हम एक लिए माउस खोपड़ी है कि मिलीमीटर तक फैला है और मस्तिष्क की सूजन के बिना महीने के लिए स्थिर है में एक इमेजिंग विंडो के रूप में विधि प्रस्तुत करते हैं. इस विधि को अच्छी तरह से दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए रक्त प्रवाह, सेलुलर गतिशीलता, और सेल / संवहनी संरचना की अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अनुकूल है.
के cortical समारोह के vivo में इमेजिंग intracranial पर्यावरण के विघटन के बिना मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल का उपयोग की आवश्यकता है. हम एक माउस खोपड़ी है कि व्यास में कई मिलीमीटर तक फैला है और महीने के लिए स्थिर है में एक पॉलिश और प्रबलित पतला खोपड़ी (बंदरगाहों) खिड़की के रूप में विधि प्रस्तुत करते हैं. खोपड़ी मोटाई में 10 से 15 माइक्रोन के लिए एक हाथ ड्रिल आयोजित करने के लिए ऑप्टिकल स्पष्टता प्राप्त करने के साथ पतला है, और है तो cyanoacrylate गोंद और एक कवर ग्लास से मढ़ा: 1), 2 कठोरता प्रदान करने के लिए) हड्डी regrowth को रोकना और 3) प्रकाश बिखरने को कम हड्डी की सतह पर अनियमितताओं से. के बाद से खोपड़ी का उल्लंघन नहीं है, किसी भी सूजन है कि अध्ययन किया जा रहा है की प्रक्रिया को प्रभावित कर सकता है बहुत कम है. इमेजिंग cortical सतह के नीचे 250 माइक्रोन तक की गहराई दो photon माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. इस विंडो को अच्छी तरह से दोनों संवेदनाहृत और जाग तैयारी में मस्तिष्क रक्त प्रवाह और सेलुलर समारोह का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है. यह आगे सेशन प्रदान करता हैportunity सेल गतिविधि का उपयोग optogenetics हेरफेर करने के लिए या photosensitizers परिसंचारी के विकिरण द्वारा लक्षित वाहिकाओं में रक्त के प्रवाह को बाधित.
दो photon इमेजिंग एक बंदरगाहों खिड़की के माध्यम से पतला हड्डी और ड्यूरा, जो लेज़र प्रकाश attenuates और अधिक से अधिक 8 गहराई में ऑप्टिकल aberrations कहते हैं के माध्यम से प्रसारण की आवश्यकता है. हालांकि, इस खामी के बावज…
The authors have nothing to disclose.
इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (ays के लिए पोस्ट डॉक्टरेट फैलोशिप) और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (MH085499, EB003832, और OD006831 डी.के.) के द्वारा समर्थित किया गया. हम बेथ फ्राइडमैन और पाब्लो अँधेरी पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए धन्यवाद.
Agent | Route of delivery | Dose for mouse | Duration | Notes | Source | Ref Ref |
Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 μg/g | 15-60 min | Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. | 036093; Butler Schein | 7 |
Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) | IP | 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe) |
20-30 min | Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. | (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein | 7 |
Isoflurane (Isothesia) | Inhalation | 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance | 4-6 h. | Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. | 029403; Butler Schein | 26 |
Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.
ITEM | COMPANY | CATALOG # / MODEL |
Betadine | Butler Schein | 6906950 |
Buprenorphine (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight | Sigma | FD2000S |
Isopropyl alcohol | Fisher | AC42383-0010 |
Lactated Ringer’s Solution | Butler Schein | 009846; |
Lidocaine solution, 2 % (v/v) | Butler Schein | 002468 |
Saline | Butler Schein | 009861 |
Surgical Milk | Butler Schein | 014325 |
Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight | Invitrogen | D1864 |
Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
DISPOSABLES | ||
Carbide burrs, 1/2 mm tip size | Fine Science Tools | 19007-05 |
Cottoned tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-100 |
Cover Glass, no. 0 thickness | Thomas Scientific | 6661B40 |
Cyanoacrylate glue | ND Industries | 31428 H04308 |
Gas duster | Newegg | N82E16848043429 |
Grip cement powder | Dentsply | 675571 |
Grip cement solvent | Dentsply | 675572 |
Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle | Butler Schein | 018384 |
Nut and bolt to secure the head | Digikey | Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND |
Opthalmic ointment | Butler Schein | 039886 |
Scalpel blades | Fisher Scientific | 12-460-448 |
Screws, self-tapping #000 | J.I. Morris Company | FF000CE125 |
Silicone aquarium sealant | Perfecto Manufacturing | 31001 |
Tin oxide powder | Mama’s Minerals | EQT-TINOX |
EQUIPMENT | ||
Glass scribe | Fisher Scientific | 08-675 |
Dissecting microscope | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
Electric powered drill | Foredom or Osada | K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada) |
Electrical razor | Wahl | Series 8900 |
Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | 11255-20 |
Feedback regulated heat pad | FHC | 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07) |
Isoflurane vaporizer | Ohmeda | IsoTec4 |
Pulse oximeter | Starr Life Sciences | MouseOx |
Screwdriver, miniature | Garret Wade | 26B09.01 |
Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars) |
Surgical scissors, blunt end | Fine Science Tools | 14078-10 |
Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.