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Medicine

Perfusión retrógrada y llenado de la vasculatura coronaria del ratón, como preparación para la Micro tomografía computarizada

doi: 10.3791/3740 Published: February 10, 2012

Summary

La visualización de los vasos coronarios es fundamental para avanzar en nuestra comprensión de las enfermedades cardiovasculares. Aquí se describe un método para la perfusión vascular coronaria murino con una goma de silicona radiopaco (Microfil), en preparación para la micro-tomografía axial computerizada (μCT) de imágenes.

Abstract

La visualización de la vasculatura se está convirtiendo cada vez más importante para la comprensión de muchos estados patológicos diferentes. Si bien existen varias técnicas para obtener imágenes de la vasculatura, pocos son capaces de visualizar la red vascular en su conjunto, mientras que se extiende a una resolución que incluye el 1,2 vasos más pequeños. Además, muchas de las técnicas de colada vasculares destruir el tejido circundante, evitando su posterior análisis de la muestra 3-5. Un método que evita estos problemas es de micro-tomografía axial computerizada (μCT). μCT imagen puede escanear a resoluciones menores de 10 micras, es capaz de producir reconstrucciones en 3D de la red vascular, y deja el tejido intacto para su posterior análisis (por ejemplo, histología y morfometría) 11.06. Sin embargo, los vasos de imágenes ex vivo por métodos μCT requiere que los vasos se llena con un compuesto radiopaco. Como tal, la representación exacta de la vasculatura producido por μCT imagen dependellenado fiable y completa de los vasos. En este protocolo, se describe una técnica para el llenado de los vasos coronarios del ratón en la preparación de imágenes μCT.

Dos técnicas que predominan existen para el llenado de los vasos coronarios: en vivo a través de la perfusión de la canalización y retrógrado de la aorta (o una rama del arco aórtico) 12-14, o ex vivo a través de un sistema de perfusión Langendorff 15-17. A continuación se describe un método in vivo canulación aórtica, que ha sido específicamente diseñado para garantizar el llenado de todos los buques. Nosotros utilizamos un compuesto viscosidad baja radiopaco llamado Microfil que puede perfundir a través de los vasos más pequeños para llenar todos los capilares, así como los dos lados arteriales y venosas de la red vascular. Los buques son perfundidos con buffer usando un sistema de perfusión a presión, y se rellena con Microfil. Para asegurarse de que Microfil llena los pequeños vasos de resistencia más altos, que ligan las ramas grandes emanating de la aorta, que desvía el Microfil en las coronarias. Una vez finalizado el llenado, para evitar que la naturaleza elástica del tejido cardíaco de exprimir Microfil cabo de algunos vasos, que ligar accesibles los puntos importantes de salida vasculares inmediatamente después del llenado. Por lo tanto, nuestra técnica está optimizado para el llenado completo y la retención máxima del agente de carga, lo que permite la visualización completa de la red vascular coronaria - arterias, capilares y venas por igual.

Protocol

1. Los preparativos antes de iniciar

  1. Llenar cada lado del aparato de presión de perfusión con tampón Vasodilatador (4 mg / l papaverina + 1g / l adenosina en PBS) o 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS, respectivamente.
  2. Preparar una jeringa de insulina 1/2cc (con un 29G conectado permanentemente ½ "aguja) llenándolo con 0,1 ml de heparina 1:100 (stock 5000U/ml) y doblar la aguja a un ángulo de 120 grados ~ con el bisel hacia arriba. Haga lo misma con una jeringa de 1 ml (con un 26G ½ "aguja) llena con 0,3 ml de solución saturada de KCl.

2. Exponiendo el corazón y la canulación de la aorta

  1. Se anestesia el ratón usando el anestésico de elección. (Usamos una sobredosis de una mezcla de ketamina / xilazina. Inyección IP de 130 mg / kg de ketamina y 8,8 mg / kg de xilazina en solución salina)
  2. Pin del ratón anestesiado en la bandeja de disección, hasta la parte ventral. Abrir la cavidad abdominal con una incisión central y retraer la pielpara exponer los órganos. Mover los intestinos a un lado para exponer una región de la vena cava posterior (PVC).
  3. Inyectar solución de heparina en el PVC. Como se extrae la aguja, cubra el orificio de la aguja con un aplicador con punta de algodón para evitar fugas y mantenerla durante unos segundos hasta que los coágulos de PVC de pared y sellos. Esperar 2-3 minutos para heparina para dispersar a lo largo de la circulación del ratón.
  4. Diseccionar el diafragma y la caja torácica por lo que se puede observar el corazón latiendo. Inyecte lentamente solución de KCl en el PVC hasta las detenciones del corazón.
  5. Retire todos los órganos están debajo del diafragma y los impuestos especiales la parte posterior del ratón, dejando a la región anterior de la membrana intacta. Retire el diafragma, teniendo cuidado de cortar el PVC cerca del diafragma por lo que la porción proximal del corazón es fácil de localizar en los siguientes pasos.
  6. Localice el extremo del corte de la aorta. Coloque un pedazo largo de 6-0 sutura de seda trenzada por debajo de la aorta de un lado a otro pocos milímetros anterioresm del extremo cortado de tal manera que la sutura se dobla hacia atrás sobre sí mismo. Cortar esta sutura ya a la mitad por lo que hay 2 piezas de sutura en la aorta. Insertar el angiocatéter en el extremo cortado de la aorta (Fig. 1A, B) y atar cada sutura con un nudo doble para sujetar el angiocatéter en su lugar y evitar cualquier contrapresión dentro de la aorta se escape.

3. La perfusión e inyección Microfil

  1. Conectar el angiocatéter al aparato de la presión de perfusión (Fig. 2) y comenzar la perfusión de los vasos con tampón vasodilatador (Fig. 1C) bombeando el aparato de perfusión a una presión de conducción de 100-110 mm Hg. Compruebe que el buffer se perfunde a través de las arterias coronarias, garantizando el líquido se sale de la PVC. Continuar a perfundir durante al menos 3 minutos o hasta que el fluido que sale del PVC es clara. (Continúe con los pasos a seguir, mientras que la perfusión).
  2. Disección de las costillas y la espalda pin (o eliminar) la caja torácica para exponer el corazón. Una vez expuesto, ser careful no dejar que el corazón se secan apretando gotas de tampón en el corazón de una pieza tampón empapado de gasa. Despeja el timo para exponer el arco aórtico. Ligar las tres ramas principales de aorta con sutura de seda trenzada 6-0 para asegurar el líquido se desvía a través de las arterias coronarias, más que a través de estos vasos más grandes, de baja resistencia (Fig. 1D).
  3. La perfusión del corazón con el fijador durante 15 minutos, luego enjuague con tampón vasodilatación por lo menos 2 minutos. Mientras tanto, ligar, tanto anterior vena cava para evitar que se escape Microfil del corazón después de la inyección (Fig. 1E). Coloque las suturas alrededor de la PVC y la aorta, pero no los apriete hasta después del llenado.
  4. Preparar el Microfil (como se especifica en la tabla de reactivos) y cargarlo en una jeringa de 1 ml. Llenar la bandeja de disección con agua suficiente para cubrir el catéter (así como para prevenir la introducción de burbujas de aire cuando se cambia de un tubo de perfusión a la jeringa Microfil). Desconecte la perfusión APParatus del catéter y conectar la jeringa Microfil preparada.
  5. Se inyecta la Microfil en la aorta hasta buen llenado de las arterias coronarias es evidente (Figuras 1F, 3A): las arterias se llenan primero, y luego el Microfil se "derrame" en los capilares como los sofocos tejido con el color de la Microfil. Una vez en el lado venoso, la naturaleza hidrófoba de la Microfil es para que aparezca inicialmente como esferas independientes como se desprende de los vasos más pequeños. Continuar para inyectar el Microfil hasta una columna continua llena las venas. Llenado completo será evidente cuando el Microfil es continua dentro de los vasos, y se sale a través del PVC.
  6. Después de llenar es completa, rápidamente apretar las suturas que se colocaron previamente alrededor del PVC y la aorta para prevenir la naturaleza elástica del tejido cardíaco de apretar el Microfil fuera de los vasos.
  7. Cubra el corazón con una gasa húmeda (empapado con agua de la bandeja de disección) Para evitar su desecación, y dejar que repose durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente hasta que el Microfil ha polimerizado. Evitar cualquier tipo de presiones externas sobre el corazón durante el proceso de polimerización, como levantar o girar el corazón en un intento de obtener una visión temprana de los vasos llenos en la parte posterior del corazón. Esto puede exprimir Microfil de algunos buques en una zona más elástica del corazón, causando interrupciones en la Microfil.
  8. Quitar el corazón y post-fijar en PFA al 4% durante toda la noche a 4 ° C. A continuación, almacenar en el 70% de etanol a 4 ° C. La vasculatura del corazón ya está listo para obtener imágenes de μCT.

4. Los resultados representativos

Los buques que estén efectivamente perfundidos por Microfil tendrá Microfil continua, ininterrumpida a lo largo de los vasos (Fig. 3). El grado de llenado de los vasos coronarios se puede juzgar por ojo; venas se encuentra epicárdica 18, y puede ser fácilmente observado (Fig. 3A, punta de flecha); arterias,que son más intramiocárdica 18, también son visibles a través de la superficie del corazón (Fig. 3A, flecha). Llenado capilar es también evidente, como tejido cardíaco tiene una densidad muy alta de los capilares, y por lo tanto, cuando el relleno capilares, el tejido cardíaco se lave con el color de la Microfil (Fig. 3A, en estrella). Así, cualquier red vascular que fallaron en llenar será notable debido a la falta de Microfil (Fig. 3B, C).

Las discontinuidades en el Microfil (asteriscos en la Fig. 3B) aparecen a menudo debido a la naturaleza hidrofóbica de la Microfil hará que se contraiga en sí mismo y hacer que "rompe" dentro de los vasos llenos. Estos "descansos" se puede reducir si la presión dentro de los vasos se mantiene a través adecuada como tie-offs de los puntos de salida vasculares del corazón. Otras discontinuidades pueden ser causados ​​por las burbujas de aire dentro de la Microfil. Para evitar la introducción de aire, asegúrese de que el angiocatéter está totalmente sumergido en el agua cuando se pasa de la perfusión AP Paratus a la jeringa Microfil. Si una burbuja de aire se introduce, a menudo puede ser eliminado simplemente al continuar la perfusión Microfil hasta que la burbuja se ha empujado a través y fuera de los vasos coronarios.

Redes vasculares no puede llenar completamente si una porción del lecho vascular está bloqueado (Fig. 3B, flecha). Mientras que la heparina inhibe la formación de coágulos de sangre, los bloqueos ocasionales pueden producirse debido a la perfusión de heparina incompleta antes de comenzar el procedimiento, o debido a otros factores desconocidos. Si ocurre un bloqueo, no hay, hasta donde sabemos, ningún método para desalojar el bloqueo para completar el relleno vascular. Llenado incompleto también puede resultar si la presión se usa demasiado poco durante el llenado, como el Microfil no se verán obligados a todos los lechos vasculares y redes capilares (Fig. 3C). Por el contrario, la presión excesiva puede provocar que los capilares se rompen y extravasación Microfil en el tejido circundante (Fig. 3D).

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Figura 1. Descripción general del sistema de perfusión Microfil. (A) La aorta y el PVC se cortan aproximadamente al nivel del diafragma. (B) La aorta ascendente se canula con un angiocatéter. (C) La vasodilatación de amortiguación se perfunde a través de los vasos, impulsados ​​por el aparato de presión de perfusión (no se muestra), mientras que (D) las tres ramas principales fuera del arco aórtico se ligan. (S) 4% PFA se perfunde a través de las arterias coronarias, mientras tanto anterior venas cavas se ligan. (F) Utilizando una jeringa, Microfil se perfunde a través de las coronarias hasta que se observa que sale del PVC.

Figura 2
Figura 2. Aparato de perfusión. Dos matraces Erlenmeyer, cada uno lleno con tampón Vasodilatación cualquiera o 4% PFA, se unen y se presuriza a través de tubos conectados a sus brazos laterales. El sistema está presurizado a través de bombeo manual delbombilla, y un manómetro de presión está conectado a uno de los matraces para permitir la supervisión y mantenimiento de la presión. Pequeños tubos se extienden a través de tapones de caucho y hacia abajo en el líquido en cada matraz. La presión que entra desde las bombas de armas blancas el líquido de cada matraz a cabo estos tubos más pequeños. Los tubos entonces se fusionan en una llave de paso que sólo permite que el líquido fluya desde un matraz al mismo tiempo.

Figura 3
Figura 3. Muestra corazones microrrellenos. (A) Los buques que se llenan y se tienen pocos (si alguno) se rompe en el Microfil, y el tejido del corazón se teñirá del color de la Microfil debido a la llena de capilares (estrella, y comparar con C). Ambas arterias (flecha - Izquierda arteria descendente anterior) y venas (punta de flecha - vena coronaria izquierda) son visibles a través de la superficie del corazón. (B) Un corazón con cortes en el Microfil (asteriscos), así como bloqueos en algunos barcos que impedía micrófono completaRofil penetración. Los vasos bloqueados permanecen rojo (flecha), como la sangre no se barrió a cabo durante el proceso de perfusión. (C) Un corazón con las embarcaciones que se llenaron completamente. Tenga en cuenta que el tejido no se ha tomado el color amarillo de la Microfil, indicando el Microfil no penetran en los capilares. (D) Un corazón donde la rotura de capilares, durante el llenado, haciendo que el Microfil a la fuga en el tejido circundante (flecha).

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Discussion

Tejido cardíaco tiene una demanda metabólica muy alta, y por tanto requiere un suministro constante de nutrientes y el oxígeno de la sangre entregada por la vasculatura coronaria. Las enfermedades de los vasos coronarios, los cuales disminuyen la función coronaria debido a la estenosis del vaso y el bloqueo, puede llevar a la hipoxia tisular y la isquemia, y poner a los pacientes afectados por el riesgo de infarto de miocardio y un daño irreparable al músculo del corazón. Una mejor comprensión del estado de enfermedad de estos vasos es necesaria y fundamental para nuestra capacidad para estudiar los vasos coronarios es la visualización de la vasculatura. Aquí, se presenta un método para preparar vasculatura coronaria murino para formación de imágenes ex vivo mediante el llenado de la vasculatura con un material radio-opaco. Este protocolo ha sido diseñado específicamente para asegurar el llenado completo, y la visualización posteriormente, de todos los vasos coronarios, incluyendo capilares.

Para garantizar el llenado completo de todos los capilares, la agencias de llenadot, Microfil, debe ser inyectado en un sistema parcialmente cerrado que obligará a la Microfil en los más pequeños, los vasos de resistencia más altos dentro de la red vascular. Para crear este cierre parcial dentro de nuestro sistema de llenado in vivo, que ligar los tres más grandes, las arterias de resistencia de baja de ramificación del arco aórtico. Si bien esto no excluye todas las otras posibles "fugas" puntos, los vasos restantes (principalmente las arterias intercostales) son lo suficientemente pequeñas que cualquier pérdida de presión a través de ellos no interfiere con el llenado completo del sistema vascular coronario. Una vez que el Microfil ha perfundido todos los vasos en el corazón, la naturaleza innata de elasticidad del tejido cardíaco y vascular se apriete el Microfil cabo de algunos buques. Para evitar esta pérdida de Microfil, que ligar todos los puntos de salida de grandes y accesibles, es decir, tanto superior vena cava, la vena cava posterior, y la aorta, después de la vasculatura coronaria está completamente perfundidos. De esta manera, la presión es maintained en el corazón hasta el Microfil polimeriza, permitiendo que el Microfil para ajustarse a la estructura de recipiente a presión arterial normal fisiológico.

Alternativamente, si la visualización de los capilares no se requiere, también es posible llenar solamente los lechos vasculares arteriales o venosos sólo el. Versiones más viscosas de Microfil se pueden mezclar utilizando un diluyente de alta viscosidad (disponible de Flowtech). El perfundido más viscoso es incapaz de penetrar los capilares, y por lo tanto permite la visualización de sólo las arterias, o solamente las venas si perfundidos desde el lado venoso. Además, el protocolo presentado aquí se puede adaptar fácilmente a otras especies o ratones no adultas. La escala del procedimiento para coincidir apropiadamente el tamaño del animal simplemente requiere que el catéter y el tubo de perfusión son del tamaño adecuado a la aorta del animal con el fin de minimizar las fugas y evitar el estiramiento o rotura. Los volúmenes de fluidos inyectados (es decir, heparina,KCl saturado, y Microfil) también debe ser debidamente ampliadas.

Nuestro protocolo fue diseñado específicamente para la inyección de Microfil y formación de imágenes por μCT, sin embargo, puede ser fácilmente adaptado para otros agentes de relleno, ya sea para el análisis μCT, u otras técnicas de formación de imágenes ex vivo. Al buscar μCT rellenos compatibles, existen varias opciones de colorantes radioopacos, como muchas sustancias utilizadas para el llenado y el estudio de la vasculatura a través de otros métodos de imagen (por ejemplo acrílico) puede ser infundida con material radio-opaco, tal como un pigmento de plomo 9 o una solución de osmio 3. A pesar de que el agente de relleno utilizado, μCT imagen ofrece la ventaja de que los resultados pueden ser reconstruidos en un modelo 3D para proporcionar mediciones vasculares, así como información estructural sobre el patrón de ramificación de los vasos coronarios llenos 6,7,14,19. Además, las imágenes por μCT preserva el tejido circundante, permitiendo así una adicionalalyses después de la exploración. Así, corazones llenos y escaneado se puede procesar para el análisis histológico, y las secciones teñidas por diversos marcadores pueden ser alineados con los datos μCT para correlacionar identidad arterial / venosa, la presencia de capas musculares lisas, o adicionales índices histológicos.

Otras técnicas comunes de imágenes vasculares también requieren llenado vascular y el protocolo puede ser fácilmente adaptado para perfundir las coronarias con cualquiera de estos otros agentes de relleno. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) requiere el llenado de los vasos y luego disolver el tejido blando lejos del molde vascular establecida en un proceso llamado de colada a la corrosión. Con el fin de mantener la forma de los vasos sin el apoyo del tejido blando circundante, el agente de relleno debe ser fuerte y no quebradiza-: a menudo una resina acrílica (por ejemplo Mercox, Batson) 3,20,21. Mientras que SEM ofrece resoluciones de escaneo muy superior a la de la imagen μCT 22, el elenco a la corrosiónIng. procedimiento destruye el tejido, evitando que cualquier análisis de tejido. Otro método de formación de imágenes ex vivo de la vasculatura coronaria, tomografía proyección óptica (TPO), se puede detectar la luz visible o casi visible, y por tanto permite la detección de señales fluorescentes, además de precipitados cromogénico tal como el precipitado púrpura producido por la fosfatasa alcalina conversión de BCIP / NBT (5-bromo-4-cloro-3-indolil phosphate/4-nitro azul tetrazolio) 23-25. La visualización de los vasos, por lo tanto, se puede lograr ya sea por llenado con una sustancia fluorescente (por ejemplo PU4ii: una resina de poliuretano 3, o fluoresceína infundido dextrano 26), oa través de la no-llenado métodos, tales como todo el montaje inmunodetección mediante cualquiera de fluorescencia o un precipitado histoquímico cromogénico (por ejemplo BCIP / NBT) 23. OPT de imágenes puede alcanzar resoluciones ligeramente mejor que la de μCT (a alrededor de 1 micrón), sin embargo, tanto para el relleno y la immunodetemétodos ction el tejido blando circundante debe ser limpiado químicamente, lo que puede alterar algunos antígenos para el análisis histológico posterior a la digitalización.

También hay varios métodos para obtener imágenes de la vasculatura coronaria que no requieren relleno vascular o inmunodetección, y como tal se puede realizar in vivo. Una de las técnicas, Contraste Mejorado Ultrasonido de Alta Resolución (CEHRUS), utiliza microburbujas rellenas de gas como agente de contraste. La inyección de estas microburbujas en el torrente sanguíneo permite la visualización del flujo de sangre con las mediciones de flujo en tiempo real hasta el nivel capilar, pero no proporciona una vista 3D de los vasos con imagen 2,27-31. Otro método, angiografía por resonancia magnética (ARM) también se ha utilizado a los buques de imagen coronaria 32-34, y los avances recientes en ARM han ampliado sus capacidades de imagen para obtener mediciones en tiempo real del flujo sanguíneo 35,36. Mientras ARM puede producir reconstrucciones en 3D de la EVssels imágenes impresas, la resolución de la ERM se limita actualmente a alrededor de 100 micras, y por lo tanto no puede identificar los buques más pequeños (capilares, arteriolas y vénulas).

Dado que tanto CEHRUS y MRA se puede realizar en animales vivos, ofrecen la ventaja del flujo varias veces y no invasiva de sangre de seguimiento y el desarrollo vascular. Sin embargo, la resolución relativamente baja de la ARM y la falta de capacidades 3D de CEHRUS opone imagen de la red coronaria como un todo. Así, las técnicas de formación de imágenes ex vivo que requieren agentes de relleno o vasculares inmunodetección son importantes para la obtención de información de alta resolución en 3D del sistema vascular coronario, mientras que el técnicas in vivo proporcionar información valiosa con respecto a la funcionalidad de la red vascular (es decir, los datos de flujo) en el tiempo . La combinación de análisis in vivo evolución en el tiempo con el punto final ex vivo de imágenes proporciona un poderoso sistema para el estudio de la vasculatura coronaria.

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Disclosures

Los ratones han sido manipulados con métodos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Universidad de Washington y de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud (NIH Publication No. 85-23, revisada en 1996).

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Kelly Stevens para las pruebas iniciales del protocolo, el Dr. Michael Simons, Hauch Dr. Kip, y los miembros de sus dos laboratorios para la discusión general.

Este trabajo es el apoyo de subvenciones del NIH HL087513 y HL094374 P01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringes BD Biosciences BD-309602
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles BD Biosciences BD-309306
2" x 2" Gauze pads Med101store.com SKU 2208
24G ¾" Angiocath IV catheter BD Biosciences BD-381112
26G ½"gauge needles BD Biosciences BD-305111
Adenosine Sigma-Aldrich A9251 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps Fine Science Tools 11052-10
Cotton-tipped applicators: 6" non-sterile Cardinal Health C15055-006
Curved Surgical Scissors Fine Science Tools 14085-09
Dissecting stereoscope and light source Nikon Instruments NA NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches Cole-Parmer YO-10915-12 Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps Aesculap FD281R Need two
Heparin, 5000 U/ml stock APP Pharmaceuticals NDC 63323-047-10 1:100 dilution in water
KCl Fisher Scientific P217 Saturated solution in H2O
Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil FlowTech MV-122 (yellow). Other color options are also available. Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk Harvard Apparatus 723287
Papaverine American Regent Inc. NDC 0517-4010-01 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus See figure 2
Spring Scissors Fine Science Tools 15018-10
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock Lloyd, Inc. NADA #139-236 Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Perfusión retrógrada y llenado de la vasculatura coronaria del ratón, como preparación para la Micro tomografía computarizada
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Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, Jr., W. M. Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3740, doi:10.3791/3740 (2012).More

Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, Jr., W. M. Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3740, doi:10.3791/3740 (2012).

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