Summary

Een gepolijste en gewapend verdund-schedel Venster voor de lange termijn beeldvorming van de hersenen van muizen

Published: March 07, 2012
doi:

Summary

We presenteren een methode om een ​​beeldvorming raam in de muis schedel die millimeter overspant en is stabiel gedurende maanden zonder ontsteking van de hersenen vormen. Deze methode is zeer geschikt voor longitudinale studies van de bloedstroom, cellulaire dynamiek en cel / vasculaire structuur met behulp van twee-foton microscopie.

Abstract

In vivo beeldvorming van corticale functie vereist optische toegang tot de hersenen, zonder verstoring van de intracraniële omgeving. We presenteren een methode om een ​​gepolijste en versterkte verdund schedel (poorten) venster te vormen in de muis schedel die enkele millimeters in diameter overspant en is stabiel voor maanden. De schedel verdund 10 tot 15 urn dik een draagbare boor optische helderheid bereiken en vervolgens bedekt met cyanoacrylaatlijm en een dekglas: 1) voorzien stijfheid, 2) remmen been hergroei en 3) te verminderen lichtverstrooiing onregelmatigheden op het botoppervlak. Omdat de schedel niet wordt doorbroken, is een ontsteking die het proces wordt bestudeerd van invloed kunnen zijn sterk verminderd. Imaging tot een diepte van 250 pm onder de corticale oppervlak kan worden bereikt met behulp van twee-foton laser scanning microscopie. Dit venster is zeer geschikt voor cerebrale doorbloeding en cellulaire functie te bestuderen in zowel onder narcose en wakker preparaten. Het biedt verder de opprima gelegenheid om cel-activiteit met behulp van optogenetics te manipuleren of de bloedstroom in gericht schepen verstoren door bestraling van circulerende fotosensitizers.

Protocol

1. Voorbereiding voor Chirurgie i Maak de chirurgische instrumenten door sonicatie in een mengsel van Maxizyme en Chirurgische Melk in een ultrasone reiniger. Autoclaaf de chirurgische instrumenten voor elk experiment. Zorg ervoor dat alle benodigde reagentia en disposables beschikbaar zijn. Een lijst van reagentia en disposables wordt gegeven in tabel 2. Reagentia en disposables die in contact komen met zichtbare weefsel moet steriel zijn, indien mogelijk. Laten verdoving. Typi…

Discussion

Twee-foton imaging door een ports raam vereist transmissie via de verdunde bot en de duur, dat het laserlicht verzwakt en voegt optische aberraties op grotere diepte 8. Ondanks dit nadeel kan beeldvorming diepte van 250 pm onder het oppervlak pial worden bereikt met 900 nm excitatie. Grotere diepten beeldvorming kan in principe mogelijk meer excitatiegolflengten 13. Een groot voordeel van deze methode is de afwezigheid van corticale ontsteking die tijdelijk zou kunnen bestaan ​​in methoden met …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (Post-doctorale beurs te Ays) en de National Institutes of Health (MH085499, EB003832 en OD006831 naar DK). Wij danken Beth Friedman en Pablo Blinder voor commentaar op het manuscript.

Materials

Agent Route of delivery Dose for mouse Duration Notes Source Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal) IP 90 μg/g 15-60 min Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. 036093; Butler Schein 7
Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) IP 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe)
20-30 min Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein 7
Isoflurane (Isothesia) Inhalation 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance 4-6 h. Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. 029403; Butler Schein 26

Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.

ITEM COMPANY CATALOG # / MODEL
Betadine Butler Schein 6906950
Buprenorphine (Buprenex) Butler Schein 031919
Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight Sigma FD2000S
Isopropyl alcohol Fisher AC42383-0010
Lactated Ringer’s Solution Butler Schein 009846;
Lidocaine solution, 2 % (v/v) Butler Schein 002468
Saline Butler Schein 009861
Surgical Milk Butler Schein 014325
Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight Invitrogen D1864
Maxizyme Butler Schein 035646
DISPOSABLES
Carbide burrs, 1/2 mm tip size Fine Science Tools 19007-05
Cottoned tip applicators Fisher Scientific 23-400-100
Cover Glass, no. 0 thickness Thomas Scientific 6661B40
Cyanoacrylate glue ND Industries 31428 H04308
Gas duster Newegg N82E16848043429
Grip cement powder Dentsply 675571
Grip cement solvent Dentsply 675572
Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle Butler Schein 018384
Nut and bolt to secure the head Digikey Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND
Opthalmic ointment Butler Schein 039886
Scalpel blades Fisher Scientific 12-460-448
Screws, self-tapping #000 J.I. Morris Company FF000CE125
Silicone aquarium sealant Perfecto Manufacturing 31001
Tin oxide powder Mama’s Minerals EQT-TINOX
EQUIPMENT
Glass scribe Fisher Scientific 08-675
Dissecting microscope Carl Zeiss OPMI-1 FC
Electric powered drill Foredom or Osada K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada)
Electrical razor Wahl Series 8900
Forceps, Dumont no. 55 Fine Science Tools 11255-20
Feedback regulated heat pad FHC 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07)
Isoflurane vaporizer Ohmeda IsoTec4
Pulse oximeter Starr Life Sciences MouseOx
Screwdriver, miniature Garret Wade 26B09.01
Stereotaxic frame Kopf Instruments Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars)
Surgical scissors, blunt end Fine Science Tools 14078-10
Ultrasonic cleaner Fisher Scientific 15-335-30

Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.

References

  1. Cetin, A. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).
  2. Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex revealed with voltage sensitive dyes. Journal of Comparative Neurology. 375, 89-108 (1996).
  3. Driscoll, J. D., Yuste, R. Quantitative two-photon imaging of blood flow in cortex. Imaging in Neuroscience and Development. , 927-937 (2011).
  4. Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extends arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 108, 8473-8473 (2011).
  5. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678-e678 (2008).
  6. Zhang, S. Rapid reversible changes in dendritic spine structure in vivo gated by the degree of ischemia. Journal of Neuroscience. 25, 5333-5338 (2005).
  7. Takano, T. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 9, 260-267 (2006).
  8. Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
  9. Marker, D. F. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of Visualized Experiments. (43), e2059-e2059 (2010).
  10. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  11. Martin, C. Investigating neural-hemodynamic coupling and the hemodynamic response function in the awake rat. Neuroimage. 32, 33-48 (2006).
  12. Shih, A. Y. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2011).
  13. Kobat, D. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17, 13354-13364 (2009).
  14. Holtmaat, A. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4, 1128-1144 (2009).
  15. Xu, H. T. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10, 549-551 (2007).
  16. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
  17. Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8, 752-758 (2005).
  18. Ascenzi, A., Fabry, C. Technique for dissection and measurement of refractive index of osteons. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 6, 139-142 (1959).
  19. Stosiek, C. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  20. Grinvald, A. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  21. Dunn, A. K. Dynamic imaging of cerebral blood flow using laser speckle. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21, 195-201 (2001).
  22. Villringer, A. Capillary perfusion of the rat brain cortex: An in vivo confocal microscopy study. Circulation Research. 75, 55-62 (1994).
  23. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  24. Srinivasan, V. J. Optical coherence tomography for the quantitative study of cerebrovascular physiology. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31, 1339-1345 (2011).
  25. Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. Journal of Biomedical Optics. 15, 011101-011101 (2010).
  26. Flecknell, P. A. . Laboratory animal anesthesia. , (1987).

Play Video

Cite This Article
Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (61), e3742, doi:10.3791/3742 (2012).

View Video