Summary

Retrograd perfusion och påfyllning av mus kranskärlen som förberedelse för Micro datortomografi Imaging

Published: February 10, 2012
doi:

Summary

Visualisering av kranskärlen är avgörande för att öka kunskaperna om hjärt-kärlsjukdomar. Här beskriver vi en metod för perfusion murin kranskärlen med en röntgentät silikongummi (mikrofilter), som förberedelse för mikro-datortomografi (μCT) avbildning.

Abstract

Visualisering av kärlsystemet blir allt viktigare för att förstå många olika sjukdomstillstånd. Medan flera tekniker finns för avbildning kärlsystemet, några har möjlighet att visualisera det vaskulära nätverket i sin helhet, medan sträcker sig till en resolution som innehåller mindre fartyg 1,2. Dessutom har många vaskulära gjutning förstöra den omgivande vävnaden, vilket förhindrar ytterligare analys av provet 3-5. En metod som kringgår dessa frågor är mikro-datortomografi (μCT). μCT avbildning kan skanna i upplösningar <10 mikrometer, kan producera 3D-rekonstruktioner av det vaskulära nätverket och lämnar vävnaden intakt för senare analys (t.ex. histologi och morfometri) 6-11. Kräver dock avbildning fartyg genom ex vivo μCT metoder som fartygen fyllas med en radiopak förening. Som sådan är den exakta återgivning av kärl som produceras av μCT avbildning knutentillförlitlig och fullständig fyllning av fartygen. I detta protokoll, beskriver vi en teknik för att fylla mus kranskärlen som förberedelse för μCT avbildning.

Två dominerande tekniker finns för att fylla kranskärlen: in vivo via kanylering och retrograd perfusion av aortan (eller en gren i aortabågen) 12-14, eller ex vivo genom en Langendorff-perfusion systemet 15-17. Här beskriver vi en in vivo-aorta kanylering metod som är speciellt utformade för att säkerställa fyllning av alla fartyg. Vi använder en låg förening viskositet röntgentät kallas mikrofilter som kan perfundera igenom minsta fartygen för att fylla alla kapillärerna, samt både arteriella och venösa sidan av vaskulära nätverket. Kärlen perfuserades med buffert med användning av en trycksatt perfusionssystem, och fylldes sedan med mikrofilter. För att säkerställa att mikrofilter fyller de små högre motstånd fartyg ligera vi stora grenar emanating från aorta, vilken avleder mikrofilter i kranskärlen. När fyllning är klar, för att förhindra den elastiska natur hjärtvävnad från att klämma mikrofilter av vissa fartyg, underbinda vi tillgängliga större vaskulära uttagspunkter omedelbart efter påfyllning. Därför är vår teknik optimerad för fullständig fyllning och maximal retention av fyllmedel, vilket möjliggör visualisering av hela koronar vaskulära nätverk – artärer, kapillärer och vener lika.

Protocol

1. Förberedelser innan du börjar Fylla varje sida av det tryck perfusionsapparat med Kärlvidgande medel-buffert (4 mg / L Papaverin + 1 g / L Adenosin i PBS) eller 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, respektive. Förbered en 1/2cc insulinspruta (med en permanent fastsatt 29G ½ "nål) genom att fylla den med 0,1 ml 1:100 Heparin (5000E/ml materiel) och böja nålen till ~ 120 graders vinkel med avfasningen uppåt. Gör det samma sak med en 1 ml spruta (med en 26G ½ "nål) fylld med 0,3 ml …

Discussion

Hjärtvävnad har en mycket hög metabolisk efterfrågan, och därför kräver en konstant tillförsel av näringsämnen och syre från blodet levereras av kranskärlen. Sjukdomar i hjärtats kranskärl, vilket minskar koronar funktion på grund av fartygets stenos och blockering, kan leda till hypoxi och ischemi, och sätta drabbade patienter med risk för hjärtinfarkt och irreparabel skada på hjärtmuskeln. En bättre förståelse av den sjuka tillståndet för dessa fartyg är nödvändigt och avgörande för vår …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Dr Kelly Stevens för de första försöken av protokollet, Dr Michael Simons, Dr Kip Hauch, och medlemmar av båda sina labb för allmän diskussion.

Detta arbete är stöd från NIH bidrag HL087513 och P01 HL094374.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
1 ml syringes Becton Dickinson BD-309602  
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles Becton Dickinson BD-309306  
2″ x 2″ Gauze pads Med101store.com SKU 2208  
24G ¾” Angiocath IV catheter Becton Dickinson BD-381112  
26G ½”gauge needles Becton Dickinson BD-305111  
Adenosine Sigma A9251 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps Fine Science Tools 11052-10  
Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile Cardinal Health C15055-006  
Curved Surgical Scissors Fine Science Tools 14085-09  
Dissecting stereoscope and light source Nikon NA NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches Cole-Parmer YO-10915-12 Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps Aesculap FD281R Need two
Heparin, 5000 U/ml stock APP Pharmaceuticals LLC NDC 63323-047-10 1:100 dilution in water
KCl Fisher P217 Saturated solution in H2O
Ketamin  (Ketaset), 100 mg/ml stock Fort Dodge, Overland Park, KS, USA NDC 0856-2013-01 Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil Flow Tech MV-122 (yellow). Other color options are also available. Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk Harvard Apparatus 723287  
Papaverine American Regent Inc. NDC 0517-4010-01 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde Sigma P6148 Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus     See figure 2
Spring Scissors Fine Science Tools 15018-10  
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock Lloyd Labs NADA #139-236 Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline

References

  1. Couffinhal, T., Dufourcq, P., Barandon, L., Leroux, L., Duplaa, C. Mouse models to study angiogenesis in the context of cardiovascular diseases. Front. Biosci. 14, 3310-3325 (2009).
  2. Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
  3. Krucker, T., Lang, A., Meyer, E. P. New polyurethane-based material for vascular corrosion casting with improved physical and imaging characteristics. Microsc. Res. Tech. 69, 138-147 (2006).
  4. Murakami, T. Blood flow patterns in the rat pancreas: a simulative demonstration by injection replication and scanning electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 37, 497-508 (1997).
  5. Icardo, J. M., Colvee, E. Origin and course of the coronary arteries in normal mice and in iv/iv mice. J. Anat. 199, 473-482 (2001).
  6. Beighley, P. E., Thomas, P. J., Jorgensen, S. M., Ritman, E. L. 3D architecture of myocardial microcirculation in intact rat heart: a study with micro-CT. Adv. Exp. Med. Biol. 430, 165-175 (1997).
  7. Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1267-R1279 (2002).
  8. Jorgensen, S. M., Demirkaya, O., Ritman, E. L. Three-dimensional imaging of vasculature and parenchyma in intact rodent organs with X-ray micro-CT. Am. J. Physiol. 275, H1103-H1114 (1998).
  9. Marxen, M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med. Phys. 31, 305-313 (2004).
  10. Zagorchev, L. Micro computed tomography for vascular exploration. J. Angiogenes. Res. 2, 7-7 (2010).
  11. Heinzer, S. Hierarchical microimaging for multiscale analysis of large vascular networks. Neuroimage. 32, 626-636 (2006).
  12. Dedkov, E. I. Synectin/syndecan-4 regulate coronary arteriolar growth during development. Dev. Dyn. 236, 2004-2010 (2007).
  13. Gossl, M. Functional anatomy and hemodynamic characteristics of vasa vasorum in the walls of porcine coronary arteries. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. 272, 526-537 (2003).
  14. Rodriguez-Porcel, M. Altered myocardial microvascular 3D architecture in experimental hypercholesterolemia. Circulation. 102, 2028-2030 (2000).
  15. Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. J. Mol. Cell. Cardiol. 50, 940-950 (2011).
  16. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff—still viable in the new millennium. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 113-126 (2007).
  17. Toyota, E. Vascular endothelial growth factor is required for coronary collateral growth in the rat. Circulation. 112, 2108-2113 (2005).
  18. Lavine, K. J., Long, F., Choi, K., Smith, C., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling to distinct cell types differentially regulates coronary artery and vein development. Development. 135, 3161-3171 (2008).
  19. Cheema, A. N. Adventitial microvessel formation after coronary stenting and the effects of SU11218, a tyrosine kinase inhibitor. J. Am. Coll. Cardiol. 47, 1067-1075 (2006).
  20. Lametschwandtner, A., Lametschwandtner, U., Weiger, T. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts–technique and applications: updated review. Scanning Microsc. 4, 889-941 (1990).
  21. Schneider, P. Simultaneous 3D visualization and quantification of murine bone and bone vasculature using micro-computed tomography and vascular replica. Microsc. Res. Tech. 72, 690-701 (2009).
  22. Manelli, A., Sangiorgi, S., Binaghi, E., Raspanti, M. 3D analysis of SEM images of corrosion casting using adaptive stereo matching. Microscopy Research and Technique. 70, 350-354 (2007).
  23. Alanentalo, T. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Meth. 4, 31-33 (2007).
  24. Quintana, L., Sharpe, J. . Optical projection tomography of vertebrate embryo development. , 586-594 (2011).
  25. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-Dimensional Analysis of Vascular Development in the Mouse Embryo. PLoS ONE. 3, e2853-e2853 (2008).
  26. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiol. Genomics. 30, 179-191 (2007).
  27. Behm, C. Z. Molecular Imaging of Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression and Inflammatory Cell Recruitment During Vasculogenesis and Ischemia-Mediated Arteriogenesis. Circulation. 117, 2902-2911 (2008).
  28. Carr, C. L., Lindner, J. R. Myocardial perfusion imaging with contrast echocardiography. Curr. Cardiol. Rep. 10, 233-239 (2008).
  29. Leong-Poi, H. Assessment of Endogenous and Therapeutic Arteriogenesis by Contrast Ultrasound Molecular Imaging of Integrin Expression. Circulation. 111, 3248-3254 (2005).
  30. Villanueva, F. S. Microbubbles Targeted to Intercellular Adhesion Molecule-1 Bind to Activated Coronary Artery Endothelial Cells. Circulation. 98, 1-5 (1998).
  31. Wei, K. Quantification of Myocardial Blood Flow With Ultrasound-Induced Destruction of Microbubbles Administered as a Constant Venous Infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
  32. Beckmann, N., Stirnimann, R., Bochelen, D. High-Resolution Magnetic Resonance Angiography of the Mouse Brain: Application to Murine Focal Cerebral Ischemia Models. Journal of Magnetic Resonance. 140, 442-450 (1999).
  33. Kobayashi, H. 3D MR angiography of intratumoral vasculature using a novel macromolecular MR contrast agent. Magnetic Resonance in Medicine. 46, 579-585 (2001).
  34. Nezafat, R. B1-insensitive T2 preparation for improved coronary magnetic resonance angiography at 3 T. Magn. Reson. Med. 55, 858-864 (2006).
  35. Wagner, S., Helisch, A., Ziegelhoeffer, T., Bachmann, G., Schaper, W. Magnetic resonance angiography of collateral vessels in a murine femoral artery ligation model. NMR in Biomedicine. 17, 21-27 (2004).
  36. Cochet, H. In vivo MR angiography and velocity measurement in mice coronary arteries at 9.4 T: assessment of coronary flow velocity reserve. Radiology. , 254-441 (2010).

Play Video

Cite This Article
Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, Jr., W. M. Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (60), e3740, doi:10.3791/3740 (2012).

View Video