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Medicine

प्रतिगामी और सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी इमेजिंग के लिए तैयारी के रूप में परफ्यूज़न माउस कोरोनरी vasculature का भरना

doi: 10.3791/3740 Published: February 10, 2012

Summary

कोरोनरी वाहिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन हृदय रोगों के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ हम एक radiopaque सिलिकॉन रबर (MICROFIL) के साथ सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी इमेजिंग (μCT) के लिए तैयारी में murine कोरोनरी वाहिका संरचना, perfusing के लिए एक विधि का वर्णन.

Protocol

1. शुरू करने से पहले तैयारी

  1. Vasodilator (4mg / एल Papaverine + 1g / एल पीबीएस में एक यौगिक जो न्यूक्लिइक अम्ल से प्राप्त होता है जो शर्करा तथा एडीनाइन से बना होता है, डी - राइबोज) के पीबीएस में या 4% Paraformaldehyde बफर (पीएफए) के साथ दबाव छिड़काव तंत्र के प्रत्येक पक्ष क्रमशः भरें.
  2. 1:100 हेपरिन की 0.1 मिलीग्राम (5000U/ml शेयर) के साथ भरने और ~ 120 डिग्री के कोण पर उठाव के साथ सुई झुकने से एक 1/2cc इंसुलिन सिरिंज (एक स्थायी रूप से संलग्न साढ़े 29G "सुई के साथ) तैयार करो. एक 1 मिलीग्राम (26G साढ़े "सुई के साथ) 0.3 मिलीग्राम संतृप्त KCl समाधान के साथ सिरिंज भर के साथ ही है.

2. दिल उजागर और cannulating महाधमनी

  1. माउस का प्रयोग कर अपने पसंद की संवेदनाहारी चतनाशून्य करना. (हम Ketamine / Xylazine मिश्रण के अधिक मात्रा का उपयोग करें:. आईपी को 130 Ketamine मिलीग्राम / किग्रा और 8.8 मिलीग्राम / किग्रा खारा में Xylazine की इंजेक्शन)
  2. विदारक ट्रे, उदर की ओर उठ पर संवेदनाहृत माउस पिन. एक midline चीरा के साथ उदर गुहा खोलें और त्वचा वापस लेनाके अंगों को बेनकाब. एक तरफ आंतों ले जाएँ लिए पोस्टीरियर रग Cava (पीवीसी) के एक क्षेत्र बेनकाब.
  3. पीवीसी में हेपरिन समाधान को इंजेक्षन. जैसा कि आप सुई निकालने के लिए, एक कपास इत्तला दे दी लीक को रोकने के लिए और कुछ सेकंड के लिए यह पीवीसी दीवार के थक्के और जवानों जब तक पकड़ applicator के साथ सुई के छेद को कवर. हेपरिन के लिए 2-3 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए माउस परिसंचरण भर में फैलाने के लिए.
  4. डायाफ्राम और रिब पिंजरे काटना तो तुम दिल की धड़कन का पालन कर सकते हैं. धीरे से परमवीर चक्र में दिल की गिरफ्तारी तक KCl समाधान इंजेक्षन.
  5. डायाफ्राम और माउस के पीछे भाग आबकारी नीचे सभी अंगों निकालें, डायाफ्राम के क्षेत्र पूर्वकाल बरकरार जा रही है. डायाफ्राम निकालें, डायाफ्राम के पास पीवीसी कटौती तो दिल के लिए समीपस्थ भाग आसान करने के लिए बाद के चरणों में पता लगाने के लिए सावधान किया जा रहा है.
  6. महाधमनी की कटौती अंत का पता लगाएँ. महाधमनी नीचे कुछ पूर्वकाल मिलीमीटर fro 6-0 लट में रेशम सीवन की लंबी लंबाई रखेंमीटर में कटौती इस तरह के अंत है कि सीवन पर ही वापस दोगुनी है. छमाही में यह लंबे समय तक सीवन कटौती ताकि वहाँ महाधमनी के तहत 2 सीवन के टुकड़े कर रहे हैं. महाधमनी (चित्र 1 ए, बी) की कटौती अंत में angiocatheter डालें और एक डबल - गांठ के साथ प्रत्येक सीवन टाई करने के लिए जगह में पकड़ angiocatheter और महाधमनी के भीतर बाहर लीक से किसी भी वापस दबाव को रोकने के.

