Usando glicosidases específicas para remover a partir de açúcares glicoproteínas seguido por SDS-PAGE é um método valioso para detectar modificações glicano em amostras de proteína e é uma boa escolha para estudos glycobiology inicial. Seguintes alterações deglycosylation podem ser detectados como mudanças na mobilidade gel ou através da coloração com glicano reagentes sensíveis.
Glicosilação, adição de açúcares ligados covalentemente, é uma modificação pós-translacional de proteínas importantes que podem afetar significativamente processos como adesão celular, o tráfico molecular, depuração e transdução de sinal 1-4. Em eucariotos, as modificações mais comuns de glicosilação na via de excreção são adições em consenso resíduos asparagina (N-linked), ou em serina ou resíduos de treonina (O-linked) (Figura 1). Início do N-glicano síntese é altamente conservada em eucariotos, enquanto o produto final pode variar muito entre diferentes espécies, tecidos ou proteínas. Alguns glicanos não haverá alterações ("alta manose N-glicanos") ou são tratados posteriormente no Golgi ("complexo N-glicanos"). Uma maior diversidade é encontrada para O-glicanas, que começam com um comum N-acetilgalactosamina resíduos (GalNAc) em células animais, mas diferem em organismos inferiores 1.
ent "> A análise detalhada da glicosilação de proteínas é um campo em si mesmo e exige muitos recursos e expertise para executar corretamente. No entanto uma variedade de enzimas que removem disponíveis açúcares (glicosidases) torna possível ter uma idéia geral do estado de glicosilação . uma proteína em uma configuração padrão de laboratório Aqui ilustramos o uso de glicosidases para a análise de uma glicoproteína modelo. recombinante gonadotrofina coriônica humana beta (hCGβ), que carrega dois N-glicanos e quatro O-glicanas 5 A técnica requer apenas simples instrumentação e consumíveis típica, e pode ser facilmente adaptado para a análise de amostras glicoproteína múltiplas.Várias enzimas pode ser usado em paralelo para estudar uma glicoproteína. PNGase F é capaz de remover quase todos os tipos de N-glicanos ligados 6,7. Para O-glicanas, não há enzima disponíveis que podem decompor um oligossacarídeo intacto de thbackbone e proteína. Em vez disso, O-glicanas são aparados por exoglycosidases a um núcleo pequeno, que depois é facilmente removido por O glicosidase. O Mix Deglycosylation Protein contém PNGase F, O glicosidase, Neuraminidase (sialidase), β1-4 Galactosidase e β-N-Acetylglucosaminidase. Ele é usado para remover simultaneamente N-glicanos e alguns glicanos O-8. Finalmente, o Mix Deglycosylation foi suplementada com uma mistura de exoglycosidases outros (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 fucosidase, α1-3, 6 Galactosidase e β1-3 Galactosidase), que ajudam a remover monossacarídeos de outra forma resistente, que podem estar presentes em alguns O-glicanas.
SDS-PAGE/Coomasie azul é usado para visualizar diferenças na migração de proteína antes e após o tratamento glicosidase. Além disso, um açúcar específico método de coloração, ProQ Emerald-300, mostra o sinal diminuído como glicanos são successively removido. Este protocolo é projetado para a análise de pequenas quantidades de glicoproteína (0,5 a 2 mg), embora deglycosylation enzimática podem ser ampliados para acomodar grandes quantidades de proteína, conforme necessário.
O método descrito aqui, usando deglycosylation enzimática e SDS-PAGE pode fornecer informações valiosas sobre o estado de glicosilação de uma proteína de interesse, enquanto glicano-reagentes específicos facilitar a interpretação dos dados. Este protocolo destina-se para os estudos iniciais da glicosilação de proteínas e é particularmente adequada para secretoras e glicoproteínas da membrana de células de mamíferos: as enzimas escolhido, neste caso, especificamente remover todas as N-glicanos, e ou N-glicanos mais e os açúcares mais comuns ampliar e formar o núcleo de O-glicanas. Glicosidases têm a vantagem adicional de ser leve, em comparação com métodos químicos deglycosylation, preservando a integridade de ambos os açúcares e proteínas backbone.
Para elucidar a taxa de ocupação (que aminoácidos são glicosilada), extensão de glicosilação, ou para determinar a estrutura fina de glicanos, técnicas mais sofisticadas, como mespectrometria de bunda, cromatografia líquida ou RMN são obrigatórios.
Devido à sua simplicidade, vários passos neste protocolo pode ser ajustado, substituídos e / ou combinados para acomodar várias necessidades experimental. No entanto, a fim de obter resultados que podem ser claramente interpretado é importante para entender seus pontos fortes e limitações. Primeiro, a especificidade e pureza do glicosidases são cruciais: apenas enzimas bem caracterizados testado para ser livre de proteases e outras atividades de contaminação devem ser usados. Infelizmente, não há uma definição unidade padrão enzimático para glicosidases, o usuário deve determinar a substituição apropriada de acordo com as especificações do fabricante. Segundo, uma escolha cuidadosa de detecção é necessário: a) reagentes de coloração de proteínas são úteis somente se os resultados deglycosylation em uma mudança significativa na massa molecular. Um resultado tão claro como mostrado aqui nem sempre é obtida. Em outros casos, vimos mi anormalgração após deglycosylation (longe do peso previsto molecular, ou a migração ainda mais lento). Este fenômeno não é bem compreendida, mas pode-se dizer que qualquer alteração na migração evidências de que a proteína tem sido deglycosylated. B) detecção de anticorpos com Açúcar apresenta desafios únicos limitando a sua aplicabilidade. Tem sido muito difícil gerar geral anti-glicano anticorpos, que são geralmente levantadas contra um alvo glicano complexo, o que restringe seu uso. Além disso, vários monoclonal anti-glicano anticorpos exibir reatividade cruzada indesejada 10. C) As lectinas (proteínas com afinidade intrínseca de açúcar) são adequados para a detecção de açúcar, mais eles dão uma visão sobre a estrutura de glicano. No entanto, nem todos eles têm uma especificidade estreita, e muitos são apenas parcialmente caracterizada (o que significa que eles poderiam ter afinidades desconhecido). Como conseqüência coloração lectina positivo fornece uma indicação, não uma prova da presença de um soldadoven açúcar. d) kits rotulagem química (com base na oxidação periodato de açúcares) são o método de escolha para manchar todas as glicoproteínas, e, portanto, bem adequado a seguir deglycosylation.
Ao processar uma amostra desconhecida, é uma boa prática para incluir controles glicoproteína. Fetuína é um N prontamente disponível – e O-glicoproteína, gonadotrofina coriônica (ambas subunidades) também é uma boa escolha. Albumina de soro bovino (BSA) pode ser usado como controle negativo. No entanto, deve notar-se que algumas proteínas não-glicosiladas reagir um pouco com o Emerald Pro-Q 300, especialmente quando usado em altas concentrações. Não-glicosilada padrões de peso molecular, tais como o marcador de proteína prestained utilizado neste protocolo, têm a vantagem de exibir faixas afiadas. Só por acaso é uma dessas proteínas (80 kDa) reativa para pró-Q Emerald 300. Portanto, o usuário pode querer executar uma escada padrão glicoproteína vez, como Candy Cane-de Invitrogen.
Finalmente, detecção em gel simples de glicoproteínas nucleocytosolic (que são modificados com um único O-GlcNAc) é possível com o uso de um anticorpo monoclonal, junto β-N-Acetylglucosaminidase para o controle de especificidade 11. A descrição desta técnica está além do escopo deste artigo, mas deve ser mencionado como glicosidases são ferramentas úteis para o estudo de muitas outras glicoproteínas e glicoconjugados presentes nas células. Um tratamento abrangente de todas as formas conhecidas de glicosilação pode ser encontrado na segunda edição do "Essentials of Glycobiology"; on-line gratuito, disponível no NCBI Bookshelf (ID Bookshelf: NBK1908; PMID: 20301239) 12.
The authors have nothing to disclose.
Comb Don
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human chorionic gonadotropin β | Sigma Aldrich | C6572 | |
PCR Tubes | VWR | 20170-004 | |
PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10% NP-40 | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |