Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

Summary

We presenteren een methode om een ​​beeldvorming raam in de muis schedel die millimeter overspant en is stabiel gedurende maanden zonder ontsteking van de hersenen vormen. Deze methode is zeer geschikt voor longitudinale studies van de bloedstroom, cellulaire dynamiek en cel / vasculaire structuur met behulp van twee-foton microscopie.

Abstract

In vivo beeldvorming van corticale functie vereist optische toegang tot de hersenen, zonder verstoring van de intracraniële omgeving. We presenteren een methode om een ​​gepolijste en versterkte verdund schedel (poorten) venster te vormen in de muis schedel die enkele millimeters in diameter overspant en is stabiel voor maanden. De schedel verdund 10 tot 15 urn dik een draagbare boor optische helderheid bereiken en vervolgens bedekt met cyanoacrylaatlijm en een dekglas: 1) voorzien stijfheid, 2) remmen been hergroei en 3) te verminderen lichtverstrooiing onregelmatigheden op het botoppervlak. Omdat de schedel niet wordt doorbroken, is een ontsteking die het proces wordt bestudeerd van invloed kunnen zijn sterk verminderd. Imaging tot een diepte van 250 pm onder de corticale oppervlak kan worden bereikt met behulp van twee-foton laser scanning microscopie. Dit venster is zeer geschikt voor cerebrale doorbloeding en cellulaire functie te bestuderen in zowel onder narcose en wakker preparaten. Het biedt verder de opprima gelegenheid om cel-activiteit met behulp van optogenetics te manipuleren of de bloedstroom in gericht schepen verstoren door bestraling van circulerende fotosensitizers.

Protocol

1. Voorbereiding voor Chirurgie ⁱ

1. Maak de chirurgische instrumenten door sonicatie in een mengsel van Maxizyme en Chirurgische Melk in een ultrasone reiniger. Autoclaaf de chirurgische instrumenten voor elk experiment.
2. Zorg ervoor dat alle benodigde reagentia en disposables beschikbaar zijn. Een lijst van reagentia en disposables wordt gegeven in tabel 2. Reagentia en disposables die in contact komen met zichtbare weefsel moet steriel zijn, indien mogelijk.
3. Laten verdoving. Typische anesthetica voor overleving studies worden in Tabel 1. Zorg voor chirurgische vlak van anesthesie door te controleren op het ontbreken van teen knijpen reflex. De optimale leeftijd van de muis is 3 tot 6 weken oud zijn. De schedels van jonge muizen zijn zachter en moeilijker te dun. Oudere muizen hebben dikkere schedel dat er meer zullen bloeden tijdens het dunner procedure.
4. Zet het dier in een stereotaxisch frame ^1. Een lijst van chirurgische instrumenten in Tabel 2.
5. Houd de lichaamstemperatuurtuur bij 37 ° C met behulp van een feedback gereguleerd rectale sonde en warmte pad.
6. Breng oogzalf voor de ogen om vocht vast te houden.
7. Scheer de hoofdhuid met een kleine elektrische scheermes.
8. Reinigen hoofdhuid met Betadine, gevolgd door deppen met 70% (v / v) isopropanol.
9. Indien gewenst, controleer dan of hartslag en ademhaling zijn binnen een normale bereik met behulp van een saturatiemeter. Voor een muis, deze nummers moet het centrum ongeveer 10 en 2 Hz, respectievelijk.
10. Warm een hoeveelheid van steriel gefiltreerd kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) tot 37 ° C (125 mM NaCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 3,1 mM _CaCl2, 1,3 mM _MgCl2, pH 7,4) (alle chemicaliën uit Sigma) ^2.