3. छिड़काव और MICROFIL इंजेक्शन

  1. दबाव छिड़काव उपकरण (चित्र 2) angiocatheter कनेक्ट और 100-110 mmHg के एक ड्राइविंग दबाव के छिड़काव उपकरण पम्पिंग द्वारा वाहिकाविस्फारक बफर (छवि 1C) के साथ जहाजों perfusing शुरू करते हैं. डबल जाँच करें कि बफर coronaries के माध्यम से तरल सुनिश्चित करने के द्वारा perfusing परमवीर चक्र से बाहर निकल रहा है. कम से कम 3 मिनट के लिए छिड़कना जारी रखें या जब तक परमवीर चक्र बाहर निकलने द्रव स्पष्ट है. (अगले कदम के साथ जारी रखें जबकि perfusing.)
  2. पसलियों और पिन (या निकालने के लिए) वापस करने के लिए दिल बेनकाब ribcage के टुकड़े करना. एक बार अवगत कराया, CAनहीं दिल दिल पर बफर लथपथ धुंध का एक टुकड़ा से बफर की बूँदें निचोड़ कर बाहर सूखी reful. महाधमनी चाप बेनकाब दूर थाइमस साफ़. तीन प्रमुख महाधमनी 6-0 लट में रेशम सीवन का उपयोग करने के लिए तरल पदार्थ सुनिश्चित शाखाओं कटी घमनी को बांधना इन बड़े, कम प्रतिरोध वाहिकाओं (चित्र -1) के माध्यम से नहीं बल्कि coronaries के माध्यम से हटाकर है.
  3. 15 मिनट के लिए लगानेवाला साथ दिल छिड़कना, तो कम से कम 2 मिनट के लिए Vasodilation बफर के साथ कुल्ला. इस बीच, दोनों पूर्वकाल रग Cavae कटी घमनी को बांधना इंजेक्शन के बाद दिल (चित्र 1E) के बाहर लीक से MICROFIL को रोकने के लिए. पीवीसी और महाधमनी के चारों ओर जगह sutures, लेकिन भरने के बाद जब तक उन्हें कस नहीं है.
  4. MICROFIL तैयार (के रूप में अभिकर्मकों की तालिका में निर्दिष्ट) और यह एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में लोड. कैथेटर (इतनी के रूप में हवाई बुलबुले की शुरुआत को रोकने के लिए जब छिड़काव टयूबिंग से MICROFIL सिरिंज करने के लिए स्विचन) को कवर करने के लिए पर्याप्त पानी के विच्छेदन ट्रे के साथ भरें. छिड़काव एपी डिस्कनेक्टकैथेटर से paratus और कनेक्ट तैयार MICROFIL सिरिंज.
  5. महाधमनी में MICROFIL को इंजेक्षन तक कोरोनरी धमनियों की अच्छी भरने स्पष्ट है (अंजीर 1F, 3A): धमनियों पहले भरने, और तो MICROFIL के capillaries में MICROFIL के रंग के साथ ऊतक flushes के रूप में फैल जाएगा ". एक बार शिरापरक तरफ, MICROFIL की hydrophobic प्रकृति का कारण बनता है शुरू में स्वतंत्र क्षेत्रों के रूप में प्रकट रूप में यह छोटे जहाजों से उभर. MICROFIL इंजेक्षन जारी रखें जब तक एक सतत स्तंभ नसों भरता है. पूरा भरने स्पष्ट हो जब MICROFIL वाहिकाओं के भीतर निरंतर है, जाएगा और यह परमवीर चक्र के माध्यम से बाहर निकल रहा है.
  6. के बाद भरने पूरा हो गया है, जल्दी sutures कि पहले पीवीसी और महाधमनी के चारों ओर रखा गया जहाजों के बाहर MICROFIL निचोड़ से हृदय ऊतक के लोचदार प्रकृति को रोकने के कस लें.
  7. गीला धुंध साथ दिल कवर (विदारक ट्रे से पानी के साथ भिगो) ने अपने बाहर सुखाने को रोकने के लिए, और यह कमरे के तापमान पर लगभग 1 घंटे के लिए बैठते हैं जब तक MICROFIL polymerized है. Polymerization प्रक्रिया के दौरान किसी भी दिल पर बाहरी उठाने या एक दिल की पीठ में भरा वाहिकाओं के एक प्रारंभिक दृश्य प्राप्त करने की कोशिश में दिल बदल के रूप में, दबाव से बचें. यह दिल का एक अधिक लोचदार क्षेत्र के में कुछ जहाजों से MICROFIL, निचोड़ MICROFIL में टूट के कारण.
  8. दिल निकालें और यह 4% पीएफए ​​में 4 बजे रात परसर्ग डिग्री सेल्सियस तब से 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में स्टोर अब दिल vasculature के μCT इमेजिंग के लिए तैयार है.

4. प्रतिनिधि परिणाम

वेसल्स है जो प्रभावी रूप से MICROFIL द्वारा perfused हैं निरंतर, जहाजों भर में अटूट MICROFIL छवि 3A होगा. आंख द्वारा कोरोनरी वाहिकाओं के भरने की हद तक न्याय किया जा सकता है, नसों epicardially 18 स्थित हैं, और आसानी से देखा जा सकता है (चित्र 3A, नोक), धमनियों,जो अधिक 18 intramyocardial हैं, दिल की सतह (छवि 3A, तीर) के माध्यम से भी दिखाई दे रहे हैं. केशिका भरने स्पष्ट भी है, के रूप में हृदय ऊतक capillaries की एक बहुत ही उच्च घनत्व है, और इसलिए, capillaries के भरण, जब हृदय ऊतक MICROFIL के रंग (छवि 3A, स्टार) के साथ भरा जाएगा. इस प्रकार, किसी भी संवहनी नेटवर्क है कि को भरने में विफल नजर MICROFIL की कमी (छवि 3 बी, सी) के कारण होगा.

Discontinuities MICROFIL (3B अंजीर में तारों) में अक्सर दिखाई देते हैं क्योंकि MICROFIL की hydrophobic प्रकृति ही में अनुबंध और भरा वाहिकाओं के भीतर "टूट" के कारण का कारण होगा. ये "टूट" अगर वाहिकाओं के भीतर दबाव दिल से संवहनी बाहर निकलें अंक की उचित टाई - नापसंद के माध्यम से बनाए रखा है कम किया जा सकता है. अन्य discontinuities MICROFIL भीतर हवा बुलबुले के कारण हो सकता है. हवा की शुरूआत को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि angiocatheter पूरी तरह से पानी में डूबे हुए है जब छिड़काव एपी से स्विचन MICROFIL सिरिंज paratus. यदि एक हवाई बुलबुले शुरू की है, यह अक्सर बस MICROFIL छिड़काव जारी जब तक बुलबुले के माध्यम से धकेल दिया गया है और कोरोनरी वाहिकाओं के द्वारा कर सकते हैं हटाया जा.

संवहनी नेटवर्क पूरी तरह से नहीं भर अगर संवहनी बिस्तर के एक हिस्से को अवरुद्ध है (छवि 3B, तीर) हो सकता है. जबकि हेपरिन रक्त के थक्के के गठन रोकता है, कभी कभी रुकावटें अभी भी अधूरा हेपरिन प्रक्रिया, या अन्य अज्ञात कारणों की वजह से शुरुआत करने के लिए पूर्व छिड़काव करने के लिए कारण हो सकता है. यदि कोई रुकावट होती है, हमारे ज्ञान करने के लिए,, रुकावट dislodging संवहनी भरने को पूरा करने के लिए के लिए कोई तरीका है. अधूरा भरने भी अगर बहुत कम दबाव भरने, के रूप में MICROFIL सभी संवहनी बेड और केशिका नेटवर्क (छवि -3 सी) में मजबूर नहीं किया जाएगा के दौरान प्रयोग किया जाता है परिणाम कर सकते हैं. इसके विपरीत, बहुत अधिक दबाव capillaries के फट करने के लिए और आसपास के ऊतकों में MICROFIL बहना (छवि 3 डी) पैदा कर सकता है.

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आकृति 1. MICROFIL छिड़काव योजना का अवलोकन. (ए) महाधमनी और पीवीसी लगभग डायाफ्राम के स्तर पर कटौती कर रहे हैं. (बी) आरोही महाधमनी angiocatheter के के साथ cannulated है. (सी) Vasodilation बफर वाहिकाओं दबाव छिड़काव उपकरण (चित्र नहीं) द्वारा संचालित, के माध्यम से perfused है, जबकि (डी) महाधमनी चाप बंद तीन मुख्य शाखाओं ligated कर रहे हैं. (ई) 4% पीएफए ​​coronaries के माध्यम से से perfused है जबकि दोनों पूर्वकाल रग cavas ligated कर रहे हैं. (एफ) एक सिरिंज का प्रयोग, MICROFIL coronaries के माध्यम से से perfused है जब तक यह परमवीर चक्र से बाहर निकलने में मनाया जाता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. छिड़काव उपकरण Erlenmeyer दो बोतल, प्रत्येक या तो Vasodilation बफर या 4% पीएफए ​​के साथ भरा. में शामिल हो गए और उनके sidearms से जुड़े ट्यूब के माध्यम से दबाव. प्रणाली की पम्पिंग पुस्तिका के माध्यम से दबाव हैबल्ब, और एक दबाव गेज एक बोतल के लिए जुड़ा हुआ है के लिए दबाव की निगरानी और रखरखाव की अनुमति. छोटे ट्यूब रबड़ stoppers के माध्यम से और नीचे प्रत्येक फ्लास्क में तरल पदार्थ में विस्तार. इन छोटे ट्यूब के बाहर प्रत्येक कुप्पी से sidearms द्रव पंप से दबाव में प्रवेश. ट्यूब तो पानी निकलने की टोंटी जो केवल तरल पदार्थ की अनुमति देता है एक समय में एक कुप्पी से प्रवाह में विलय.

चित्रा 3
चित्रा 3. Microfilled दिल नमूना. (ए) वेसल्स है कि अच्छी तरह से भर रहे हैं कुछ है (यदि कोई हो) MICROFIL में टूट जाएगा, और हृदय के ऊतकों रंग MICROFIL रंग भर के capillaries (स्टार, और सी के साथ तुलना) के कारण होगा. दोनों (तीर - वाम पूर्वकाल अवरोही धमनी) धमनियों और शिराओं (नोक - वाम कोरोनरी नस) के दिल की सतह के माध्यम से दिखाई दे रहे हैं. (बी) MICROFIL में विराम (तारांकन) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कुछ वाहिकाओं में रुकावटों के साथ एक दिल है कि पूरी Mic रोकाप्रवेश rofil. अवरुद्ध जहाजों लाल (तीर) रहते हैं, के रूप में रक्त छिड़काव की प्रक्रिया के दौरान बाहर प्लावित नहीं किया गया था. (सी) वाहिकाओं कि अधूरे भरा गया है के साथ एक दिल. नोटिस ऊतक MICROFIL के पीले रंग पर नहीं लिया गया है, यह दर्शाता है MICROFIL के capillaries में नहीं घुसना था. (डी) एक दिल जहां भरने MICROFIL आसपास के ऊतकों (तीर) में रिसाव के कारण के दौरान capillaries के फट.

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Discussion

हृदय ऊतक के एक बहुत ही उच्च चयापचय की मांग है, और इसलिए कोरोनरी vasculature के द्वारा दिया खून से पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की लगातार आपूर्ति की आवश्यकता है. कोरोनरी वाहिकाओं, जो कोरोनरी पोत एक प्रकार का रोग और रुकावट के कारण समारोह में कमी के रोग ऊतक हाइपोक्सिया और ischemia के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और myocardial infarction और हृदय की मांसपेशियों को अपूरणीय क्षति के लिए जोखिम पर प्रभावित रोगियों डाल. इन जहाजों के रोगग्रस्त राज्य की एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक है, और हमारे कोरोनरी वाहिकाओं का अध्ययन करने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है vasculature की दृश्य है. यहाँ, हम पूर्व vivo इमेजिंग के लिए एक radiopaque सामग्री के साथ vasculature को भरने के द्वारा murine कोरोनरी वाहिका संरचना तैयार करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से पूरा भरने, और capillaries के सहित सभी कोरोनरी वाहिकाओं के बाद दृश्य सुनिश्चित करने के लिए डिजाइन किया गया था.

सभी capillaries के पूरा भरने, भरने एजेंसियों को सुनिश्चित करने केटी, MICROFIL, एक आंशिक रूप से बंद प्रणाली है कि छोटे, उच्च संवहनी नेटवर्क के भीतर प्रतिरोध वाहिकाओं में MICROFIL मजबूर करेंगे में अंतःक्षिप्त किया जाना चाहिए. हमारे भीतर प्रणाली भरने vivo में इस आंशिक बंद बनाने के लिए, हम तीन बड़े, कम प्रतिरोध महाधमनी चाप से शाखाओं में बंटी धमनियों कटी घमनी को बांधना. हालांकि यह अन्य सभी संभावित रिसाव "कहते हैं, शेष वाहिकाओं (मुख्य पसलियों के बीच धमनियों) को अलग नहीं करता है पर्याप्त छोटा है कि किसी भी दबाव के माध्यम से उन्हें खो दिया कोरोनरी संवहनी प्रणाली की पूरी भरने के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. एक बार MICROFIL दिल में सभी जहाजों perfused है, हृदय और संवहनी ऊतक के जन्मजात लोचदार प्रकृति कुछ वाहिकाओं के MICROFIL बाहर निचोड़ जाएगा. MICROFIL के इस नुकसान को रोकने के लिए, हम सभी बड़े और पहुंच के बाहर निकलें अंक, अर्थात्, दोनों बेहतर रग cavae, पीछे रग Cava, और महाधमनी के बाद कोरोनरी vasculature को पूरी तरह से perfused है कटी घमनी को बांधना. इस तरह, दबाव मीटर हैदिल में जब तक MICROFIL aintained polymerizes, MICROFIL सामान्य शारीरिक रक्तचाप के तहत पोत संरचना के अनुरूप करने के लिए अनुमति देता है.

वैकल्पिक रूप से, अगर capillaries के दृश्य की आवश्यकता नहीं है, यह भी संभव है केवल धमनी या केवल शिरापरक संवहनी बेड को भरने. MICROFIL के अधिक चिपचिपा संस्करणों एक उच्च चिपचिपापन मंदक (FlowTech से उपलब्ध) का उपयोग कर मिलाया जा सकता है. अधिक चिपचिपा perfusate के capillaries के घुसना करने में असमर्थ है, और इसलिए केवल धमनियों, या केवल नसों के दृश्य की अनुमति देता है यदि शिरापरक ओर से perfused. इसके अलावा, प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत आसानी से अन्य प्रजाति या गैर वयस्क चूहों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उचित जानवर के आकार मैच प्रक्रिया स्केलिंग बस आवश्यकता है कि कैथेटर और छिड़काव टयूबिंग ठीक पशु महाधमनी के आकार के होते हैं के रूप में इतना लीक को कम करने के लिए और खींच या तोड़ने को रोकने. तरल पदार्थ की मात्रा इंजेक्शन (यानी हेपरिन,संतृप्त KCl और MICROFIL) के भी उचित बढ़ाया जाना चाहिए.

हमारे प्रोटोकॉल MICROFIL और इमेजिंग μCT द्वारा इंजेक्शन के लिए विशेष रूप से डिजाइन किया गया था, तथापि, यह आसानी से अन्य भरने एजेंट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, या तो μCT विश्लेषण, या अन्य पूर्व vivo इमेजिंग तकनीक के लिए. जब μCT संगत fillers के लिए देख रहे हैं, कई पदार्थ के रूप में भरने और अन्य तरीकों इमेजिंग (जैसे ऐक्रेलिक) के माध्यम से वाहिका संरचना का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया वहाँ radiopaque रंगों के कई विकल्प हैं, रेडियो एक का नेतृत्व 9 वर्णक या एक आज़मियम समाधान के रूप में अपारदर्शी सामग्री, के साथ संचार किया जा सकता है 3. भरने उपयोग एजेंट के बावजूद, μCT इमेजिंग लाभ यह है कि परिणाम एक 3D मॉडल में संवहनी माप उपलब्ध कराने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भरा कोरोनरी 6,7,14,19 जहाजों की शाखाओं में बंटी पैटर्न के बारे में जानकारी संरचनात्मक खंगाला जा सकता है प्रदान करता है. इसके अलावा, μCT द्वारा इमेजिंग आसपास के ऊतकों को बरकरार रखता है, इस प्रकार की अनुमति के अतिरिक्त एक के लिएस्कैन के बाद alyses. इस प्रकार, भरा और स्कैन दिल ऊतकीय विश्लेषण के लिए संसाधित किया जा सकता है, और विभिन्न मार्करों के लिए दाग वर्गों μCT डेटा के साथ गठबंधन किया जा सकता है धमनी / शिरापरक पहचान, चिकनी मांसपेशी कोट की उपस्थिति, या अतिरिक्त ऊतकीय सूचकांक सहसंबंधी.

अन्य आम संवहनी इमेजिंग तकनीक भी संवहनी भरने की आवश्यकता होती है और हमारे प्रोटोकॉल आसानी से इन अन्य भरने एजेंट में से किसी के साथ perfusing coronaries के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) वाहिकाओं भरने और फिर मुलायम ऊतकों की स्थापना की प्रक्रिया में संवहनी डाली जंग कास्टिंग कहा जाता है से दूर भंग करने की आवश्यकता है. आदेश में आसपास के कोमल ऊतक के समर्थन के बिना बर्तन के आकार को बनाए रखने के लिए, भरने एजेंट मजबूत और गैर - भंगुर होना चाहिए: अक्सर एक ऐक्रेलिक राल (जैसे Mercox, Batson) 3,20,21. जबकि SEM के स्कैनिंग बेहद μCT 22 इमेजिंग की है कि बेहतर संकल्प, जंग डाली प्रदान करता हैआईएनजी प्रक्रिया के ऊतकों को नष्ट कर देता है, किसी भी अतिरिक्त ऊतक विश्लेषण को रोकने. पूर्व कोरोनरी vasculature की vivo इमेजिंग, ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी (ऑप्ट), का एक अन्य विधि दृश्य या निकट दृश्य प्रकाश का पता लगाने, और कर सकते हैं, इस प्रकार वर्णजनीय करने के लिए इसके अलावा में फ्लोरोसेंट संकेत का पता लगाने के लिए अनुमति देता है बैंगनी alkaline फॉस्फेट द्वारा उत्पादित वेग के रूप में precipitates रूपांतरण की BCIP / एनबीटी (5 ब्रोमो - 4 क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl phosphate/4-nitro नीला tetrazolium) के 23-25. जहाजों के विज़ुअलाइज़ेशन, इसलिए, एक फ्लोरोसेंट पदार्थ (जैसे PU4ii: एक polyurethane 3 राल, या fluorescein dextran संचार 26) के साथ भरने के द्वारा भी पूरा कर सकते हैं, या के माध्यम से गैर भरने पूरे आरोह immunodetection रूप में भी प्रतिदीप्ति या एक के माध्यम से, तरीकों Histochemical वर्णजनीय वेग (जैसे BCIP / एनबीटी) 23. ऑप्ट इमेजिंग कि μCT (लगभग 1 माइक्रोन) की तुलना में थोड़ा बेहतर प्रस्तावों को प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन, भरने और immunodete दोनों के लिएction के तरीकों आसपास के कोमल ऊतक रासायनिक सकता है, मंजूरी दे दी है जो की histological विश्लेषण के बाद स्कैनिंग के लिए कुछ एंटीजन को बाधित कर सकते हैं.

वहाँ भी कर रहे हैं कि नाड़ी भरने या immunodetection की आवश्यकता नहीं है कोरोनरी vasculature के इमेजिंग के लिए कई तरीके हैं, और के रूप में vivo में इस तरह किया जा सकता है. एक तकनीक है, इसके विपरीत बढ़ी उच्च संकल्प अल्ट्रासाउंड (CEHRUS) के एक विपरीत एजेंट के रूप में गैस भरा microbubbles का इस्तेमाल करता है. इन microbubbles के रक्त प्रवाह में इंजेक्शन वास्तविक समय प्रवाह माप के साथ रक्त के प्रवाह केशिका स्तर नीचे के दृश्य के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह छवि 2,27-31 वाहिकाओं के एक 3D दृश्य प्रदान नहीं करता है. एक अन्य विधि, चुंबकीय अनुनाद एंजियोग्राफी (MRA) भी छवि कोरोनरी 32-34 जहाजों, और MRA में हाल के अग्रिमों के लिए इस्तेमाल किया गया है इमेजिंग क्षमताओं को बढ़ाया है वास्तविक समय रक्त के प्रवाह माप 35,36 प्राप्त है. जबकि MRA ve के 3D पुनर्निर्माण का उत्पादन कर सकते हैंssels छवि, MRA की संकल्प वर्तमान में करीब 100 microns करने के लिए सीमित है, और इसलिए छोटे जहाजों (arterioles capillaries के, और venules) के पहचान करने में विफल रहता है.

चूंकि दोनों CEHRUS और MRA जीवित जानवरों पर किया जा सकता है, वे बार बार और गैर invasively निगरानी रक्त प्रवाह और संवहनी विकास का लाभ प्रदान करते हैं. हालांकि, MRA की अपेक्षाकृत कम संकल्प और CEHRUS से 3 डी क्षमताओं की कमी के एक पूरे के रूप में कोरोनरी नेटवर्क की इमेजिंग रोकना. इस प्रकार, पूर्व vivo इमेजिंग तकनीक है जो संवहनी भरने एजेंट या immunodetection के की आवश्यकता होती है उच्च संकल्प 3 डी कोरोनरी संवहनी प्रणाली की जानकारी प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, जबकि vivo में तकनीक में कार्यक्षमता के बारे में समय के साथ संवहनी नेटवर्क की बहुमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं (यानी, प्रवाह डेटा) . अंत बिंदु पूर्व vivo इमेजिंग के साथ vivo में समय बेशक विश्लेषण में संयोजन के के कोरोनरी वाहिका संरचना के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करता है.

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Disclosures

चूहे संस्थागत पशु और वाशिंगटन विश्वविद्यालय के प्रयोग समिति देखभाल और देखभाल और पशु प्रयोगशाला का प्रयोग अमेरिकी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH प्रकाशन 85-23 नंबर के द्वारा प्रकाशित के लिए गाइड के साथ अनुसार अनुमोदित विधियों के साथ संभाल रहे थे, 1996 संशोधित).

Acknowledgments

हम प्रोटोकॉल, डॉ. माइकल सिमंस, डा. रात बिताने का स्थान Hauch के, और सामान्य चर्चा के लिए उनके प्रयोगशालाओं में दोनों के सदस्यों के प्रारंभिक परीक्षणों के लिए धन्यवाद डॉ. केली स्टीवंस.

इस काम एनआईएच HL087513 और HL094374 P01 अनुदान द्वारा समर्थन है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringes BD Biosciences BD-309602
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles BD Biosciences BD-309306
2" x 2" Gauze pads Med101store.com SKU 2208
24G ¾" Angiocath IV catheter BD Biosciences BD-381112
26G ½"gauge needles BD Biosciences BD-305111
Adenosine Sigma-Aldrich A9251 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps Fine Science Tools 11052-10
Cotton-tipped applicators: 6" non-sterile Cardinal Health C15055-006
Curved Surgical Scissors Fine Science Tools 14085-09
Dissecting stereoscope and light source Nikon Instruments NA NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches Cole-Parmer YO-10915-12 Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps Aesculap FD281R Need two
Heparin, 5000 U/ml stock APP Pharmaceuticals NDC 63323-047-10 1:100 dilution in water
KCl Fisher Scientific P217 Saturated solution in H2O
Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil FlowTech MV-122 (yellow). Other color options are also available. Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk Harvard Apparatus 723287
Papaverine American Regent Inc. NDC 0517-4010-01 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus See figure 2
Spring Scissors Fine Science Tools 15018-10
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock Lloyd, Inc. NADA #139-236 Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline

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References

  1. Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
  2. Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
  3. Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
  4. Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
  5. Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
  6. Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
  7. Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
  8. Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
  9. Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
  10. Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
  11. Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
  12. Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
  13. Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
  14. Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
  15. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
  16. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  17. Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
  18. Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
  19. Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
  20. Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts--technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
  21. Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
  22. Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
  23. Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
  24. Quintana, L., Sharpe, J. Optical projection tomography of vertebrate embryo development. Cold Spring Protoc. 586-594 (2011).
  25. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
  26. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
  27. Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
  28. Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
  29. Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
  30. Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
  31. Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
  32. Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
  33. Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
  34. Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
  35. Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
  36. Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. 254-441 (2010).
प्रतिगामी और सूक्ष्म गणना टोमोग्राफी इमेजिंग के लिए तैयारी के रूप में परफ्यूज़न माउस कोरोनरी vasculature का भरना
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Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, Jr., W. M. Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3740, doi:10.3791/3740 (2012).More

Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, Jr., W. M. Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3740, doi:10.3791/3740 (2012).

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