Retrograd perfusjon og Fylling av Mouse Coronary blodkar som forberedelse for Micro Datatomografiscanning Imaging

Summary

Visualisering av hjertets fartøyene er kritisk til å fremme vår forståelse av hjerte-og karsykdommer. Her beskriver vi en metode for perfusing murine koronar blodkar med et røntgentett silikongummi (Microfil), i forberedelse for mikro-computertomografi (μCT) bildebehandling.

Abstract

Visualisering av blodkar blir stadig viktigere for å forstå mange ulike sykdomstilstander. Mens flere teknikker finnes for bildebehandling blodkar, få er i stand til å visualisere vaskulære nettverket som helhet, mens strekker seg til en oppløsning som inneholder mindre fartøyer ^1,2. I tillegg er mange vaskulære kasteteknikker ødelegge det omkringliggende vevet, og hindrer videre analyse av prøven ^3-5. En metode som omgår disse problemene er mikro-computertomografi (μCT). μCT bildebehandling kan skanne med en oppløsning <10 mikron, er i stand til å produsere 3D rekonstruksjoner av vaskulær nettverket, og forlater vev inntakt for påfølgende analyse (f.eks histologi og morfometri) ^6-11. Krever imidlertid tenkelig fartøy av ex vivo μCT metoder som fartøyene bli fylt med et røntgentett sammensatt. Som sådan er det nøyaktig representasjon av blodkar produsert av μCT tenkelig betingetpålitelig og fullstendig fylling av fartøyene. I denne protokollen, beskriver vi en teknikk for å fylle mus koronar fartøy i forberedelse til μCT bildebehandling.

To dominerer teknikker finnes for å fylle koronar blodkar: in vivo via kanylering og retrograd perfusjon av aorta (eller en filial av aortabuen) ^12-14, eller ex vivo via en Langendorff perfusjon system ^15-17. Her beskriver vi en in vivo aorta kanylering metode som er spesielt utformet for å sikre fylling av alle fartøy. Vi bruker en lav viskositet røntgentett stoff kalt Microfil som kan perfuse gjennom de minste fartøyene til å fylle alle kapillærene, samt både arterielle og venøse sider av vaskulær nettverket. Fartøyene er perfused med buffer ved hjelp av en trykksatt perfusjon system, og deretter fylt med Microfil. For å sikre at Microfil fyller de små høyere motstand fartøy, ligate vi de store grenene emanating fra aorta, som viderekoble Microfil inn i coronaries. Når fylling er ferdig, for å hindre elastisk natur hjertevev fra klemme Microfil ut av noen skip, ligate vi tilgjengelige store vaskulære utganger umiddelbart etter fylling. Derfor er vår teknikk optimalisert for fullstendig utfylling og maksimal oppbevaring av fylling agent, slik visualisering av hele koronar vaskulær nettverk – arterier, kapillærer og vener like.

Protocol

1. Forberedelser før start Fyll hver side av trykket perfusjons apparat med vasodilator buffer (4mg / L papaverin + 1g / L Adenosin i PBS) eller 4% Paraformaldehyde (PFA) i PBS, henholdsvis. Forbered en 1/2cc Insulin sprøyte (med en fast tilkoblet 29G ½ "p) ved å fylle den med 0,1 ml 1:100 Heparin (5000U/ml lager) og bøye nålen til ~ 120 graders vinkel med skråkant opp. Gjør samme med en 1 ml sprøyte (med en 26G ½ "nålen) fylt med 0,3 ml mettet KCl løsning. <p class="…

Discussion

Cardiac vev har en svært høy metabolsk etterspørsel, og derfor krever en konstant tilførsel av næringsstoffer og oksygen fra blodet levert av koronar blodkar. Sykdommer i hjertets fartøy, som reduserer koronar funksjon på grunn av fartøy stenose og blokkering, kan føre til vevshypoksi og iskemi, og sette berørte pasienter med risiko for hjerteinfarkt og uopprettelig skade på hjertemuskelen. En bedre forståelse av sykelig tilstand av disse fartøyene er nødvendig, og kritisk til vår evne til å studere koro…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
1 ml syringes	Becton Dickinson	BD-309602
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles	Becton Dickinson	BD-309306
2″ x 2″ Gauze pads	Med101store.com	SKU 2208
24G ¾” Angiocath IV catheter	Becton Dickinson	BD-381112
26G ½”gauge needles	Becton Dickinson	BD-305111
Adenosine	Sigma	A9251	1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile	Cardinal Health	C15055-006
Curved Surgical Scissors	Fine Science Tools	14085-09
Dissecting stereoscope and light source	Nikon	NA	NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches	Cole-Parmer	YO-10915-12	Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps	Aesculap	FD281R	Need two
Heparin, 5000 U/ml stock	APP Pharmaceuticals LLC	NDC 63323-047-10	1:100 dilution in water
KCl	Fisher	P217	Saturated solution in H2O
Ketamin  (Ketaset), 100 mg/ml stock	Fort Dodge, Overland Park, KS, USA	NDC 0856-2013-01	Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil	Flow Tech	MV-122 (yellow). Other color options are also available.	Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk	Harvard Apparatus	723287
Papaverine	American Regent Inc.	NDC 0517-4010-01	4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus			See figure 2
Spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock	Lloyd Labs	NADA #139-236	Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline