Visualisering av kranskärlen är avgörande för att öka kunskaperna om hjärt-kärlsjukdomar. Här beskriver vi en metod för perfusion murin kranskärlen med en röntgentät silikongummi (mikrofilter), som förberedelse för mikro-datortomografi (μCT) avbildning.
Visualisering av kärlsystemet blir allt viktigare för att förstå många olika sjukdomstillstånd. Medan flera tekniker finns för avbildning kärlsystemet, några har möjlighet att visualisera det vaskulära nätverket i sin helhet, medan sträcker sig till en resolution som innehåller mindre fartyg 1,2. Dessutom har många vaskulära gjutning förstöra den omgivande vävnaden, vilket förhindrar ytterligare analys av provet 3-5. En metod som kringgår dessa frågor är mikro-datortomografi (μCT). μCT avbildning kan skanna i upplösningar <10 mikrometer, kan producera 3D-rekonstruktioner av det vaskulära nätverket och lämnar vävnaden intakt för senare analys (t.ex. histologi och morfometri) 6-11. Kräver dock avbildning fartyg genom ex vivo μCT metoder som fartygen fyllas med en radiopak förening. Som sådan är den exakta återgivning av kärl som produceras av μCT avbildning knutentillförlitlig och fullständig fyllning av fartygen. I detta protokoll, beskriver vi en teknik för att fylla mus kranskärlen som förberedelse för μCT avbildning.
Två dominerande tekniker finns för att fylla kranskärlen: in vivo via kanylering och retrograd perfusion av aortan (eller en gren i aortabågen) 12-14, eller ex vivo genom en Langendorff-perfusion systemet 15-17. Här beskriver vi en in vivo-aorta kanylering metod som är speciellt utformade för att säkerställa fyllning av alla fartyg. Vi använder en låg förening viskositet röntgentät kallas mikrofilter som kan perfundera igenom minsta fartygen för att fylla alla kapillärerna, samt både arteriella och venösa sidan av vaskulära nätverket. Kärlen perfuserades med buffert med användning av en trycksatt perfusionssystem, och fylldes sedan med mikrofilter. För att säkerställa att mikrofilter fyller de små högre motstånd fartyg ligera vi stora grenar emanating från aorta, vilken avleder mikrofilter i kranskärlen. När fyllning är klar, för att förhindra den elastiska natur hjärtvävnad från att klämma mikrofilter av vissa fartyg, underbinda vi tillgängliga större vaskulära uttagspunkter omedelbart efter påfyllning. Därför är vår teknik optimerad för fullständig fyllning och maximal retention av fyllmedel, vilket möjliggör visualisering av hela koronar vaskulära nätverk – artärer, kapillärer och vener lika.
Hjärtvävnad har en mycket hög metabolisk efterfrågan, och därför kräver en konstant tillförsel av näringsämnen och syre från blodet levereras av kranskärlen. Sjukdomar i hjärtats kranskärl, vilket minskar koronar funktion på grund av fartygets stenos och blockering, kan leda till hypoxi och ischemi, och sätta drabbade patienter med risk för hjärtinfarkt och irreparabel skada på hjärtmuskeln. En bättre förståelse av den sjuka tillståndet för dessa fartyg är nödvändigt och avgörande för vår …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Kelly Stevens för de första försöken av protokollet, Dr Michael Simons, Dr Kip Hauch, och medlemmar av båda sina labb för allmän diskussion.
Detta arbete är stöd från NIH bidrag HL087513 och P01 HL094374.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
1 ml syringes | Becton Dickinson | BD-309602 | |
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles | Becton Dickinson | BD-309306 | |
2″ x 2″ Gauze pads | Med101store.com | SKU 2208 | |
24G ¾” Angiocath IV catheter | Becton Dickinson | BD-381112 | |
26G ½”gauge needles | Becton Dickinson | BD-305111 | |
Adenosine | Sigma | A9251 | 1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine) |
Angled Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
Cotton-tipped applicators: 6″ non-sterile | Cardinal Health | C15055-006 | |
Curved Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14085-09 | |
Dissecting stereoscope and light source | Nikon | NA | NA |
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches | Cole-Parmer | YO-10915-12 | Filled with tar for pinning down the mouse |
Fine Curved Forceps | Aesculap | FD281R | Need two |
Heparin, 5000 U/ml stock | APP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-047-10 | 1:100 dilution in water |
KCl | Fisher | P217 | Saturated solution in H2O |
Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock | Fort Dodge, Overland Park, KS, USA | NDC 0856-2013-01 | Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline |
Microfil | Flow Tech | MV-122 (yellow). Other color options are also available. | Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed |
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk | Harvard Apparatus | 723287 | |
Papaverine | American Regent Inc. | NDC 0517-4010-01 | 4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine) |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Prepared as 4% solution |
Perfusion Apparatus | See figure 2 | ||
Spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock | Lloyd Labs | NADA #139-236 | Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline |