La visualización de los vasos coronarios es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de las enfermedades cardiovasculares. Aquí se describe un método para la perfusión vascular coronaria murino con una goma de silicona radiopaco (Microfil), en preparación para la micro-tomografía axial computerizada (μCT) de imágenes.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Perfusión retrógrada y llenado de la vasculatura coronaria del ratón, como preparación para la Micro tomografía computarizada
En este artículo
Resumen
Resumen
La visualización de la vasculatura se está convirtiendo cada vez más importante para la comprensión de muchos estados patológicos diferentes. Si bien existen varias técnicas para obtener imágenes de la vasculatura, pocos son capaces de visualizar la red vascular en su conjunto, mientras que se extiende a una resolución que incluye el 1,2 vasos más pequeños. Además, muchas de las técnicas de colada vasculares destruir el tejido circundante, evitando su posterior análisis de la muestra 3-5. Un método que evita estos problemas es de micro-tomografía axial computerizada (μCT). μCT imagen puede escanear a resoluciones menores de 10 micras, es capaz de producir reconstrucciones en 3D de la red vascular, y deja el tejido intacto para su posterior análisis (por ejemplo, histología y morfometría) 11.06. Sin embargo, los vasos de imágenes ex vivo por métodos μCT requiere que los vasos se llena con un compuesto radiopaco. Como tal, la representación exacta de la vasculatura producido por μCT imagen dependellenado fiable y completa de los vasos. En este protocolo, se describe una técnica para el llenado de los vasos coronarios del ratón en la preparación de imágenes μCT.
Dos técnicas que predominan existen para el llenado de los vasos coronarios: en vivo a través de la perfusión de la canalización y retrógrado de la aorta (o una rama del arco aórtico) 12-14, o ex vivo a través de un sistema de perfusión Langendorff 15-17. A continuación se describe un método in vivo canulación aórtica, que ha sido específicamente diseñado para garantizar el llenado de todos los buques. Nosotros utilizamos un compuesto viscosidad baja radiopaco llamado Microfil que puede perfundir a través de los vasos más pequeños para llenar todos los capilares, así como los dos lados arteriales y venosas de la red vascular. Los buques son perfundidos con buffer usando un sistema de perfusión a presión, y se rellena con Microfil. Para asegurarse de que Microfil llena los pequeños vasos de resistencia más altos, que ligan las ramas grandes emanating de la aorta, que desvía el Microfil en las coronarias. Una vez finalizado el llenado, para evitar que la naturaleza elástica del tejido cardíaco de exprimir Microfil cabo de algunos vasos, que ligar accesibles los puntos importantes de salida vasculares inmediatamente después del llenado. Por lo tanto, nuestra técnica está optimizado para el llenado completo y la retención máxima del agente de carga, lo que permite la visualización completa de la red vascular coronaria - arterias, capilares y venas por igual.
Protocolo
1. Los preparativos antes de iniciar
- Llenar cada lado del aparato de presión de perfusión con tampón Vasodilatador (4 mg / l papaverina + 1g / l adenosina en PBS) o 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS, respectivamente.
- Preparar una jeringa de insulina 1/2cc (con un 29G conectado permanentemente ½ "aguja) llenándolo con 0,1 ml de heparina 1:100 (stock 5000U/ml) y doblar la aguja a un ángulo de 120 grados ~ con el bisel hacia arriba. Haga lo misma con una jeringa de 1 ml (con un 26G ½ "aguja) llena con 0,3 ml de solución saturada de KCl.
2. Exponiendo el corazón y la canulación de la aorta
- Se anestesia ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Tejido cardíaco tiene una demanda metabólica muy alta, y por tanto requiere un suministro constante de nutrientes y el oxígeno de la sangre entregada por la vasculatura coronaria. Las enfermedades de los vasos coronarios, los cuales disminuyen la función coronaria debido a la estenosis del vaso y el bloqueo, puede llevar a la hipoxia tisular y la isquemia, y poner a los pacientes afectados por el riesgo de infarto de miocardio y un daño irreparable al músculo del corazón. Una mejor comprensión del estado de enfermedad d.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los ratones han sido manipulados con métodos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de Washington y de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud (NIH Publication No. 85-23, revisada en 1996).
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Kelly Stevens para las pruebas iniciales del protocolo, el Dr. Michael Simons, Hauch Dr. Kip, y los miembros de sus dos laboratorios para la discusión general.
Este trabajo es el apoyo de subvenciones del NIH HL087513 y HL094374 P01.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| 1 ml jeringas | Becton Dickinson | BD-309602 | |
| 1/2cc jeringas para insulina con agujas 29G ½ conectado permanentemente ' | Becton Dickinson | BD-309306 | |
| 2 "x 2" Almohadillas de gasa | Med101store.com | SKU 2208 | |
| 24G ¾ "Angiocath IV del catéter | Becton Dickinson | BD-381112 | |
| 26G ½ "agujas de calibre | lacio "> Becton Dickinson | BD-305111 | |
| La adenosina | Sigma | A9251 | 1 g / l en PBS durante Buffer vasodilatación (con papaverina) |
| Pinzas angulares Graefe | Herramientas de Bellas Ciencia | 11052-10 | |
| De algodón con punta de aplicadores: 6 "no estéril | Cardinal Health | C15055-006 | |
| Curvas Tijeras quirúrgicas | Herramientas de Bellas Ciencia | 14085-09 | |
| Estereoscopio de disección y la fuente de luz | Nikon | NA | NA |
| Bandeja de disección, 11.5 x 7.5 pulgadas | Cole-Parmer | YO-10915-12 | Lleno de alquitrán para la fijación abajo el ratón |
| Bellas pinzas curvas | Aesculap | FD281R | Necesitas dos |
| La heparina, 5.000 U / ml de caldo | APP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-047-10 | 1:100 dilución en agua |
| KCl | Pescador | P217 | Solución saturada en H2O |
| Ketamina (Ketaset), 100 mg / ml de stock | Fort Dodge, de Overland Park, KS, EE.UU. | NDC 0856-2013-01 | Mezclado como el peso corporal 130 mg / kg, con xilacina en s 0,9%aline |
| Microfil | Flujo Tech | MV-122 (amarillo). Otras opciones de color están también disponibles. | Mezclar 1:1 en peso, con 10% en volumen de agente de curado. Prepararse inmediatamente antes de la inyección, y agitar para asegurar que esté bien mezclado |
| No estériles de sutura: 6-0, trenzado de seda | Aparato de Harvard | 723287 | |
| Papaverina | América Regent Inc. | NDC 0517-4010-01 | 4 mg / l en PBS durante Buffer vasodilatación (con adenosina) |
| Paraformaldehído | Sigma | P6148 | Preparado como solución al 4% |
| Aparato de perfusión | Ver figura 2 | ||
| Tijeras de primavera | Herramientas de Bellas Ciencia | 15018-10 | |
| Xilazina (Anased), 20 mg / dL de valores | Lloyd Labs | NADA # 139-236 | Mezclado como el peso corporal 8,8 mg / kg, con ketamina en 0,9% de solución salina |
Referencias
- Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
