeleme prosedür örnek ŞekilLin skoru yaygın lenfoid ataları (CLPs) - / c-Kit lo / interlökin (IL)-7R + hücreleri; Lin - / c-Kit + / Sca-1 + (LKS) ve Lin - / c-Kit + / Sca -1 lo (c-Kit +) hücreleri; c-Kit + kapısından, ortak miyeloid ataları (CMPS) FcγR lo CD34 + hücreler, FcγR hi CD34 + hücreleri ve / megakaryosit olarak granülosit / monosit ataları (GMP) olarak tanımlanır FcγR lo CD34 olarak eritrosit ataları (MEP) - hücreleri; LKS kapısı, LT-HSC ve ST-HSC gelen CD34 olarak tanımlanır - ve CD34 + hücreler, sırasıyla. Yukarıda açıklanan fenotipe göre CD34 ekspresyonunun hem de diğer ataları göre sıralanabilir LT-HSC ve ST-HSC; Bu kemik iliği hücre süspansiyonu manyetik bilye (Şekil 2) c-Kit + hücreleri için zenginleştirilmiş olabilir.
HKH'ler ana olabilir hücreleri nükleotid bağlayıcı bileşik tedavi protokollerinin geliştirilebileceğini 11 gibi nükleer kırmızı (DRAQ5) ile boyandı - CD34 Şekil 4, gösterildiği gibi canlı görüntüleme konfokal mikroskopi lize. HKH'lerin olarak, ancak GMP değil, tedavi protokollerinin geliştirilebileceğini pozitif veziküller sitoplazma 12 görünür. + LT-HSC maruz kalan purinerjik P2 reseptörlerinin aktivasyonu sitosolik Ca 2 artış gösterir Şekil 5, gösterildiği gibi Dahası, sıralanır HKH'ler fonksiyonel deneylerde kullanılan adenosin trifosfat-(ATP) ve 12 ila ionomycin.
Şekil 1. Lin-BM hücrelerinin Temsilcisi nokta arsa analizi. Protokol metninde belirtildiği gibi kemik iliği hücre süspansiyon hematopoietik öncü ve HKH'lerin belirlemek ve skor akış sitometresi at Elektronik yolluk prosedürü boyandı.
pload/3736/3736fig2.jpg "/>
Şekil 2. Kemik iliğinden c-Kit + hücrelerin seçici zenginleştirme için bir planı.
Şekil 3 elektronik kapılı LKS CD34 Hücre döngüsü analizi -. Sağlıklı kontrol ve Ki-67 antikoru ve DAPI ile boyanarak İBH olan farelerde HKH'ler. Hücreler sabit ve / Lyse Fix ve 1 mcg / ml FITC Ki-67 konjuge ve DAPI ile boyanarak takip tamponları Perm ile permeabilize edildi. Bisiklete binme hücreler ancak LKS CD34 tüm saptanabilir eğer - sağlıklı kontrollerin 12 HKH'ler bölmesi.
. Nükleotid bağlayıcı bileşik tedavi protokollerinin geliştirilebileceğini ve nükleer kırmızı (DRAQ5) ile boyandı HKH'ler ve GMP - Şekil 4 CD34 sıralanmış FACS görüntüleme konfokal mikroskopi yaşayın. Küçük kadran tedavi protokollerinin geliştirilebileceğini pos göstermekitive veziküller HKH'ler sitoplazmasında algılandı, ancak GMP değil.
Şekil 5. Sitosolik Ca 2 + Fura-2 yüklü ve ATP ve ionomycin ile uyarılan sıralanmış HKH'ler yükselme. Tek hücreden izleri gösterilmiştir. Tüm hücreleri + ATP ilavesinden sonra sitozolik Ca 2 belirgin artış gösteren ekstrasellüler ATP duyarlı idi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan yöntem tek tek fareleri (Şekil 1) in hematopoiesis hızlı ve doğru analizine olanak tanır. Fare inflamasyon modelleri, otoimmünite, immün yetmezlik, dejeneratif hastalıklar, metabolik hastalıklar ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli deneysel ayarları, bu analiz hematopoiezis patolojik durumun etkisini ele veriyor. Şekil 3 elektronik kapılı LKS üzerinde hücre bisiklet aktivitesi analizini gösterir CD34 - Ki-67 mab ve DAPI ile boyanarak sağlıklı farelerde ve inflamatuar bağırsak hastalığı (İBH) 13 ile farelerden alınan hücreleri. İkincisi hücre döngüsünün S / G 2 / M fazda hücreleri için önemli bir artış göstermiştir. Sitometrisi Bu analiz HSC bisiklet etkinliği 12 T hücre aracılı iltihap etkisini gösterir.
Hücre ile c-Kit ifade manyetik etiketleme ve kemik iliği hücrelerinin zenginleştirme kombinasyonu akışı cytometr sıralamay yüksek hematopoetik soy ataları ve HKH'lerin saflaştırılmış izolasyonu sağlar. Elde edilen hücre popülasyonlarının hücre biyolojisi (Şekil 4), sinyal transdüksiyonu (Şekil 5), developmentally düzenlenir gen ekspresyonu ve aynı zamanda farklı hücre alt in vivo fonksiyonel potansiyel olarak in vitro deneyleri incelemek için bir dizi kullanılabilir. Gerçekten de, manyetik zenginleştirilmiş c-Kit + hücreler sürekli ve inflamasyon 14 HKH'ler bisiklet aktivitesi dinamik değişimi incelemek için başarıyla aşılamak olmayan ışınlanmış bilgisayarlar için kullanılmıştır. Bizim ellerde burada açıklanan işlemden fare başına 200.000 LKS hücrelerin ortalama verim püskürtülerek kemik daha kemik iliği hücrelerinin daha etkin ve hızlı iyileşme sağlar. Birden farelerin toplanmış kemik kabak izole edilebilir sakin HKH'ler arasında çok az sayıda daha fazla hücre gerektiren deneysel yaklaşımlar için bir sınır oluşturmaktadır. Ön birçok durumda, bu sınırlama önlemek içinsakin HKH'ler - etüd CD34 içerisinde yapılması daha odaklı ve zamanında analiz öngördüğünü daha bol LKS hücreleri üzerinde yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz değerli tavsiye için Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa ve Markus Manz teşekkür ederiz. Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, İsviçre Kanser Ligi ve Fondazione Ticinese başına la RIcerca sul Cancro tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Arai, F. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell. 118, 149-161 (2004).
- Essers, M. A. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458, 904-908 (2009).
- Nagai, Y. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment. Immunity. 24, 801-812 (2006).
- Wilson, A. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135, 1118-1129 (2008).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Lo Celso, C., Scadden, D., D, Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs. J. Vis. Exp. (2), e157 (2007).
- Romanello, M. Autocrine/paracrine stimulation of purinergic receptors in osteoblasts: contribution of vesicular ATP release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1429-1438 (2005).
- Casati, A. Cell-autonomous regulation of hematopoietic stem cell cycling activity by ATP. Cell Death Differ. 18, 396-404 (2011).
- Bouma, G., Strober, W. The immunological and genetic basis of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol. 3, 521-533 (2003).
- Takizawa, H., Regoes, R. R., Boddupalli, C. S., Bonhoeffer, S., Manz, M. G. Dynamic variation in cycling of hematopoietic stem cells in steady state and inflammation. J. Exp. Med. 208, 273-284 (2011).
