Summary

Retrograd perfusjon og Fylling av Mouse Coronary blodkar som forberedelse for Micro Datatomografiscanning Imaging

Published: February 10, 2012
doi:

Summary

Visualisering av hjertets fartøyene er kritisk til å fremme vår forståelse av hjerte-og karsykdommer. Her beskriver vi en metode for perfusing murine koronar blodkar med et røntgentett silikongummi (Microfil), i forberedelse for mikro-computertomografi (μCT) bildebehandling.

Abstract

Visualisering av blodkar blir stadig viktigere for å forstå mange ulike sykdomstilstander. Mens flere teknikker finnes for bildebehandling blodkar, få er i stand til å visualisere vaskulære nettverket som helhet, mens strekker seg til en oppløsning som inneholder mindre fartøyer 1,2. I tillegg er mange vaskulære kasteteknikker ødelegge det omkringliggende vevet, og hindrer videre analyse av prøven 3-5. En metode som omgår disse problemene er mikro-computertomografi (μCT). μCT bildebehandling kan skanne med en oppløsning <10 mikron, er i stand til å produsere 3D rekonstruksjoner av vaskulær nettverket, og forlater vev inntakt for påfølgende analyse (f.eks histologi og morfometri) 6-11. Krever imidlertid tenkelig fartøy av ex vivo μCT metoder som fartøyene bli fylt med et røntgentett sammensatt. Som sådan er det nøyaktig representasjon av blodkar produsert av μCT tenkelig betingetpålitelig og fullstendig fylling av fartøyene. I denne protokollen, beskriver vi en teknikk for å fylle mus koronar fartøy i forberedelse til μCT bildebehandling.

To dominerer teknikker finnes for å fylle koronar blodkar: in vivo via kanylering og retrograd perfusjon av aorta (eller en filial av aortabuen) 12-14, eller ex vivo via en Langendorff perfusjon system 15-17. Her beskriver vi en in vivo aorta kanylering metode som er spesielt utformet for å sikre fylling av alle fartøy. Vi bruker en lav viskositet røntgentett stoff kalt Microfil som kan perfuse gjennom de minste fartøyene til å fylle alle kapillærene, samt både arterielle og venøse sider av vaskulær nettverket. Fartøyene er perfused med buffer ved hjelp av en trykksatt perfusjon system, og deretter fylt med Microfil. For å sikre at Microfil fyller de små høyere motstand fartøy, ligate vi de store grenene emanating fra aorta, som viderekoble Microfil inn i coronaries. Når fylling er ferdig, for å hindre elastisk natur hjertevev fra klemme Microfil ut av noen skip, ligate vi tilgjengelige store vaskulære utganger umiddelbart etter fylling. Derfor er vår teknikk optimalisert for fullstendig utfylling og maksimal oppbevaring av fylling agent, slik visualisering av hele koronar vaskulær nettverk – arterier, kapillærer og vener like.

Protocol

1. Forberedelser før start Fyll hver side av trykket perfusjons apparat med vasodilator buffer (4mg / L papaverin + 1g / L Adenosin i PBS) eller 4% Paraformaldehyde (PFA) i PBS, henholdsvis. Forbered en 1/2cc Insulin sprøyte (med en fast tilkoblet 29G ½ "p) ved å fylle den med 0,1 ml 1:100 Heparin (5000U/ml lager) og bøye nålen til ~ 120 graders vinkel med skråkant opp. Gjør samme med en 1 ml sprøyte (med en 26G ½ "nålen) fylt med 0,3 ml mettet KCl løsning. <p class="…

Discussion

Cardiac vev har en svært høy metabolsk etterspørsel, og derfor krever en konstant tilførsel av næringsstoffer og oksygen fra blodet levert av koronar blodkar. Sykdommer i hjertets fartøy, som reduserer koronar funksjon på grunn av fartøy stenose og blokkering, kan føre til vevshypoksi og iskemi, og sette berørte pasienter med risiko for hjerteinfarkt og uopprettelig skade på hjertemuskelen. En bedre forståelse av sykelig tilstand av disse fartøyene er nødvendig, og kritisk til vår evne til å studere koro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Kelly Stevens for første utprøving av protokollen, Dr. Michael Simons, Dr. Kip Hauch, og medlemmer av begge sine laboratorier for generell diskusjon.

Dette arbeidet er støtte ved NIH tilskudd HL087513 og P01 HL094374.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
1 ml syringes Becton Dickinson BD-309602  
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles Becton Dickinson BD-309306  
2″ x 2″ Gauze pads Med101store.com SKU 2208  
24G ¾” Angiocath IV catheter Becton Dickinson BD-381112  
26G ½”gauge needles Becton Dickinson BD-305111  
Adenosine Sigma A9251 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps Fine Science Tools 11052-10  
Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile Cardinal Health C15055-006  
Curved Surgical Scissors Fine Science Tools 14085-09  
Dissecting stereoscope and light source Nikon NA NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches Cole-Parmer YO-10915-12 Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps Aesculap FD281R Need two
Heparin, 5000 U/ml stock APP Pharmaceuticals LLC NDC 63323-047-10 1:100 dilution in water
KCl Fisher P217 Saturated solution in H2O
Ketamin  (Ketaset), 100 mg/ml stock Fort Dodge, Overland Park, KS, USA NDC 0856-2013-01 Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil Flow Tech MV-122 (yellow). Other color options are also available. Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk Harvard Apparatus 723287  
Papaverine American Regent Inc. NDC 0517-4010-01 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde Sigma P6148 Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus     See figure 2
Spring Scissors Fine Science Tools 15018-10  
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock Lloyd Labs NADA #139-236 Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline

References

  1. Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
  2. Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
  3. Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
  4. Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
  5. Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
  6. Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
  7. Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
  8. Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
  9. Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
  10. Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
  11. Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
  12. Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
  13. Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
  14. Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
  15. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
  16. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  17. Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
  18. Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
  19. Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
  20. Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts–technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
  21. Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
  22. Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
  23. Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
  24. Quintana, L., Sharpe, J. . Optical projection tomography of vertebrate embryo development. , 586-594 (2011).
  25. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
  26. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
  27. Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
  28. Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
  29. Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
  30. Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
  31. Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
  32. Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
  33. Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
  34. Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
  35. Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
  36. Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. , 254-441 (2010).

Play Video

Cite This Article
Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, Jr., W. M. Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3740, doi:10.3791/3740 (2012).

View Video