2. Montage van een Hoofd Kader

1. Verwijder de hoofdhuid over het gehele dorsale schedel oppervlak met een pincet en chirurgische schaar. Snijd de huid zijkanten aan de randen van de tijd spieren aan weerszijden van de schedel en naerior naar de spieren van de nek (afb. 1A).
2. Gebruik een scalpel de dunne periosteum uit het oppervlak van de schedel.
3. Maak de schedel met een vochtige katoenen getipt applicator en droog de schedel oppervlak met een stroom van lucht uit een stof kan. Breng vervolgens een dun laagje cyanoacrylaat lijm op de hele schedel oppervlak. Laat de lijm goed drogen. Deze lijmlaag wordt vereist voor een goede hechting van de tand cement in opeenvolgende stappen. De cyanoacrylaatlijm niet te worden gesteriliseerd.
4. Voeg een metalen connector de schedel oppervlak uit de buurt van het gewenste venster. Voor de narcose preparaten, kan een kleine moer worden bevestigd aan de schedel met een schar van cyanoacrylaat lijm, die later kunnen worden vastgeschroefd in de imaging-setup met een bout (afb. 1B, 1L en 1N). Sluit de achterzijde van de moer met tape om ervoor te zorgen dat de lijm niet de draden in te voeren tijdens de gehechtheid aan de schedel. De moer en tape worden gesteriliseerd de autoclaaf voor chirurgie.
5. Voor wakker beeldvorming voorbereidingen, sluit een meer rigide aangepaste connector met twee bevestigingspunten (afb. 1M en 1N). Boor twee gaten in de schedel boven de contralaterale corticale halfrond met een ½ mm boor bramen, en dan worden twee # 000 zelftappende schroeven. Deze schroeven zal helpen verankeren het hoofd te monteren aan de schedel. Breng slechts een volledige omwenteling van de schroef om te voorkomen uitoefenen van druk op de onderliggende cortex. Vervolgens bevestigt u de op maat gemaakte metalen kruis bar met een klein beetje van cyanoacrylaat lijm over de kleine hersenen. Laat de cyanoacrylaat lijm goed drogen. Deze metalen connector vermindert de mate van vrijheid en vereenvoudigt verplaatsing van dezelfde beeldvorming veld in longitudinale studies. Een brede dwarsbalk geeft voldoende ruimte voor plaatsing van de elektroden en het stimuleren van vibrissae. Gedetailleerde plannen voor het genereren van de aangepaste kop mount en gehechtheid apparaat zijn online beschikbaar (SICS / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). De schroeven en dwarsbalk moet worden gesteriliseerd in de autoclaaf voorafgaand aan de operatie.
6. De gehele oppervlak schedel, exclusief de locatie van het venster met een laag tandheelkundige cement (Fig. 1C en 1D). Zorg ervoor dat alle blootgestelde randen van de huid worden gedekt door cement. De componenten van de tandheelkundige cement hoeven niet te worden gesteriliseerd.

3. Het genereren van een gepolijste en versterkt verdund-schedel (poorten) Window

1. Zorg ervoor dat de boor bramen scherp zijn en voorkomen dat opnieuw te gebruiken. Met behulp van een lage snelheid op de tandartsboor, dunne een 2 mm bij 2 mm regio over de somatosensorische cortex met een ½ mm braam. Schakelen tussen het bevochtigen van de schedel met ACSF en dan het drogen van de schedel oppervlak met een zachte stroom van lucht uit een gas stofdoek, nat voor koeling, en droog te verdunnen. Dit vereist dunner door het trabeculair laag van de schedel, die kunnen bloeden, maar kan controll wordened door te spoelen met ACSF (fig. 1E). De schedel begint te buigen onder de lichte druk van de boor als het ~ 50 um, en de pial vaartuigen moeten zichtbaar zijn door natte bot (fig. 1F). Bij deze dikte zullen witte plekken in het bot zichtbaar enkele seconden onmiddellijk na het droge schedel oppervlak bevochtigd.
2. Op dit punt dunne het bot verder. Gebruik een langzamere boor snelheid, dat wil zeggen, 1000 rpm, waarbij de schedel oppervlak scheert met slechts een lichte aanraking. Gebruik kleine gecontroleerde bewegingen, terwijl de boor als een pen en enige kracht toe te passen in de laterale richting. Het bot moet 10 tot 15 urn worden op ~ op de uiteindelijke dikte (fig. 1G). Wanneer het bot voldoende dun is, zal de kleine witte vlekken in het bot niet meer zichtbaar zijn wanneer de droge schedel oppervlak wordt bevochtigd.
3. Poets het venster regio met tin oxide poeder. Bevestig een vooraf gemaakte boor die is gedrenkt in siliconen aquarium kit en metgetrokken, waardoor een taps toelopende zweep (inzet, Fig. 1H). De siliconen zweep moet bereid zijn minstens een dag voor de operatie, en gesteriliseerd met 70% isopropanol voor gebruik. Leg een klein snufje poeder op het raam, samen met een daling van ACSF (fig. 1H). Schud de mest over het venster voor maximaal tien minuten zachtjes aanraken van het punt van de bewegende zweep om de schedel oppervlak. Spoel weg tin oxide poeder goed uit het raam met behulp van ACSF en droog het bot met een zachte luchtstroom. Oppervlakte onregelmatigheden en aanhanger botsplinters achtergelaten door het boren in de vorige stappen dient te worden verwijderd na het polijsten (fig. 1H en 1I). De tinoxidepoeder niet te worden gesteriliseerd.
4. Afgesneden stukjes niet. 0 afdekglas iets kleiner dan de grootte van het venster. Gebruik een schrijver om voorzichtig gescheiden horizontale en verticale lijnen scoren in het deksel slip met een rechte rand. Plaats vervolgens het deksel slip in een petrischaal en knock de schotel tegen een tafelrand om het glas stukken te scheiden. De gehele petrischaal kan dan worden geautoclaveerd de steriliteit te verzekeren.
5. Plaats een juiste maat dekglas de buurt van de gedroogde venster. Breng een kleine schar van cyanoacrylaat lijm over de ruit met de punt van een gebroken houten wattenstaafje applicator, en snel druk op de voorgesneden stuk dekking van glas boven op de lijm. Zorg dat er geen luchtbellen onder het dekglas. Duw het deksel glas tegen de schedel oppervlak, en houd een paar seconden (fig. 1J en 1O). Laat de lijm goed drogen meer dan 15 minuten. Overtollig cyanoacrylaatlijm kan worden verwijderd van het bovenvlak van het deksel glas met een scalpel na het drogen. De randen van het dekglas met tandheelkundige cement en vormen een enigszins verhoogd tot en water te houden voor de onderdompeling lens (Fig. 1K en 1O).

4. Herstel

1. Plaats het dier in een warme kooi na de operatie. Controleer dedier regelmatig tot het herstelt volledig van anesthesie.
2. Indien het preparaat bedoeld de meer dan een dag voorzien buprenorfine (0,03 pg per g knaagdier) analgesie. We typisch beeld van het dier ten minste een dag na de eerste implantatie.

5. Imaging Voorbereiding

1. Stabiliseer het dier op een optische breadboard voor beeldvorming, met behulp van het frame als een hoofdsteun (afb. 1L en 1M). Een bevestigingssysteem inrichting kan worden gemaakt van in de handel verkrijgbaar optomechanische componenten van Qioptiq of Thorlabs. Onze afzonderlijke plaat kan worden getransporteerd tussen chirurgische en twee-foton beeldvorming suites met het dier en alle fysiologische monitoring apparaten gemonteerd als een eenheid ^3.
2. Als de bloedstroom beeldvorming gewenst injecteren 0,05 ml 5% (w / v) fluorescerende dextran kleurstof opgelost in steriele zoutoplossing hetzij via de staartader of infraorbitale ader het bloed serum (Fig. 2A en 2C te labelen 2H 4-7. Dit moet gebeuren onder algemene verdoving. Infraorbitale veneuze toediening kan makkelijker zijn voor beginners, zoals dextran oplossingen meer viskeus. De staart ader kan moeilijk zijn te vinden in het donker gekleurde muizen, en de ader heeft de neiging in te storten na een mislukte injectie. Voor de beeldvorming vasculatuur met groene emissie, gebruik dan een fluoresceïne-isothiocyanaat dextran. Voor rode emissie, gebruik maken van een Texas Red dextran. Met een hoog molecuulgewicht dextranen wordt de kleurstof in omloop enkele uren. Als alternatief kunnen dieren endogene fluorescerende labels direct afgebeeld op de juiste twee foton excitatiegolflengte. De dextran oplossing kan bevroren monsters voor toekomstig gebruik.
3. Voorzichtig het raam oppervlak schoon met een vochtige katoenen getipt applicator.
4. Bij langdurig beeldvorming van verdoofde preparaten, injecteren steriele Ringer's lactaat-oplossing intraperitoneaal op een volume van 3 il per gram om de 2 uur aan het lichaam van vocht en energie-eisen te handhaven. </ Li>
5. Bij beeldvorming dieren in de wakkere staat, te beperken hoofdsteun naar een paar uur op een tijd om stress te verminderen. Breng het dier naar de kooi tussen de beeldvorming sessies voor voedsel en water.

6. Representatieve resultaten

Een succesvolle venster kunt beeldvorming tot een diepte van 250 pm onder de pial oppervlak voor een aantal maanden. Deze methode is gebruikt om in vivo capillaire bloedstroom ^{4, 8,} microglia activatie ^{8, 9,} en dendritische structuur te onderzoeken binnen het corticale parenchym ^8. In een voorbeeld maken we gebruik van twee-foton beeldvorming van de corticale vaatstelsel van een verdoofde Thy1-geel fluorescerend eiwit (YFP) muis laten zien, na het bloedserum wordt aangeduid door middel van intraveneuze injectie van Texas Red dextran (Fig. 2A). Dural schepen zijn vaak zichtbaar iets boven de corticale oppervlak in de dura mater (fig. 2C, pijl). Grote pial arteriolen en venulen lie de corticale oppervlak (fig. 2D). Indringende schepen tak van dit oppervlak netwerk en duik in de cortex, waar ze vertakken tot een dichte capillaire bed dat de corticale weefsel voedt (fig. 2E tot 2H). Dendritische cilinders van diepe YFP uiten corticale neuronen, een signaal endogene om deze muis te lijn, gelijktijdig kunnen worden afgebeeld in een tweede kanaal ¹⁰ (Fig. 2B tot 2H). De tweede harmonische signaal van het bot werd verzameld in een derde kanaal, en kan worden gebruikt om de dikte van de verdunde schedel na verzameling beeld stapels (Fig. 2A 2C) te meten.

Corticale vasculaire dynamiek hoge mate beïnvloed door anesthetica ^11. In een tweede voorbeeld, tonen we een video van spontane vasoactivity verzameld door twee-foton microscopie van een gewende wakker muis. Prominente vasomotorische oscillaties in het lumen diameter worden gezien met een pial arteriole, maar niet met een naburig venule. Dezebasale reeks vasoactivity vermindert met urethaan anesthesie ^4. Om spontane en opgewekte veranderingen in de bloedstroom te kwantificeren maken we gebruik van aangepaste lijn scanning technieken om zowel de vasculaire diameter en rode bloedcellen snelheid van individuele vaartuigen vast te leggen. Gedetailleerde middelen op kwantitatieve bloedstroom beeldvorming met behulp van twee-foton microscopie zijn ^{3, 12.}

Figuur 1. Procedure voor een ports venster. (A K) afbeeldingen van opeenvolgende stappen van de procedure voor het genereren een ports venster. Zie de tekst voor gedetailleerde instructies. β = bregma en λ = lambda. (L) Bout en moer systeem voor het vastzetten van het hoofd tijdens beeldvorming van verdoofd preparaten. (M) op maat bewerkt dwarsbalk hoofd houder voor wakker preparaten. In dit voorbeeld werd een connector ook geïmplanteerd herhaalde electrocorticogram opnamen. (N)Schematische weergave van dorsaal aanzicht van de kop berg en de positie van verschillende onderdelen. De moer wordt gebruikt in het paneel L is bedoeld als alternatief voor de dwarsbalk met behulp van in het paneel M. Two # 000 zelftappende schroeven worden toegevoegd met het kruis bar houder voor extra stabiliteit met wakker beeldvorming voorbereidingen. (O) Schematische weergave dwarsdoorsnede van een ports venster.

Figuur 2. Twee-foton beeldvorming van bloedvaten en neuronale structuur in de muis cortex. Alle beelden werden verzameld door middel van een ports venster in een Thy1-YFP muis op 2 dagen na implantatie venster ^10. Maximale projectie 150 pm van weefsel in het frontale oriëntatie met de verdunde schedel ten opzichte van de vasculatuur (A) en dendrieten (B). Het bot (blauw) werd gedetecteerd door het verzamelen van de tweede harmonische fluorescentie bij 450 nm emissie met 900 nm excitatie 6. De dendritische velden van de neuronen (groen) zijn endogene aan de Thy1-YFP transgene muizen lijn. (CH) maximale projecties meer dan 50 micrometer van weefsel in de horizontale richting op verschillende dieptes onder de pia. Data is van dezelfde afbeelding stapel getoond in panelen A en B. Dural vaartuigen mogen zichtbaar zijn net boven het corticale oppervlak (pijl in C).

Afkortingen

ACSF = kunstmatige cerebrospinale vloeistof
Poorten = gepolijst en versterkte uitgedund schedel venster
YFP = geel fluorescerend eiwit

ⁱ Zorg ervoor dat de beschreven procedures worden door de lokale Institutional Animal Care en gebruik Comite.

Discussion

Twee-foton imaging door een ports raam vereist transmissie via de verdunde bot en de duur, dat het laserlicht verzwakt en voegt optische aberraties op grotere diepte ^8. Ondanks dit nadeel kan beeldvorming diepte van 250 pm onder het oppervlak pial worden bereikt met 900 nm excitatie. Grotere diepten beeldvorming kan in principe mogelijk meer excitatiegolflengten ^13. Een groot voordeel van deze methode is de afwezigheid van corticale ontsteking die tijdelijk zou kunnen bestaan ​​in methoden met volledige craniotomie ^{14, 15.} Een goed voorbereide HAVENS venster mogen geen duidelijke tekenen van angiogenese of ontsteking na implantatie ^8. Dit kan in vivo worden bepaald tijdens het experiment imaging vasculatuur structuur of door het detecteren morfologische veranderingen microglia in de CX (3) CR1-GFP mouse ^{8, 16, 17.} Verder moet post hoc immunohistologische zijn pergevormd om de afwezigheid van astrogliose bevestigen de oppervlakkige cortex, bijvoorbeeld met een antilichaam voor gliacellen fibrillaire zure eiwit ^8.

De zwaarste stap het genereren van een POORTEN venster dunner het bot 10 tot 15 urn dik. Periodiek onderzoek van het venster onder een breed terrein fluorescentie dissectie microscoop is ook nuttig om de schedel dikte te meten tijdens het dunner procedure. Fluorescerende labels de buurt van de corticale oppervlak moet duidelijk zichtbaar zijn door de natte schedel. Voor een nauwkeurige meting van de schedel dikte, de tweede harmonische signaal van het bot worden gemeten in een drie-dimensionale stapel onder twee foton microscopie (Fig. 2A 2C). Als dit voor gedaan aanbrengen van de lijm en dekglas, het bot en kan verder worden verdund indien nodig. Onvoldoende dunner resulteert in een slechte beeldvorming diepte. Polijsten zal de schedel te verdunnen bij het boren is niet meer mogelijk is, en zal helpenverminderen oneffenheden en aanhanger botsplinters. In voorafgaande studies, hebben we ontdekt dat het polijsten verbetert de beeldvorming diepte weken na de eerste implantatie. Echter, een nauwkeurige analyse van het voordeel van polijsten niet uitgevoerd.

De toepassing van cyanoacrylaat lijm en dekking van glas boven op het bot is een cruciale stap om lichtverstrooiing te verminderen en zorgen voor diepere beeldvorming. Door het boren, wordt het oppervlak van het bot onregelmatig, zelfs na polijsten en dus lichtverstrooiing. De toepassing van cyanoacrylaatlijm vult deze onregelmatigheden en het overliggende afdekglas laat een niet-verstrooiende glad oppervlak. Belangrijk is de brekingsindex van de lijm en afdekglas die 1,45 en 1,52 zijn volgens specificaties van de fabrikant, nauw overeen met die geïndexeerd van bot 1,55 ^18. Dit is een verbetering met lucht of water boven de verdunde schedel, welke brekingsindices van 1,00 hebbend 1.33. Kritisch, de cyanoacrylaat lijm helpt verder te belemmeren bot hergroei. Hierdoor longitudinale imaging tot drie maanden zonder extra onderhoud na de eerste operatie.

Een tweede oorzaak van een slechte beeldvorming diepte is schade aan pial schepen die leiden tot bloedingen of oedeem. Trillingen van de boor moet worden geminimaliseerd. In een klein deel van de gevallen zal bloeden binnen de dura onvermijdelijk zijn. Dit komt omdat het vaatstelsel van de dura mater continu met vasculaire plexus van de schedel, welke verstoord tijdens het dunner procedure. Preparaten met een teken van sub-durale bloedingen dient te worden weggegooid als durale verdikking en angiogenese zal volgen. Het slagingspercentage van de havens venster kan oplopen tot 80% met de praktijk.

Voor sommige experimenten kan het nodig zijn kleurstoffen / virussen injecteren of elektroden te voegen in het weefsel onder de poorten venster. Het is mogelijk om een ​​kleinegat grenzend aan het venster, waardoor pipetten of elektroden kan worden gebracht met een stereotaxisch arm of Sutter manipulator ^19. Dit gat kan worden afgesloten met bot was als het dier opnieuw worden afgebeeld in de toekomst sessies. Echter, de introductie van de elektroden kan natuurlijk leiden tot ontsteking in de cortex en acute pathologie zoals het verspreiden van depressie.

De Ports venster moet goed geschikt voor elke beeldvormende modaliteit die optische toegang tot de hersenen. Dit geldt ook voor beeldvorming aan het oppervlak technieken zoals de intrinsieke optische beeldvorming ²⁰ en laser speckle imaging ^21, of optische sectie technieken als confocale ²² of twee-foton microscopie ^23. Verder moet een ports voorbereiding te verbeteren resolutie in brede terrein transcraniële beeldvormende technieken zoals optische coherentie tomografie ²⁴ en fotoakoestische microscopie ^25.

Tot slot, de havens venstergeschikt voor het afbeelden van wakker dieren het dekglas voegt stevigheid het venster ^4. Het hoofd mount wordt verder gestabiliseerd door de introductie van twee zelftappende # 000 schroeven aan de contralaterale hemisfeer voor het aanbrengen van het tandheelkundig cement (afb. 1L). Gewenning aan het hoofd-fixatie is belangrijk om minder verplaatsingen van dieren tijdens de beeldvorming. Een nieuw dier kan geleidelijk worden gewend op hoofdsteunen over een periode van 3 tot 7 dagen voor de beeldvorming, te beginnen met 15 min sessies en werken tot enkele uren.