Summary
Visualização dos vasos coronários é fundamental para avançar na compreensão das doenças cardiovasculares. Descrevemos aqui um método para a perfusão vasculatura coronária murino com uma borracha de silicone radiopaco (Microfil), em preparação para imagiologia Tomografia micro-computadorizada (μCT).
Abstract
Visualização da vasculatura está se tornando cada vez mais importante para compreender muitos estados diferentes da doença. Enquanto existem várias técnicas para geração de imagens vasculatura, poucos são capazes de visualizar a rede vascular como um todo, enquanto se estende a uma resolução que inclui o menor 1,2 navios. Além disso, muitas técnicas de fundição vasculares destruir o tecido circundante, impedindo posterior análise da amostra 3-5. Um método que contorna essas questões é micro-tomografia computadorizada (μCT). μCT imagem pode digitalizar com resoluções menos de 10 mícrons, é capaz de produzir reconstruções 3D da rede vascular, e deixa o tecido intacto para posterior análise (por exemplo, histologia e morfometria) 6-11. Contudo, os navios de imagem por métodos ex vivo μCT exige que os navios ser preenchido com um composto radiopaco. Como tal, a representação precisa da vasculatura produzido por μCT imagem está dependenterecheio fiável e completa dos vasos. Neste protocolo, descrevem uma técnica para encher vasos coronarianos de rato em preparação para a imagem μCT.
Duas técnicas predominam existem para o enchimento da vasculatura coronária: in vivo através de canulação e retrógrada de perfusão da aorta (ou uma ramificação fora do arco aórtico) 12-14, ou ex vivo através de uma perfusão de Langendorff 15-17 sistema. Aqui nós descrevemos um método in vivo canulação aórtica, que foi projetado especificamente para garantir o preenchimento de todos os navios. Usamos um composto radiopaco de baixa viscosidade que pode chamado Microfil perfundir através dos navios mais pequenos para preencher todos os capilares, assim como ambos os lados arteriais e venosas da rede vascular. Os vasos são perfundidos com tampão utilizando um sistema de perfusão pressurizado e, em seguida cheio com Microfil. Para garantir que Microfil enche os pequenos vasos de maior resistência, nós ligadura dos ramos grandes emanating da aorta, que desvia a Microfil nas coronárias. Uma vez que o enchimento é completa, para evitar que a natureza elástica do tecido cardíaco de espremer Microfil fora de alguns vasos, nós ligadura acessíveis principais pontos de saída vasculares imediatamente após o enchimento. Portanto, a nossa técnica é otimizado para o preenchimento completo e máximo de retenção do agente de enchimento, permitindo a visualização da rede vascular coronária completa - artérias, capilares e veias iguais.
Protocol
1. Os preparativos antes do início
- Encha cada lado do aparelho de perfusão com tampão de pressão vasodilatador (4mg / L Papaverina + 1 g / L adenosina em PBS) ou paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS, respectivamente.
- Prepara-se uma seringa de insulina 1/2cc (com um 29G permanentemente ligado ½ "agulha), enchendo-a com 0,1 ml de 1:100 Heparina (estoque 5000U/ml) e dobrando a agulha para ~ ângulo de 120 graus com o bisel para cima. Fazer o mesmo com uma seringa de 1 ml (com uma agulha de 26G ½ ") cheio com 0,3 ml de solução saturada de KCl.
2. A exposição do coração e da canulação da aorta
- Anestesiar o rato usando o anestésico de escolha. (Usamos uma overdose de uma mistura Cetamina / Xilazina:. Injecção IP de 130 mg de cetamina / kg e 8,8 Xilazina mg / kg em solução salina)
- Pin o rato anestesiado no tabuleiro de dissecação, acima do lado ventral. Abra a cavidade abdominal por uma incisão na linha média e retrair a pelepara expor os órgãos. Mover os intestinos para um lado para expor uma região de veia cava posterior (PVC).
- Injectar solução de heparina para o PVC. Como você extrair a agulha, cobrir o buraco da agulha com um aplicador com ponta de algodão para evitar vazamentos e mantenha-o por alguns segundos até que os coágulos de PVC de parede e vedações. Espere 2-3 minutos para a heparina para dispersar através da circulação do rato.
- Dissecar o diafragma e caixa torácica para que você possa observar o coração batendo. Lentamente injetar solução de KCl no PVC até as prisões do coração.
- Remova todos os órgãos abaixo do diafragma e impostos especiais de consumo a parte posterior do mouse, deixando a região anterior do diafragma intacta. Remover o diafragma, tomando cuidado para cortar o PVC perto do diafragma para que a porção proximal para o coração é fácil de localizar em passos subsequentes.
- Localizar a extremidade cortada da aorta. Coloque uma longa duração de 6-0 fio de seda trançada debaixo da aorta alguns milímetros anteriores from da extremidade cortada de tal modo que a sutura é dobrada para trás sobre si mesmo. Corte este tempo de sutura na metade de forma que há 2 pedaços de sutura sob a aorta. Inserir o angiocateter para dentro da extremidade de corte da aorta (Fig. 1A, B) e amarrá cada sutura com um duplo nó para segurar o angiocateter no lugar e evitar qualquer contra-pressão no interior da aorta de vazar para fora.
3. Perfusão e injeção Microfil
- Ligue o angiocateter para o aparelho de perfusão de pressão (Fig. 2) e começar a perfusão dos vasos com tampão de vasodilatador (Fig. 1C) por bombagem do aparelho de perfusão a uma pressão de condução de 100-110 mmHg. Verifique que o buffer está irrigando através das coronárias, assegurando líquido está saindo do PVC. Continuar para perfundir durante pelo menos 3 minutos ou até que o fluido que sai do PVC é clara. (Continue com os passos seguintes enquanto perfusão).
- Dissecar as costelas e costas pino (ou remover) a caixa torácica para expor o coração. Uma vez exposta, seja careful para não deixar o coração secar por espremedura gotas de tampão para o coração de um pedaço de tampão-embebida de gaze. Limpar o timo para expor o arco aórtico. Ligadura dos três principais ramos da aorta, utilizando fio de seda trançado 6-0 para garantir o fluido é desviado através das coronárias, em vez de através dessas embarcações maiores, de baixa resistência (Fig. 1D).
- Perfundir o coração com fixador durante 15 minutos, em seguida, lavar com tampão de vasodilatação durante pelo menos 2 minutos. Enquanto isso, ligadura tanto Anterior veias cavas para evitar Microfil vaze para fora do coração após a injeção (Fig 1E). Suturas em volta da PVC e da aorta, mas não aperte-os até que após o enchimento.
- Preparar o Microfil (tal como especificado na tabela de reagentes) e carregá-lo para uma seringa de 1 ml. Encher o tabuleiro de dissecção com água suficiente para cobrir o cateter (de modo a evitar a introdução de bolhas de ar quando se muda de tubagem de perfusão para a seringa Microfil). Desligue a perfusão apParatus a partir do cateter e ligar a seringa Microfil preparada.
- Injectar a Microfil para a aorta até bom enchimento das artérias coronárias é evidente (Figs 1F, 3A): as artérias vai encher primeiro, e depois o Microfil irá "derramar" para os capilares como as ondas de tecido com a cor do Microfil. Uma vez no lado venoso, a natureza hidrofóbica do Microfil faz com que ele aparecem inicialmente como esferas independentes que emerge a partir dos vasos pequenos. Continue a injectar a Microfil até uma coluna contínua enche as veias. Enchimento completo será evidente quando o Microfil é contínuo dentro dos vasos, e saem através do PVC.
- Após o enchimento está completa, rapidamente apertar as suturas que foram previamente colocadas em torno do PVC e aorta para evitar que a natureza elástica do tecido cardíaco de espremer o Microfil para fora dos vasos.
- Cobrir o coração com gaze húmida (embebido em água a partir da bandeja de dissecação) Para evitar a sua secagem para fora, e deixar repousar durante aproximadamente 1 hora à temperatura ambiente até que a Microfil tem polimerizado. Evitar quaisquer pressões externas sobre o coração durante o processo de polimerização, tais como elevação ou rodando o coração, numa tentativa de obter uma vista precoce dos vasos cheios na parte de trás do coração. Isto pode apertar Microfil a partir de alguns vasos para uma área mais elástica do coração, causando quebras na Microfil.
- Retire o coração e pós-consertá-lo em PFA 4% durante a noite a 4 ° C. Em seguida, armazenar em etanol a 70%, a 4 ° C. A vasculatura coração está agora pronto para imagiologia μCT.
4. Os resultados representativos
Vasos que são efectivamente perfundidos por Microfil terá Microfil, contínua ininterrupta ao longo dos vasos (Fig. 3A). O grau de enchimento dos vasos coronários pode ser julgada pelo olho; veias são epicardially situado a 18, e pode ser facilmente observado (Figura 3A, ponta de seta), artérias,que são mais intramiocárdica 18, são também visíveis através da superfície do coração (Fig. 3A, seta). Enchimento capilar é também evidente, como o tecido cardíaco tem uma densidade muito elevada de capilares, e portanto, quando o preenchimento capilares, o tecido cardíaco irá limpar com a cor do Microfil (Fig. 3A, estrela). Assim, todas as redes vasculares que falharam para encher será perceptível devido à falta de Microfil (Fig. 3B, C).
Descontinuidades na Microfil (asteriscos na Figura 3B), muitas vezes aparecem porque a natureza hidrofóbica da Microfil fará com que ele contraia em si mesmo e fazer com que "quebra" dentro de vasos cheios. Estes "quebra" pode ser reduzida se a pressão dentro dos vasos é mantida através de adequada tie-offs dos pontos de saída vasculares do coração. Outros descontinuidades pode ser causada por bolhas de ar no interior da Microfil. Para evitar a introdução de ar, verifique se o angiocateter está totalmente submerso na água quando se muda da perfusão ap Paratus à seringa Microfil. Se uma bolha de ar é introduzida, que muitas vezes podem ser removidos de forma simples, continuando a perfusão Microfil até que a bolha foi empurrada através e para fora dos vasos coronários.
Redes vasculares podem não encher completamente se uma porção do leito vascular é bloqueado (Fig. 3B, seta). Enquanto Heparina inibe a formação de coágulos sanguíneos, bloqueios ocasionais pode ainda ocorrer devido à perfusão Heparina incompleta antes de se iniciar o processo, ou devido a outros factores desconhecidos. Se ocorre um bloqueio, não existe, a nosso conhecimento, nenhum método para desalojar o bloqueio para completar o enchimento vascular. Enchimento incompleto pode também resultar se a pressão muito pouco é utilizado durante o enchimento, como a Microfil não será forçado em todos os leitos vasculares e as redes de capilares (Fig. 3C). Inversamente, a pressão em excesso pode causar a capilares para rebentar e extravasamento Microfil para o tecido circundante (Fig. 3D).
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Figura 1. Visão geral do sistema de perfusão Microfil. (A) A aorta eo PVC são cortadas a aproximadamente o nível do diafragma. (B) da aorta ascendente é canulada com um angiocateter. (C) tampão Vasodilatação é perfundido através dos vasos, impulsionadas pelo aparelho pressão de perfusão (não ilustrado), enquanto (D) os três principais ramos fora do arco aórtico são ligadas. (E) PFA a 4% é perfundido através das coronárias, enquanto ambas as Cavas Anterior Veia são ligados. (F) utilizando uma seringa, a Microfil é perfundido através das coronárias até que seja observado que sai do PVC.
Figura 2. Aparelho de perfusão. Dois balões de Erlenmeyer, cada um preenchido com um tampão de vasodilatação ou 4% PFA, são unidas e pressurizado através de tubos ligados às suas sidearms. O sistema é pressurizado por meio de bombeamento manual dobolbo, e um medidor de pressão está ligada a um dos frascos para permitir o controlo e manutenção da pressão. Pequenos tubos estendem-se através rolhas de borracha e para baixo para dentro do fluido em cada frasco. Pressão de entrada das bombas armas brancas o fluido de cada balão para fora estes tubos de menor diâmetro. Os tubos então fundir a uma torneira de passagem que apenas permite que o fluido flua a partir de um balão de cada vez.
Figura 3. Experimente corações microparticulada. (A) Os navios que são preenchidos bem terá poucos (se houver) quebras na Microfil, eo tecido do coração será cor matizada do Microfil devido aos capilares cheios (estrela, e comparar com C). Ambas as artérias (seta - artéria descendente anterior esquerda) e veias (ponta de seta - Veia coronária esquerda) são visíveis através da superfície do coração. (B) Um coração com quebras na Microfil (asteriscos), bem como os bloqueios em alguns vasos que impedia Mic completarofil penetração. Os vasos bloqueados permanecem vermelho (seta), tal como o sangue não foi purgada durante o processo de perfusão. (C) Um coração com os vasos que foram preenchidos de forma incompleta. Note o tecido não foi tomada sobre a cor amarela da Microfil, indicando a Microfil não penetrar na capilares. (D) Um coração onde o rebentamento de capilares durante o enchimento, fazendo com que o Microfil a vazar para o tecido circundante (seta).
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Discussion
Tecido cardíaco tem uma procura muito elevada metabólica, e, portanto, requer um fornecimento constante de nutrientes e oxigénio a partir do sangue entregue pela vasculatura coronária. Doenças dos vasos coronários, que diminuem a função coronária devido a estenose do vaso e bloqueio, podem levar à hipóxia tecidual e isquemia, e colocar em risco pacientes acometidos de infarto do miocárdio e um dano irreparável ao músculo do coração. Uma melhor compreensão do estado de doença destes navios é necessário e fundamental para nossa capacidade de estudar os vasos coronários é a visualização da vasculatura. Aqui, nós apresentamos um método para a preparação da vasculatura coronária murino por ex imagem in vivo, preenchendo a vasculatura com um material radiopaco. Este protocolo foi projetado especificamente para assegurar enchimento completo e, posteriormente, visualização de todos os vasos coronários, incluindo capilares.
Para garantir o enchimento completo de todos os capilares, o agen enchimentot, a Microfil, deve ser injetado em um sistema parcialmente fechado que vai forçar a Microfil para os menores, os vasos de maior resistência dentro da rede vascular. Para criar este encerramento parcial dentro da nossa in vivo sistema de enchimento de, nós ligadura os três maiores, artérias de baixa resistência de ramificação do arco aórtico. Enquanto isso não exclui todos os outros potenciais pontos de "vazamento" e os restantes navios (principalmente as artérias intercostais) são suficientemente pequenas que qualquer pressão perdido através deles não interfere com enchimento completo do sistema vascular coronariana. Uma vez que a Microfil foi perfundido todos os vasos do coração, a natureza inata elástica do tecido cardíaco e vascular vai apertar a Microfil fora de alguns vasos. Para evitar esta perda de Microfil, nós ligadura todos os pontos de saída grandes e acessíveis, isto é, tanto veias cavas superior, a veia cava posterior, ea aorta, após a vasculatura coronária está completamente perfundidos. Deste modo, a pressão é maintained no coração até que a Microfil polimeriza, permitindo que o Microfil para estar em conformidade com a estrutura recipiente sob pressão sanguínea fisiológico normal.
Alternativamente, se a visualização dos capilares não é necessário, também é possível encher apenas os leitos arteriais ou apenas venosa o vasculares. Versões mais viscosas de Microfil podem ser misturados usando um diluente de alta viscosidade (disponível a partir de FlowTech). O perfusato mais viscoso é incapaz de penetrar os capilares, e, portanto, permite a visualização de apenas as artérias, ou apenas as veias se perfundido a partir do lado venoso. Além disso, o protocolo aqui apresentadas podem ser facilmente adaptados a outras espécies ou não-adulto ratinhos. Escala o procedimento para apropriadamente coincidir com o tamanho do animal simplesmente requer que o cateter ea tubagem de perfusão são adequadamente dimensionado para aorta do animal, de modo a minimizar vazamento e prevenir o alongamento ou de ruptura. Os volumes de fluidos injectado (isto é, a heparina,KCl saturado, ea Microfil) deve também ser adequadamente dimensionado.
O protocolo foi especificamente concebido para a injecção de Microfil e imagiologia por μCT, no entanto, ele pode ser facilmente adaptada para outros agentes de enchimento, quer para a análise μCT, ou outros ex técnicas de imagem in vivo. Ao procurar μCT enchimentos compatíveis, existem várias opções de corantes radiopacas, como muitas substâncias utilizadas para o enchimento e estudar vasculatura via outros métodos de imagem (por exemplo acrílico) pode ser infundida com material rádio opaco, tal como um pigmento de chumbo 9 ou uma solução de ósmio 3. Independentemente do agente de enchimento utilizado, μCT imagiologia oferece a vantagem de que os resultados podem ser reconstruídos em um modelo 3D para proporcionar medições vasculares, bem como informação estrutural sobre o padrão de ramificação dos vasos coronários cheias 6,7,14,19. Além disso, imagiologia por μCT preserva o tecido circundante, permitindo assim um adicionalalyses após o exame. Assim, os corações cheios e digitalizados podem ser processadas para análise histológica, e as secções coradas para vários marcadores podem ser alinhados com os dados μCT para correlacionar identidade arterial / venosa, a presença de camadas musculares lisas, ou adicionais índices histológicos.
Outros comuns técnicas de imagiologia vascular também requerem enchimento vascular e nosso protocolo pode ser facilmente adaptado para a perfusão das coronárias com qualquer um destes outros agentes de enchimento. Microscopia Electrónica de Varrimento (SEM) requer enchimento dos vasos e, em seguida, dissolvendo o tecido mole para longe do molde vascular estabelecida em um processo chamado de fundição corrosão. A fim de manter a forma dos vasos sem o apoio do tecido circundante macio, o agente de enchimento tem de ser forte e não-friável: frequentemente resina acrílica um (por exemplo, Mercox, Batson) 3,20,21. Enquanto SEM fornece soluções de digitalização muito superiores ao de μCT imagem 22, o elenco corrosãoprocedimento ing destrói o tecido, impedindo qualquer análise tecido adicional. Outro método de imagiologia ex vivo da vasculatura coronária, a Tomografia de projecção óptico (TPO), pode detectar a luz visível ou próximo do visível, e permite, assim, para a detecção de sinais fluorescentes para além cromogénico precipitados, tais como o precipitado púrpura produzido por fosfatase alcalina conversão de BCIP / NBT (5-bromo-4-cloro-3-indolil phosphate/4-nitro azul de tetrazólio) 23-25. Visualização dos vasos, portanto, pode ser realizado tanto por enchimento com uma substância fluorescente (eg PU4ii: uma resina de poliuretano 3, ou fluoresceína infundido dextrano 26), ou através de não-enchimento, tais como métodos de montagem inteira imunodetecção, quer através de fluorescência ou um precipitado cromogénico histoquímica (por exemplo, BCIP / NBT) 23. OPT imagem pode alcançar resoluções ligeiramente melhores do que a de μCT (para cerca de 1 micron), no entanto, tanto para o enchimento eo immunodetemétodos ction do tecido mole ao redor deve ser quimicamente limpos, o que pode perturbar alguns antígenos para análise histológica pós-digitalização.
Existem também vários métodos para imagiologia da vasculatura coronária, que não requerem enchimento vascular ou imunodetecção, e como tal pode ser realizada in vivo. Uma técnica, de contraste para ultrassons de alta resolução melhorada (CEHRUS), utiliza microbolhas cheias com gás, como um agente de contraste. Injecção destas microbolhas na corrente sanguínea permite a visualização do fluxo de sangue com as medições em tempo real de fluxo para baixo para o nível capilar, mas não fornece uma vista 3D dos vasos imaged 2,27-31. Outro método, angioressonância (ARM) também tem sido usado para vasos imagem coronárias 32-34 e avanços recentes na MRA ter alargado as suas capacidades de imagem para obter medições em tempo real do fluxo de sangue 35,36. Enquanto MRA pode produzir reconstruções 3D da vessels com imagens, a resolução da MRA está actualmente limitada a cerca de 100 microns e, portanto, não consegue identificar pequenos vasos (capilares, arteríolas e vênulas).
Uma vez que tanto CEHRUS e ARM pode ser realizada em animais vivos, que oferecem a vantagem de fluxo repetidamente e de forma não invasiva de monitorização de sangue e do desenvolvimento vascular. No entanto, a resolução relativamente baixa de ARM e à falta de capacidade de 3D a partir de CEHRUS opõe imagiologia da rede coronária como um todo. Assim, as técnicas ex vivo de imagem que requerem vasculares agentes de enchimento ou de imunodetecção são importantes para a obtenção de informação de alta resolução em 3D do sistema vascular coronário, enquanto que o in vivo, fornecer a informação valiosa relação à funcionalidade da rede vascular (isto é, o fluxo de dados) ao longo do tempo . Combinando análise in vivo o tempo claro, com ponto final ex vivo de imagem fornece um sistema poderoso para o estudo da vasculatura coronária.
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Disclosures
Os ratos foram tratados com métodos aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Utilização da Universidade de Washington e de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo National Institutes of Health EUA (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996).
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Kelly Stevens para os ensaios iniciais do protocolo, o Dr. Michael Simons, Hauch Kip Dr., e os membros de ambos os laboratórios para a discussão geral.
Este trabalho é suportado por NIH concede HL087513 e P01 HL094374.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringes |  BD Biosciences |
BD-309602 | |
| 1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles | BD Biosciences |
BD-309306 | |
| 2" x 2" Gauze pads | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾" Angiocath IV catheter | BD Biosciences |
BD-381112 | |
| 26G ½"gauge needles | BD Biosciences |
BD-305111 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich |
A9251 | 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine) |
| Angled Graefe Forceps | Fine Science Tools |
11052-10 | |
| Cotton-tipped applicators: 6" non-sterile | Cardinal Health |
C15055-006 | |
| Curved Surgical Scissors | Fine Science Tools |
14085-09 | |
| Dissecting stereoscope and light source | Nikon Instruments |
NA | NA |
| Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches | Cole-Parmer |
YO-10915-12 | Filled with tar for pinning down the mouse |
| Fine Curved Forceps | Aesculap |
FD281R | Need two |
| Heparin, 5000 U/ml stock | APP Pharmaceuticals |
NDC 63323-047-10 | 1:100 dilution in water |
| KCl | Fisher Scientific |
P217 | Saturated solution in H2O |
| Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-2013-01 | Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline |
| Microfil | FlowTech |
MV-122 (yellow). Other color options are also available. | Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed |
| Non-sterile Suture: 6-0, braided silk | Harvard Apparatus |
723287 | |
| Papaverine | American Regent Inc. |
NDC 0517-4010-01 | 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich |
P6148 | Prepared as 4% solution |
| Perfusion Apparatus | See figure 2 | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools |
15018-10 | |
| Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock | Lloyd, Inc. |
NADA #139-236 | Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline |
References
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