Retrograd perfusion och påfyllning av mus kranskärlen som förberedelse för Micro datortomografi Imaging

Summary

Visualisering av kranskärlen är avgörande för att öka kunskaperna om hjärt-kärlsjukdomar. Här beskriver vi en metod för perfusion murin kranskärlen med en röntgentät silikongummi (mikrofilter), som förberedelse för mikro-datortomografi (μCT) avbildning.

Abstract

Visualisering av kärlsystemet blir allt viktigare för att förstå många olika sjukdomstillstånd. Medan flera tekniker finns för avbildning kärlsystemet, några har möjlighet att visualisera det vaskulära nätverket i sin helhet, medan sträcker sig till en resolution som innehåller mindre fartyg ^1,2. Dessutom har många vaskulära gjutning förstöra den omgivande vävnaden, vilket förhindrar ytterligare analys av provet ^3-5. En metod som kringgår dessa frågor är mikro-datortomografi (μCT). μCT avbildning kan skanna i upplösningar <10 mikrometer, kan producera 3D-rekonstruktioner av det vaskulära nätverket och lämnar vävnaden intakt för senare analys (t.ex. histologi och morfometri) ^6-11. Kräver dock avbildning fartyg genom ex vivo μCT metoder som fartygen fyllas med en radiopak förening. Som sådan är den exakta återgivning av kärl som produceras av μCT avbildning knutentillförlitlig och fullständig fyllning av fartygen. I detta protokoll, beskriver vi en teknik för att fylla mus kranskärlen som förberedelse för μCT avbildning.

Två dominerande tekniker finns för att fylla kranskärlen: in vivo via kanylering och retrograd perfusion av aortan (eller en gren i aortabågen) ^12-14, eller ex vivo genom en Langendorff-perfusion systemet ^15-17. Här beskriver vi en in vivo-aorta kanylering metod som är speciellt utformade för att säkerställa fyllning av alla fartyg. Vi använder en låg förening viskositet röntgentät kallas mikrofilter som kan perfundera igenom minsta fartygen för att fylla alla kapillärerna, samt både arteriella och venösa sidan av vaskulära nätverket. Kärlen perfuserades med buffert med användning av en trycksatt perfusionssystem, och fylldes sedan med mikrofilter. För att säkerställa att mikrofilter fyller de små högre motstånd fartyg ligera vi stora grenar emanating från aorta, vilken avleder mikrofilter i kranskärlen. När fyllning är klar, för att förhindra den elastiska natur hjärtvävnad från att klämma mikrofilter av vissa fartyg, underbinda vi tillgängliga större vaskulära uttagspunkter omedelbart efter påfyllning. Därför är vår teknik optimerad för fullständig fyllning och maximal retention av fyllmedel, vilket möjliggör visualisering av hela koronar vaskulära nätverk – artärer, kapillärer och vener lika.

Protocol

1. Förberedelser innan du börjar Fylla varje sida av det tryck perfusionsapparat med Kärlvidgande medel-buffert (4 mg / L Papaverin + 1 g / L Adenosin i PBS) eller 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS, respektive. Förbered en 1/2cc insulinspruta (med en permanent fastsatt 29G ½ "nål) genom att fylla den med 0,1 ml 1:100 Heparin (5000E/ml materiel) och böja nålen till ~ 120 graders vinkel med avfasningen uppåt. Gör det samma sak med en 1 ml spruta (med en 26G ½ "nål) fylld med 0,3 ml …

Discussion

Hjärtvävnad har en mycket hög metabolisk efterfrågan, och därför kräver en konstant tillförsel av näringsämnen och syre från blodet levereras av kranskärlen. Sjukdomar i hjärtats kranskärl, vilket minskar koronar funktion på grund av fartygets stenos och blockering, kan leda till hypoxi och ischemi, och sätta drabbade patienter med risk för hjärtinfarkt och irreparabel skada på hjärtmuskeln. En bättre förståelse av den sjuka tillståndet för dessa fartyg är nödvändigt och avgörande för vår …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
1 ml syringes	Becton Dickinson	BD-309602
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles	Becton Dickinson	BD-309306
2″ x 2″ Gauze pads	Med101store.com	SKU 2208
24G ¾” Angiocath IV catheter	Becton Dickinson	BD-381112
26G ½”gauge needles	Becton Dickinson	BD-305111
Adenosine	Sigma	A9251	1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile	Cardinal Health	C15055-006
Curved Surgical Scissors	Fine Science Tools	14085-09
Dissecting stereoscope and light source	Nikon	NA	NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches	Cole-Parmer	YO-10915-12	Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps	Aesculap	FD281R	Need two
Heparin, 5000 U/ml stock	APP Pharmaceuticals LLC	NDC 63323-047-10	1:100 dilution in water
KCl	Fisher	P217	Saturated solution in H2O
Ketamin  (Ketaset), 100 mg/ml stock	Fort Dodge, Overland Park, KS, USA	NDC 0856-2013-01	Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil	Flow Tech	MV-122 (yellow). Other color options are also available.	Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk	Harvard Apparatus	723287
Papaverine	American Regent Inc.	NDC 0517-4010-01	4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus			See figure 2
Spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock	Lloyd Labs	NADA #139-236	Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline