Summary
Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.
Abstract
A medula óssea é o principal local onde HSCs e glóbulos mais maduros progenitores da linhagem residem e se diferenciar em um organismo adulto. HSCs constituem uma população de células minutos de células pluripotentes, capazes de gerar todas as linhagens de células do sangue para um tempo de vida-1. A dissecção molecular da homeostase HSCs na medula óssea tem implicações importantes na hematopoiese, oncologia e medicina regenerativa. Nós descrevemos o protocolo marcação com anticorpos fluorescentes e ao processo gating electrónico na citometria de fluxo para marcar subconjuntos progenitoras hematopoiéticas e distribuição HSCs em ratinhos individuais (Fig. 1). Além disso, nós descrevemos um método para enriquecer extensivamente progenitores hematopoiéticos, bem como a longo prazo (LT) e de curto prazo (ST) reconstituindo HSCs a partir do conjunto de osso suspensões de células de medula através de um enriquecimento magnética de células que expressam c-Kit. A preparação de células resultante pode ser usada para classificar os subconjuntos seleccionados para in vitro eOs estudos in vivo funcionais (Fig. 2).
Ambos os osteoblastos trabeculares 2,3 e 4 endotélio sinusoidal constituem nichos funcionais de apoio HSCs na medula óssea. Vários mecanismos no nicho osteoblástico, incluindo um subconjunto de osteoblastos + N-caderina 3 e interação do receptor tirosina quinase TIE2 expressa em HSCs com sua angiopoietina-1 ligando cinco concorrem na determinação quiescência HSCs. "Hibernação" da medula óssea é fundamental para proteger HSCs de replicação e eventual exaustão sobre a atividade de ciclismo excessiva 6. Estímulos exógenos que actuam sobre as células do sistema imune inato, tais como ligandos de receptores Toll-like 7 e interferão-a 6 também pode induzir a proliferação e diferenciação de HSCs em linhagem progenitores comprometidos. Recentemente, uma população de HSCs rato latentes dentro do lin - c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD48 - CD34 - A população tem sido descrito 8. Triagem de células com base em CD34 expressão a partir da suspensão de células hematopoiéticas progenitoras enriquecido como descrito aqui permite o isolamento de ambos quiescente auto-renovação LT-HSCs e ST-HSCs 9. Um procedimento semelhante com base na depleção da linhagem de células positivas e triagem de LT-HSC com CD48 e Flk2 anticorpos foi previamente descrita 10. No presente relatório, nós fornecemos um protocolo para a caracterização fenotípica e ex vivo análise do ciclo celular de células progenitoras hematopoéticas, que pode ser útil para monitorar a hematopoiese em diferentes condições fisiológicas e patológicas. Além disso, descrevem um procedimento para a triagem FACS HSCs, que podem ser utilizados para definir os factores e mecanismos que regulam a sua auto-renovação, expansão e diferenciação em biologia celular e os ensaios de transdução de sinal, bem como para o transplante.
Protocol
1. Preparação de suspensão de células da medula óssea
- Euthanize o mouse e colocar o animal em uma panela inoxidável e spray de etanol 70% em seu abdômen e nas costas. Colete fêmur e da tíbia das pernas traseiras e coluna vertebral.
- Precisão remover todos os resíduos de tecidos moles da coluna vertebral com uma tesoura ponta afiada e das pernas ossos com uma gaze. Ossos loja em um tubo Falcon 50 mL com 30 mL de meio RPMI contendo 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), suplementado com 50 mM β-mercaptoetanol, 100 iM MEM não-aminoácidos essenciais, 1 mM de piruvato de sódio MEM, 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de estreptomicina e 100 U / ml de penicilina.
- Cobrir o fundo de uma argamassa previamente esterilizado com filtros estéreis.
- Transfira os ossos na argamassa e cobrir com uma camada de filtros, a fim de montar uma superfície de atrito.
- Prepara-se uma 50 mL tubo Falcon fornecido com um filtro de Falcon.
- Esmagar os ossoscom a ajuda de um pilão até a obtenção de uma suspensão de células homogéneas.
- Transferir a suspensão dentro do tubo.
- Adicionar ao mL argamassa 5 de meio RPMI fresco completo para lavar e colher as células restantes.
- Repita os dois últimos pontos até os ossos aparecem homogeneizadas claro.
- Transferir e filtrar num tubo novo a suspensão de células a fim de eliminar os detritos tecido restante.
- Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o pellet celular.
2. Análise fenotípica
- Ressuspender as células e lava-se de ratinhos individuais em 15 mL de PBS e FBS 2%.
- Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
- Suspender o sedimento em 5 ml de PBS e FBS 2% e contagem de células.
- Transferência de 1 × 10 6 células / poço em um fundo de poços 96 rodadaplaca.
- Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min.
- Prepara-se uma mistura de mAbs dirigidos contra os marcadores de superfície que se seguem. Diluir-los, como indicado em PBS e 2% de FBS para corar as células.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugado com PE-Cy5 1:200
- c-Kit conjugado a APC 1:100
- SCA1 conjugado com biotina 1:50
- CD34 conjugado com FITC 1:50
- FcγR conjugado com PE 1:100
- IL-7R conjugado com PE-Cy7 1:100
- Descartar o sobrenadante e adicionar 50 uL de mistura de mAbs a cada poço. Dissociar-se em células individuais por pipetagem.
- Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C.
- Lave as células duas vezes com 150 uL de PBS e 2% de FBS.
- Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante invertendo a placa.
- Diluir estreptavidina em PBS e 2% de FBS como indicado para corar as células.
- Estreptavidina conjugate para APC-Cy7 1:300
- Adicionar 50 uL da solução a cada poço. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem.
- Incubar as células durante 10 min no escuro a 4 ° C.
- Lave as células duas vezes com 150 uL de PBS e 2% de FBS.
- Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 100 uL de PBS e FBS 2%.
- Adquirir amostras em FACS.
3. Enriquecimento magnético de Células + c-Kit
- Preparar uma solução tampão contendo PBS, pH 7,2, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), e 2 mM de EDTA.
- Ressuspender o sedimento de células de medula óssea derivado de, pelo menos, 10 ratinhos em 1 mL de solução tampão contendo c-Kit mAb conjugado a APC diluído 1:50.
- Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C.
- Lavar duas vezes as células com 40 mL de solução tampão.
- Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover tele sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
- Ressuspender o sedimento de células e adicionar 50 uL de anti-APC micropérolas para cada rato sacrificados directamente para o sedimento.
- Misturar bem e incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C.
- Lave as células por adição de 40 mL de solução tampão e centrifuga-se a 1.500 rpm durante 5 min. Aspirar completamente o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento de células em múltiplo de 4 mL de solução tampão de três em três ratinhos sacrificados.
- Colocar MACS colunas LS no campo magnético de um separador de MACS adequados. Use uma coluna a cada três ratos submetidos à eutanásia.
- Preparar colunas, por lavagem com 4 mL de solução tampão.
- Aplicar suspensão de células para as colunas.
- Recolher células não marcadas que passam através da coluna e lava-se com 4 mL de solução tampão. Realizar passos de lavagem, adicionando 4 ml de solução tampão de três vezes. Adicionar tampão novo quando o reservatório coluna é esvaziada.
- Remover colunas do separador e place cada um em cima de 15 tubos mL Falcon.
- Pipetar 4 mL de solução tampão para cada coluna. Imediatamente lavar as células magneticamente marcadas, empurrando o êmbolo para dentro da coluna.
- Centrifugar os tubos a 1500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração.
- Ressuspender cada pellet com 1 mL de solução tampão e pelotas de grupo em um único tubo de 15 mL Falcon.
4. Seleção de Células-Tronco Hematopoéticas e Lineage Progenitores comprometidos
- Prepara-se uma mistura de mAbs dirigidos contra os marcadores de superfície que se seguem. Diluir-los, como indicado em 500 uL de PBS e FBS a 2% para corar as células.
- CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugado com PE-Cy5 1:200
- c-Kit conjugado a APC 1:100
- Sca-1 conjugada com biotina 1:50
- CD34 conjugado com FITC 1:50
- FcγR conjugado com PE 1:100
- Centrifugar o tubo a partir da previoua secção a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração.
- Adicionar a mistura de mAbs para o sedimento. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem.
- Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C.
- Lavar duas vezes as células com 14 mL de PBS e FBS 2%.
- Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante.
- Diluir estreptavidina, como indicado em 500 uL de PBS e 2% de FBS para corar as células.
- Estreptavidina conjugada com APC-Cy7 1:300
- Adicionar a solução para o tubo. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem.
- Incubar as células durante 10 min no escuro a 4 ° C.
- Lavar duas vezes as células com 14 mL de PBS e 2% de FBS.
- Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 500 uL de PBS e FBS 2%.
- Transferir e filtrar a suspensão de células em um tubo novo mL 5, a fim de eliminate agregados celulares que podem interferir com o processo de classificação.
- Adicionar 5 uL de 7-AAD (usá-lo diluído 1:100) à suspensão de células a fim de excluir 7-AAD + células mortas das populações ordenados.
- Células de classificação com um FACSAria BD de acordo com os seguintes fenótipos:
- Células LKS: Lin - c-Kit + Sca-1 +
- LT-HSCs: LKS CD34 -
- ST-HSCs: LKS CD34 +
- BPF: lin - c-Kit + Sca-1 FcγR baixa alta CD34 +
- Deputados: lin - c-Kit + Sca-1 FcγR baixo baixo CD34 -
- CMPs: lin - c-Kit + Sca-1 FcγR baixo baixo CD34 +
5. Os resultados representativos
A Figura 1 mostra e exemplo do procedimento gating electrónico paraA pontuação comuns progenitores linfóides (CLPs) como Lin - / c-Kit Io / interleucina (IL)-7R + de células; Lin - / c-kit + / Sca-1 + (LKS) e Lin - / c-Kit + / Sca -1 Lo (c-kit +) células, a partir do c-Kit + portão, comuns progenitores mielóides (CMPS) são identificadas como FcγR Io células CD34 +, progenitores de granulócitos / monócitos (BPF) como FcγR hi células CD34 + e megacariócitos / progenitores de eritrócitos (MPE) como FcγR eis CD34 - células; a partir do portão LKS, LT-HSC e ST-HSC são identificados como CD34 - e células CD34 +, respectivamente. Esta suspensão de células de medula óssea pode ser enriquecida para células + c-Kit com esferas magnéticas (Fig. 2); LT-HSC e ST-HSC pode então ser classificados de acordo com a expressão de CD34, bem como outras células progenitoras de acordo com o fenótipo descrito acima.
HSCs pode ser ana lisados em microscopia confocal de imagem ao vivo, como mostrado na Figura 4, onde CD34 - células foram coradas com o composto de nucleótidos de ligação quinacrina 11, bem como nuclear vermelho (DRAQ5). Em HSCs, mas não BPF, quinacrina-positivas vesículas são visíveis na 12 citoplasma. Além disso, HSCs ordenados pode ser utilizado em experiências funcionais, tal como demonstrado na figura 5, que mostra o aumento em Ca 2 + citosólico em LT-HSC pela activação dos receptores purinérgicos P2 após a exposição a adenosina-trifosfato (ATP) e ionomicina 12.
Figura 1. Representante análise gráfico de pontos de Lin-BM células. Procedimento gating electrónico no citómetro de fluxo para identificar e marcar progenitores hematopoiéticos e HSCs de suspensão de células de medula óssea coradas como descrito no texto de protocolo.
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Figura 2. Um esquema para o enriquecimento selectivo de células + c-kit da medula óssea.
Figura 3 análise do ciclo celular de LKS fechados eletronicamente CD34 -. HSCs em controles normais e ratos com IBD corados com o anticorpo Ki-67 e DAPI. As células foram fixadas e permeabilizadas com Lyse / Fix e Perm buffers seguida de coloração com conjugado com FITC Ki-67 e DAPI menos 1 ug / ml. Ciclismo células são mal se em tudo detectável no LKS CD34 - HSCs compartimento de controles saudáveis 12.
. Figura 4 Viva microscopia confocal da imagem FACS classificadas CD34 - HSCs e BPF coradas com a quinacrina composto nucleotide-binding e vermelho nuclear (DRAQ5). Os quadrantes mostram pequenas quinacrina posvesículas tivo detectada no citoplasma das HSCs mas não GMPs.
Figura 5. Citosólica de Ca 2 + elevações na HSCs ordenados carregadas com Fura-2 e estimuladas com ATP e ionomicina. Traços de células individuais são mostrados. Todas as células foram responsivos à ATP extracelular mostrando um aumento proeminente na citosólica de Ca 2 + após a adição de ATP.
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Discussion
O método aqui descrito permite a análise rápida e precisa da hematopoiese em ratinhos individuais (Figura 1). Esta análise em várias configurações experimentais, incluindo modelos murinos de inflamação, auto-imunidade, imunodeficiências, doenças degenerativas, doenças metabólicas e câncer, permite abordar o impacto de condições patológicas na hematopoiese. Figura 3 mostra a análise da atividade de ciclo celular em LKS eletronicamente fechados CD34 - células de camundongos saudáveis e camundongos com doença inflamatória intestinal (DII) 13 por coloração com Ki-67 mab e DAPI. O último exibido um aumento significativo de células em S / G 2 / M fases do ciclo celular. Esta análise em citometria de fluxo demonstra o impacto da inflamação mediada por células T sobre a actividade de ciclismo 12 HSC.
Combinação de rotulagem magnético e enriquecimento de células da medula óssea expressando c-Kit com classificação celular em cytometr fluxoy permite o isolamento de células progenitoras altamente purificada linhagem hematopoiética e HSCs. As populações de células obtidas podem ser utilizadas em um número de ensaios para estudar a biologia celular (Figura 4), a transdução de sinal (Figura 5), a expressão do gene regulado developmentally e in vitro, bem como no potencial funcional in vivo de subpopulações de células distintas. Na verdade, magneticamente enriquecido c-kit + células foram usadas com sucesso para enxertar não irradiados anfitriões para estudar a variação dinâmica da atividade HSCs ciclismo em estado estacionário e inflamação 14. Em nossas mãos o procedimento descrito aqui permite a recuperação mais eficiente e mais rápida de células da medula óssea do osso lavagem com um rendimento médio de 200.000 células por LKS mouse. O número muito pequeno de HSCs quiescentes que podem ser isoladas a partir de medulas ósseas de dados agregados de vários mouses constitui um limite para abordagens experimentais que requerem mais células. Para obviar a esta limitação, em muitos casos preliminaresestudos podem ser realizados em células mais abundantes LKS prever análises mais focadas e pontuais a serem executadas em CD34 - HSCs quiescentes.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Nobuyuki Onai, Hitoshi Takizawa e Markus Manz para o conselho precioso. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation suíço, suíço Cancer League e Ticinese Fondazione per la Ricerca sul Cancro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Cell Strainer 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| 7-AAD Staining solution | BD Pharmingen | 559925 | |
| Lyse/Fix buffer | BD Pharmingen | 558049 | |
| Perm buffer III | BD Pharmingen | 558050 | |
| Ki-67 | BD Pharmingen | 556026 | |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6.7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| Gr1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| c-Kit (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| Sca-1 (D7) | eBioscience | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| Anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
References
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