マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

Summary

我々は、ミリメートルにまたがると、脳の炎症を伴わないヶ月間安定であるマウスの頭蓋骨の画像ウィンドウを形成する手法を提案する。このメソッドは、よく二光子顕微鏡を用いて血流、細胞のダイナミクス、細胞/血管構造の縦断的研究に適しています。

Abstract

皮質機能のin vivoイメージングでは頭蓋内環境を中断することなく、脳への光アクセスする必要があります。我々は、直径数ミリメートルにまたがって、数ヶ月安定であるマウスの頭蓋骨で洗練された補強薄く頭蓋骨（ポート）ウィンドウを形成する手法を提案する。頭蓋骨は、光学的透明性を達成するためにドリルを開催し、シアノアクリレート系接着剤とカバーガラスで覆われている手で厚さ10から15ミクロンまで薄くされています。1）剛性、2を提供する）、骨再生を阻害し、3）光散乱を低減する骨表面の凹凸から。頭蓋骨が破られていないので、検討されてプロセスに影響を与える可能性の炎症が大幅に削減されます。アップ皮質表面下250μmのへのイメージングの深さは、二光子レーザー走査顕微鏡を用いて達成することができます。このウィンドウは、よく麻酔と覚醒の両方準備に脳血流と細胞機能を研究するのに適しています。それはさらにオペアンプを提供していますoptogeneticsを使用して、細胞の活性を操作するか、または循環する光感受性の照射により、標的血管の血流を妨害するportunity。

Protocol

1。手術の準備^I

1. 超音波洗浄器でMaxizymeと外科ミルクの混合物に超音波処理により手術器具をきれいにします。各実験前に、手術器具をオートクレーブします。
2. 必要なすべての試薬と消耗品が使用可能であることを確認してください。試薬や消耗品のリストを表2に記載されています。曝露された組織に接触した試薬および消耗品は、可能な場合は、無菌でなければなりません。
3. 麻酔を誘導する。生存の研究に適した典型的な麻酔薬は、表1に記載されています。つま先ピンチ反射の欠如を確認することにより麻酔の外科的平面を確認してください。マウスの最適な年齢は3から6週間です。若いマウスの頭蓋骨は柔らかく薄いのが難しくなります。古いマウスは、間伐手順の間をもっと出血する厚い頭蓋骨を持っています。
4. 定位フレーム¹に動物を保護します。手術用機器のリストは、表2に記載されています。
5. ボディ温度を維持する37トゥーレ°Cのフィードバック調節直腸プローブと熱パッドを使用します。
6. 水分を保持するために目に眼軟膏を適用します。
7. 小型電気カミソリで頭皮を剃る。
8. 70％（v / v）のイソプロピルアルコールで拭き取り、続いBetadineと頭皮をきれいにします。
9. 必要に応じて、心臓や呼吸速度がパルスオキシメータを使用して正常範囲内にあることを確認してください。マウスでは、これらの数字は、それぞれ約10センターと2 Hzのはずです。
10. 37°C（125 mMのNaCl、10mMのグルコース、10mMのHEPES、3.1 mMのCaCl _2を 、1.3 mMのMgCl _2、pH7.4）中（Sigma社からのすべての化学物質）に滅菌濾過し、人工脳脊髄液（ACSF）のアリコートを温める^2。

2。ヘッドフレームの取り付け

1. ピンセットと手術用ハサミで全体の背側頭蓋骨表面に頭皮を削除します。頭蓋骨の両側の側頭筋のエッジとポストに横方向に皮膚をトリミングする首の筋肉（ 図1A）にerior。
2. 頭蓋骨の表面から薄い骨膜を削除するには、外科用メスの刃を使用しています。
3. 湿った綿で頭蓋骨をきれいにアプリケーターをひっくり返しやほこりができからの空気の流れと頭蓋骨の表面を乾燥させます。その後、全体の頭蓋骨の表面にシアノアクリレート接着剤の薄い層を適用します。接着剤が完全に乾燥することができます。接着剤のこの層は、以降の手順では歯科用セメントの適切​​な遵守に必要とされています。シアノアクリレート系接着剤は滅菌する必要はありません。
4. 離れて目的のウィンドウの領域から、頭蓋骨の表面に金属製のコネクタに取り付けます。麻酔の準備のために、小さなナットは、後でボルトを用いた撮像セットアップ（ 図1B、1Lと1N）にねじ込むこともできシアノアクリレート接着剤のDABと頭蓋骨に固定することができます。接着剤が頭蓋骨に添付中のスレッドに入らないことを確認するためにテープでナットの裏面をシールします。ナットやテープは、滅菌すべきである手術前にオートクレーブによって。
5. 目を覚ましイメージングの製剤は、2つのアタッチメントポイント（ 図1Mおよび1N）とより厳格なカスタムコネクタを接続します。 ½ミリメートルドリルバリと反対側の半球皮質上の頭蓋骨の2つの穴をドリルし、2つの＃000のセルフタッピングネジをご紹介します。これらのネジは頭蓋骨にヘッドマウントを固定するのに役立ちます。基本的な皮質に圧力をかけないようにするために、ネジの唯一つの完全なターンを適用します。その後、小脳上のシアノアクリレート系接着剤の小さなDABとカスタム金属製のクロスバーを取り付けます。シアノアクリレート系接着剤が完全に乾燥することができます。この金属製のコネクタは非常に自由度を減らし、長期的な研究でも同じイメージング分野の再配置を簡素化します。ワイドクロスバーは、電極の配置と鼻毛の刺激のための十分な余地を与えます。カスタムヘッドマウントおよび添付ファイルのデバイスを生成するための詳細な計画は、オンラインで入手できます（SICS / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html）。ネジとクロスバーは、手術前にオートクレーブで滅菌する必要があります。
6. 歯科用セメントの層（ 図1C及び1D）で、ウィンドウの位置を除いて、全体の頭蓋骨の表面をカバーしています。肌の露出エッジはセメントで覆われていることを確認してください。歯科用セメントの成分は、滅菌する必要はありません。

3。ポリッシュの発生と間伐 - 頭蓋骨（ポート）ウィンドウを強化

1. ドリルのバリがシャープであることを確認し、それらを再利用することは避けてください。 ½ミリメートルバリと体性感覚皮質上に2mmの地域別に歯科用ドリルで低速を使用して、薄い2mmである。 ACSFで頭蓋骨を湿潤し、ガスダスターからの空気の穏やかな流れと頭蓋骨の表面を乾燥させるとの間の代替、冷却のためのウェットと、間引きのために乾燥した。これは出血することが頭蓋骨の海綿層を介して間伐が必要ですが、細かく制御することができますACSF（ 図1E）で洗浄によってED。頭蓋骨は、〜50μmであるときに、ドリルのわずかな圧力の下でフレックスを開始し、軟膜血管が濡れた骨（ 図1F）を介して表示されるはずです。この厚さで、骨の中の小さな白い斑点は、乾燥頭蓋骨の表面は湿らされた直後に数秒間表示されるようになります。
2. この時点で、骨の薄い、さらに。わずかなタッチで頭蓋骨の表面を削る低速ドリルの速度、すなわち、1000 rpmを使用しています。ペンのようなドリルを保持しながら、小さな制御された動きを使用してのみ横方向に力を適用します。骨は、その最終的な厚さ（ 図1G）で10から15ミクロン〜ザなければなりません。乾燥頭蓋骨表面を湿らされたときに骨が十分に薄い場合には、骨に小さな白い斑点が見えなくなりません。
3. 酸化スズ粉末とウィンドウ領域を磨く。シリコン水族館シーラントやと浸しました既製ドリルビットを取り付けますテーパー鞭（ 挿入図、図1H）を残して、描画されます。シリコンホイップは、少なくとも一日手術前に準備し、使用する前にイソプロパノール70％滅菌する必要があります。 ACSFの低下（ 図1H）と一緒にウィンドウ上に粉体の小さなピンチを配置します。そっと頭蓋骨表面への移動鞭の先端に触れることによって、最大10分のためにウィンドウの上にスラリーを攪拌してください。 ACSFを使用して、ウィンドウから徹底的に酸化スズ粉末を洗い流すと空気の穏やかな流れで徹底的に骨を乾燥させます。前の手順で掘削によって残された表面の凹凸や接着性の骨チップは研磨（ 図1Hおよび1I）の後に削除する必要があります。酸化スズ粉末を滅菌する必要はありません。
4. なしの正方形の部分を切り取ります。 0はウィンドウのサイズよりもわずかに小さいガラスをカバーしています。穏やかにストレートエッジを使用してカバースリップで区切られた水平線と垂直線を獲得するためにスクライブを使用しています。その後シャーレとKNにカバースリップを置きガラス片を分離するためにテーブルの端に皿をOCK。全体のペトリ皿は、その後無菌性を確保するためにオートクレーブ処理することができます。
5. 適切なサイズのカバーガラス近くの乾燥したウィンドウを配置します。壊れた木製の綿棒の先端を使用してウィンドウ上にシアノアクリレート接着剤の小さなDABを適用し、すぐに接着剤の上のカバーガラスのプレカットピースを押してください。カバーガラスの下に気泡を作成することは避けてください。静かに、頭蓋骨の表面に対してカバーガラスを押し、数秒（ 図1Jと1O）に保持します。接着剤は15分以上かけて徹底的に乾燥させます。それが乾燥された後に過剰なシアノアクリレート接着剤は、手術用メスの刃とカバーガラスの上面から削除することができます。歯科用セメントでカバーガラスの端を密封して形成してわずかに浸漬レンズ（ 図1Kおよび1O）の水を保持するためにも提起した。

4。回復

1. 手術後の暖かいケージに動物を配置します。モニターそれは完全に麻酔から回復するまで定期的に動物。
2. 準備は1日以上生存することを意図されている場合は、鎮痛のためにブプレノルフィンを（gの齧歯類0.03μg）を提供しています。一般的に我々のイメージは、少なくとも一日、最初の移植後の動物。

5。イメージングの準備

1. ヘッドサポート（ 図1Lと1M）などのフレームを使用して、イメージングのための光学ブレッドボード上で動物を安定させます。拘束装置はQioptiqまたはThorLabsから市販されているオプトメカニカルコンポーネントから行うことができます。私たちの独立したプレートは、動物と一つのユニット³のように組み立てられたすべての生理学的モニタリングデバイスと外科と2光子イメージングスイート間で転送することができます。
2. 血流イメージングが必要な場合は、5％の0.05 mLの（w / v）の蛍光デキストラン色素が血液血清（ 図2Aおよび2C 2Hにラベルを付けるためにどちらかの尾静脈または眼窩静脈を通して滅菌生理食塩水に溶解して注入する>）4-7。これは全身麻酔下で行わなければなりません。デキストランのソリューションは、より粘性であるため眼窩静脈投与は、初心者のためのより簡単であるかもしれません。尾静脈は暗く着色されたマウスでは見つけるのが難しくなることができ、静脈注射が失敗した後に崩壊する傾向があります。緑色発光のイメージング血管系については、フルオレセインイソチオシアネートデキストランを使用しています。赤色発光については、テキサスレッドデキストランを使用しています。高分子量のデキストランを使用すると、色素は数時間の循環のままになります。また、内因性の蛍光標識を有する動物は、適切な二光子励起波長で直接撮像することができます。デキストラン溶液は、将来の使用のために分注して凍結することができます。
3. 優しく湿った綿の先端アプリケータとウィンドウの表面を清掃してください。
4. 麻酔の準備の長時間イメージングのための、体液やエネルギーの要件を維持するためにグラム当たり3μLの容量で2時間ごとに無菌の乳酸リンゲル液の腹腔内に注入します。</ LI>
5. ときに覚醒状態のイメージングの動物は、ストレスレベルを低減するために、一度に少数の時間にヘッドレストを制限します。食糧と水のイメージングセッション間でのホームケージに動物を返します。

6。代表的な結果

成功したウィンドウには、数ヶ月のために軟膜表面下250μmで、イメージングの深さを設定できるようになります。このメソッドは、 生体内毛細血管の血流^4、8、ミクログリアの活性化^8、9、皮質実質⁸内の樹枝状構造で勉強するために使用されています。一例では、我々は血清がテキサスレッドデキストラン（ 図2A）の静脈内注射によって標識された後、麻酔THY1-黄色蛍光タンパク質（YFP）マウスの脳血管系を表示するために2光子イメージングを使用しています。硬膜の血管はやや硬膜（ 図2C、矢印 ）で皮質表面上に頻繁に表示されます。大軟膜細動脈と細静脈のLi皮質表面上の電子（図2D）。彼らは皮質組織を供給する緻密な毛細血管床（ 図2Eに2H）に分派する皮質にこの表面のネットワークとダイビングから貫通血管の分岐。皮質ニューロンを表現する深いYFP、このマウスラインへの信号の内因性の樹状アーバーは、第2のチャネル^10（ 図2B 2Hまで ）で同時に撮像することができます。骨の第二高調波信号は、3番目のチャネルで収集され、画像スタックのコレクション（2Cに図2A）の後に薄く頭蓋骨の厚さを測定するために使用することができます。

皮質の血管の動態は、深く麻酔¹¹の影響を受けています。二番目の例では、我々は慣れた目を覚まし、マウスから2光子顕微鏡によって収集された自発的vasoactivityのビデオが表示されます。内腔の直径の著名な血管の振動が軟膜細動脈ではなく、隣接する静脈と見られている。このvasoactivityの基底範囲は、ウレタン麻酔⁴に減少しています。血流の自然および誘発変化を定量化するために、我々は個々の血管の血管径と赤血球速度の両方をキャプチャするように適応ラインスキャン技術を使用しています。二光子顕微鏡を用いて定量的な血流イメージングに関する詳細なリソースは^{、12 3}ご利用いただけます。

図1。 Portsウィンドウの手順。 Portsウィンドウを生成するための手順で操作手順の（Kの）画像。詳細な手順については、テキストを参照してください。 β=ブレグマとλ=λ。麻酔の準備の撮像中に頭部を保護するための（L）ボルトとナットシステム。 （M）カスタム覚醒準備のためのクロスバーヘッドマウントを加工。この例では、コネクタがまた繰り返される脳波の記録に移植した。 （N）回路図は、さまざまなコンポーネントのヘッドマウントおよび位置の背ビューを示している。パネルLで使用されているナットがパネルM.で使用してクロスバーに代わるものとして意図され二つの＃000セルフタッピングネジが目を覚ましイメージング製剤で追加された安定性のためのクロスバーマウントで追加されます。 Portsウィンドウの断面を示す（O）の模式図。

図2。マウス皮質の血管系と神経構造の2つの光子イメージング 。すべての画像は、ウィンドウの移植^10日以降2日目にTHY1-YFPマウスでPortsウィンドウを介して収集された。血管（A）と樹状突起（B）との関係で薄く頭蓋骨を示すコロナの方向で組織の150μmの上の最大投影。骨（青）900 nm励起で450nmの発光で、第二高調波蛍光を収集することによって検出された6で標識した。ニューロンの樹状突起のフィールド（緑）THY1-YFPトランスジェニックマウスのラインへの内因性があります。 PIA以下の異なる深さで水平方向に組織を50μm以上（CH）が最大と予測。データは、パネルに示すように、同じ画像スタックからのものであり、B.硬膜の血管は（Cの矢印 ）だけ皮質表面上に見えるかもしれません。

略語

ACSF =人工脳脊髄液
ポート=洗練された補強薄く頭蓋骨のウィンドウ
YFP =黄色蛍光タンパク質

^私が説明する手順は、あなたのローカル動物実験によって承認されていることを確認し、委員会を使用してください。

Discussion

Portsウィンドウを介して2つの光子イメージングは薄く骨を介して伝送し、レーザ光 ​​を減衰させ、より大きな深さ⁸で光学収差を追加する硬膜を必要とします。しかし、この欠点にもかかわらず、軟膜表面下250μmでのイメージングの深さまでは900 nmの励起を実現することができます。大きな画像の深さは、原則的に¹³より長い励起波長を持つことも可能です。この方法の主な利点は、完全な開頭術^14、15を含む方法で一時的に存在するかもしれない皮質の炎症の欠如です。よく準備Portsウィンドウには、注入⁸次の血管新生や炎症のない明白な徴候を示すべきではありません。これは、イメージング血管構造による実験の過程で、またはCX（3）CR1-GFPマウス⁸行^、16、17におけるミクログリアの形態変化を検出することにより、in vivoで評価することができる。さらに、 事後免疫組織ごとでなければなりませんグリア線維性酸性蛋白質⁸の抗体を用いて、例えば、表面の皮質におけるアストログリオーシスの有無を確認するために形成された。

Portsウィンドウを生成する際に、最も要求の厳しいステップでは、厚さ10から15μmに骨を薄くしています。広視野蛍光解剖顕微鏡下でのウィンドウの定期的な検査でも間伐手順の実行中に頭蓋骨の厚さを測定するのに便利です。皮質表面付近の蛍光標識は、ウェット頭蓋骨を通してはっきりと見えなければなりません。頭蓋骨の厚さのより正確な測定のために、骨からの第二高調波信号は、2つの光子顕微鏡（2Cに図2A）の下で三次元スタックで測定することができます。これは接着剤とカバーガラス、骨のアプリケーションに先立って行われ、必要に応じてさら​​に薄くすることができます。不十分な貧しいイメージング深さの結果を間伐。研磨加工が可能でなくなったとき、頭蓋骨を薄くしていきますと、役立ちます表面の凹凸や接着性の骨チップを減らすことができます。予備研究では、研磨が週最初の注入後の画像の深さを向上させることを発見した。しかし、研磨の利点で厳密な解析が実行されていません。

骨の頂上にシアノアクリレート接着剤とカバーガラスのアプリケーションでは、光散乱を低減し、より深いイメージングを可能にするために重要なステップです。ドリルプロセスのために、骨の表面も研磨した後、不規則であるため、光散乱になります。シアノアクリレート系接着剤のアプリケーションは、これらの凹凸を埋め、上を覆うカバーガラスは、非散乱滑らかな表面を残します。重要なのは、製造元の仕様に従って、1.45、1.52である接着剤とカバーガラスの屈折率は、密接に1.55 ^18歳で骨のそれに一致するインデックスが付けられています。これは1.00の屈折率を持っている間伐頭蓋骨、上記の空気や水を持って改善したものですD 1.33。批判的に、シアノアクリレート系接着剤は、さらに骨の再成長を妨げるのに役立ちます。これは最初の手術後に追加のメンテナンスを必要とせず、3ヶ月までの長手方向のイメージングを可能にします。

貧しいイメージングの深さの第2の原因は、出血や浮腫につながる軟膜血管への損傷である。ドリルからの振動を最小限に抑える必要があります。例の小さな割合では、硬膜内に出血すると避けられないだろう。硬膜の血管が薄く手順の実行中に妨害される頭蓋骨の血管叢との連続であるためです。続くでしょうサブ硬膜出血の兆候とした調製品は、硬膜肥厚、血管新生として廃棄する必要があります。 Portsウィンドウの成功率は実際に80％と高くなることがあります。

いくつかの実験のために、それは染料/ウイルスを注入またはポートのウィンドウの下の組織に電極を挿入する必要があるかもしれません。それは小さなを生成することが可能です。ピペットまたは電極定位腕やサッターマニピュレータ^19を用い^て導入することができるの窓に隣接してホール。動物は、将来のセッションで再度イメージを作成する場合は、この穴は、骨蝋で密封することができます。しかし、電極の導入はもちろん、缶皮質拡延性抑圧などの急性病態における炎症を引き起こす。

Portsウィンドウはよく脳への光アクセスを必要とする画像診断法に適していなければなりません。これは、イメージング^21、またはそのような共焦点²²などの光学セクショニング技術や二光子顕微鏡^23をスペック内因性光学イメージング^20、レーザーなどの表面イメージング技術が含まれています。さらに、ポートの準備は、光コヒーレンストモグラフィー²⁴と光音響顕微鏡²⁵など幅広い分野経頭蓋イメージング技術の分解能を改善する必要があります。

最後に、[ポート]ウィンドウが表示されます。カバーガラスとして覚醒した動物のイメージングに適した、ウィンドウ⁴に剛性を追加します。ヘッドマウントはさらに、歯科用セメントのアプリケーション（ 図1L）に先立って反対側の半球には、2つのセルフタッピングネジ＃000を導入することによって安定化されている。ヘッド固定に慣れ、イメージング中に減少し、動物の動きに重要である。新しい動物が徐々に15分のセッションで開始し、いくつかの時間まで働いて、イメージングの前に3〜7日の期間にわたって頭部拘束に慣れていることができます。