Summary
Использование специфических гликозидазы удалить сахара из гликопротеинов следуют SDS-PAGE является ценным методом для обнаружения гликана модификаций на белок образцов и является хорошим выбором для первоначального исследования гликобиологии. Изменения, произошедшие в Дегликозилирование могут быть обнаружены как сдвиги в геле подвижность или окрашиванием гликана чувствительных реагентов.
Protocol
1. Ферментативный Дегликозилирование
- Использование ПЦР для минимизации потерь воды за счет испарения. Этикетка одного комплекта труб от 1 до 7.
- Оттепель 10X G7 буфера, 10X гликопротеин денатурирующих буфера, а 10% NP-40 и мягко нажмите на трубах для перемешивания содержимого. Хранить при комнатной температуре.
- Место фермент-содержащие флаконах по льду. Постарайтесь свести к минимуму оттепели / заморозки циклов.
- Растворить содержимое флакона hCGβ (150 мкг) в 600 мкл дН 2 O и держать на льду.
- Подготовка 1 мл 1X G7 буфера путем разбавления 10X акций дН 2 O.
- Развести 0,5 мкл PNGase F в 25 мкл 1X G7 буфера и держать на льду.
- Подготовка exoglycosidase смеси (Е. Г. смеси) путем объединения 2 мкл каждого из α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1-3 галактозидазы и α1-3, 6 галактозидазы.
- Настройка пробирки для ПЦР, которые указаны:
| Труба / образец # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| hCGβ (0.25mg/ml) | 9μl | 9μl | 9μl | 9μl | - | - | - |
| 10X гликопротеина денатурирующих буфера | 1 мкл | 1 мкл | 1 мкл | 1 мкл | 1 мкл | 1 мкл | 1 мкл |
| дН 2 O | - | - | - | - | 9μl | 9μl | 9μl |
- Cap трубы, аккуратно перемешать и поместить вамплификаторе, закройте крышкой и денатурации белков путем инкубации 10 мин при 94 ° С с последующим 4 ° С места (с использованием ПЦР труб в амплификаторе значительно предотвращает испарение в малых выборках объема).
- Удалить труб из амплификаторе и центрифугу для удаления видимых конденсации.
- Добавить следующие реагенты, которые указаны:
| Пример # | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 10% NP-40 | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl |
| 10X G7 буфера | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2.5μl | 2,5 и мю; Л | 2.5μl |
| PNGase F 1:50 дил. | - | 2μl | - | - | 2μl | - | - |
| Дегликозилирование Mix | - | - | 2μl | 2μl | - | 2μl | 2μl |
| Е. смеси | - | - | - | 2μl | - | - | 2μl |
| дН 2 O | 10 мкл | 8μl | 8μl | 6μl | 8μl | 8μl | 6μl |
| Всего т. реакции. | 25 μ л | 25 μ л | 25 μ л | 25 л μ </ TD> | 25 μ л | 25 μ л | 25 μ л |
- Закрыть пробирки для ПЦР с использованием новых колпачков (отказаться использовать, т.к. они не соответствуют должным образом после инкубации один цикл).
- Смешайте труб аккуратным постукиванием в 4 раза, а затем спина содержимое вниз.
- Место труб в амплификаторе и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 4 часов, затем охладить образцы до 4 ° C.
2. SDS-электрофорез deglycosylated образцы
- Подготовка 130 мкл свежей 3X сокращение SDS загрузки буфера путем добавления 4 мкл 1,25 DTT.
- Добавить 12,5 мкл подготовленных 3X снижения загрузки буфера SDS для каждого образца.
- Закрыть труб с новой шапки и мягко нажмите на трубы, чтобы смешаться.
- Инкубируйте труб в амплификаторе при 94 ° С в течение 5 минут, а затем охладить до 4 ° С.
- Нагрузка 30 мкл каждого образца и 10 мкл белок маркером на 10-20% Трис-Глицин геля. Сохранить оставшуюся часть образца на части 3.1. Нагрузка 10 мкл из ColorPlus Prestained маркерный белок.
- Electrophorese геля при 130 вольт при комнатной температуре до красителя фронт в нижней части геля.
- Когда гель завершения работы, удалить гель из литого и поместить его в небольшую пластиковую коробку с достаточно Coomasie синевы, чтобы покрыть гелем.
- Пятно геля в течение 1 часа с нежным агитации.
- Вымойте гель три раза в течение 30 минут в 50 мл destain решение.
- Запись изображений с использованием белого света transilluminator или сканера. Кроме того, гель можно сушить между листами целлофана в кадре.
3. Pro-Q Изумрудный 300 для обнаружения гликозилированного белков в SDS-PAGE гелей
- Параллельно с гелем в 2,1), загрузить оставшуюся часть образцов на 10-20% Трис-Глицин геля. Нагрузка 10-му; Л ColorPlus Prestained маркерный белок.
- В то время как гель работает растворяются Pro-Q Изумрудный реагента с DMF и подготовить запас Fix, вымыть и Окисляющие решения для Pro-Q 300 Изумрудный пятно следующим руководством по продукции обеспечен комплектом.
- При электрофорезе завершено, удалить гель из литого и поместить его в пластиковой коробке.
- Fix гель, добавив 100 мл Fix решение и оставить его на ночь при комнатной температуре при легком помешивании.
- Вымойте гель 100 мл Промывочный раствор от 10 до 20 минут при комнатной температуре с языческими агитации. Повторите промыть свежим раствором промыть.
- Окислять углеводы путем инкубации гель с нежным агитации в течение 30 минут в 25 мл Окисляющие решение.
- Вымойте гель, как описано в пункте 3.5.
- В то время как гель стиральной подготовить свежие Pro-Q Изумрудный 300 пятно, добавив 500 мкл Pro-Q Изумрудный 300 раствора реагента, растворенного в шаге от 3,2 до 25 млокрашивание буфер, предоставленный в комплекте.
- Пятно гель, добавив 25 мл пятно подготовлен в шаге 3.8 и инкубации в темноте с легком помешивании в течение 90 до 120 минут.
- Повторите два промывания, описанных в пункте 3.5.
- Запись изображений с УФ transilluminator при 300 нм. Используйте 80 кДа маркер, который помечен Pro-Q изумрудно-зеленый, перекрывать УФ изображение белое изображение свете геля показывает prestained лестнице.
- Сравните образы Coomasie окрашенных гель в шаге 2,10 с Pro-Q Изумрудный окрашенных гель, начиная с шага 3.11.
4. Представитель результаты
Изменения в белок миграции после ферментативной Дегликозилирование показаны на рисунке 2. Сравнить контрольной пробы (панель, полоса 1) с лечением PNGase F (удаление N-гликанов, переулок 2), и Дегликозилирование Mix (PNGase F; плюс эндо-и exoglycosidases удалить О-гликанов, дорожка 3). Нет дальнейшее снижениев размере видно после переваривания с дополнительными гликозидазы (дорожка 4). Кроме изменения массы, группы обостряются как гликанов удаляются. Группа под управлением 17 кДа маркер (звездочка) представляет собой полностью deglycosylated hCGβ полипептид (МВт: 16 кДа). Другие группы могут извлекать из неполных Дегликозилирование или с несколькими неизвестными белки, присутствующие в hCGβ образца (см. дорожка 1). Дорожки от 5 до 7 (контроля) показывают полосы, соответствующие гликозидазы.
Гликопротеин окрашивания изумрудно-зеленый показан на панели B. Этот реагент окисляется и пятна все гликанов присутствует в молекуле белка. Поэтому интенсивность сигнала уменьшается hCGβ ферментативно deglycosylated (полоса 1 до переулок 4). Остаточный сигнал в полосы 3 и 4 указывают на наличие гликана мотивы, которые устойчивы к ферменты используются. Дополнительные гликозидазы используются в полосе 4 удалить несколько лишних остатков сахара: белка миграция то же самое, нонебольшое снижение интенсивности окрашивания можно увидеть. Устойчива фрагменты сахара не присутствовали во всех белков видов: некоторые группы не были обнаружены на изумрудно-зеленый (отсутствует в УФ-изображения, в скобках), что указывает на их широко deglycosylated. Дополнительные данные подтверждают вывод о том, что hCGβ является гетерогенно гликозилированного. Нижняя полоса на полосу 2 (стрелка) на слабое изображение изумрудно-зеленый, в то время как верхняя полоса на переулок, 2 ярко, указывая, что многие группы гликанов все еще существуют. Эти данные подтверждают вывод, что рекомбинантный hCGβ выражается в мышиных клеток содержит несколько гликоформ 9. Эти различные гликоформ обусловлены присущими неоднородность гликозилирования, где некоторые полипептиды не получают гликана на каждом сайте консенсуса и / или какой-либо гликанов распространяются, а другие даже на тот же белок нет.
Рисунок 1.Типичные модели гликозилирования для выделяется или клеточных поверхностных гликопротеинов.
Рисунок 2. SDS-PAGE гелей показывает ферментативную Дегликозилирование hCGβ. Группа показывает Coomasie синего окрашивания в то время как группа B показаны результаты Pro-Q Изумрудный 300 для визуализации гликозилированного белков. Пример номер: 1, hCGβ контроля; 2, PNGase F пищеварения, 3, пищеварение Дегликозилирование Mix, 4, Mix Дегликозилирование плюс exoglycosidases пищеварения, образцы 5 до 7 реагента управления (O-Glyc, O-гликозидазы, ГНА, β-N -Acetylglucosaminidase; Гал / Фук, β1-3 галактозидазы, α1-3, 6 галактозидазы и α1-2 Fucosidase; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, нейраминидазы; PNGase; PNGase F)
Discussion
Описанный здесь метод использования ферментативных Дегликозилирование и SDS-PAGE может дать ценную информацию о состоянии гликозилирования белков представляет интерес, в то время как гликана-специфических реагентов облегчить интерпретацию данных. Этот протокол предназначен для первоначальных исследований гликозилирования белков, и это особенно хорошо подходит для секреторной и мембранные гликопротеины из клеток млекопитающих: ферменты выбрали в этом случае будет специально удалить все N-гликанов, и или N-гликанов плюс и самый распространенный сахар расширение и формирование ядра О-гликанов. Гликозидазы имеют дополнительное преимущество мягкий, по сравнению с химическими методами Дегликозилирование, сохранения целостности обоих сахаров и белков позвоночника.
Для выяснения показатель заполненности (что аминокислоты гликозилированного), степень гликозилирования, или для определения тонкой структуры гликанов, более сложные методы, такие как мзад-спектрометрии, жидкостной хроматографии и ЯМР обязательны для заполнения.
Из-за своей простоты, несколько шагов в этом протоколе можно отрегулировать, заменить и / или в комбинации для размещения различных экспериментальных потребностей. Однако, для того, чтобы получить результаты, которые могут быть четко интерпретировать важно понимать свои сильные стороны и ограничения. Во-первых, специфичность и чистоту гликозидазы имеют решающее значение: только хорошо известных ферментов, проходят проверку на отсутствие протеаз и других загрязняющих деятельности должны быть использованы. К сожалению, не существует стандартного определения единицы фермент для гликозидазы, пользователь должен определить соответствующие замены в соответствии со спецификацией производителя. Во-вторых, тщательный выбор обнаружения необходимо: а) реагентов белка окрашивания полезны, только если Дегликозилирование приводит к значительному сдвигу в молекулярной массой. Такой четкий результат, как показано здесь, не всегда получается. В других случаях мы видели ненормальных мильgration после Дегликозилирование (далеко не предсказал молекулярный вес, или еще медленнее, миграция). Это явление не очень хорошо понимал, но можно сказать, что любые изменения в миграционной доказательства того, что белок deglycosylated. Б) Сахар обнаружения с антителами представляет уникальные задачи, что ограничивает их применение. Это было очень трудно произвести общий анти-гликана антител; они, как правило, выдвигаемые против комплексной целевой гликана, что ограничивает их использование. Кроме того, несколько моноклональных анти-гликана антител дисплей нежелательных перекрестной реактивности 10. В) лектинов (белки с внутренней близости сахара) хорошо подходят для обнаружения сахара, плюс они дают представление о структуре гликана. Однако, не все из них имеют узкую специфику, и многие из них лишь частично охарактеризованы (это означает, что они, возможно, неизвестные сродство). Как следствие положительное окрашивание лектин обеспечивает индикацию, а не доказательства, о присутствии гиВен сахара. г) Химическая маркировка комплектов (на основе периодатом окисление сахаров) методом выбора для окрашивания всех гликопротеинов, и таким образом хорошо подходит следовать Дегликозилирование.
При обработке неизвестного образца, это хорошая практика, чтобы включить гликопротеин управления. Fetuin является доступной N - и О-гликопротеин, хорионический гонадотропин (оба подразделения) также является хорошим выбором. Бычий сывороточный альбумин (BSA), могут быть использованы в качестве отрицательного контроля. Однако следует отметить, что некоторые негликозилированные белки реагируют слегка Pro-Q Изумрудный 300, особенно при использовании в высоких концентрациях. Негликозилированные молекулярного веса стандартов, таких как prestained маркерный белок, используемые в настоящем протоколе, имеют то преимущество, отображающий резкие полосы. Лишь по случайности один из этих белков (80 кДа) реагирует на Pro-Q Изумрудный 300. Таким образом, пользователь может понадобиться запустить лестнице гликопротеин стандартных, а не, например, конфеты-Кане от Invitrogen.
Наконец, просто в-гель обнаружения nucleocytosolic гликопротеины (которые изменяются с одним О-GlcNAc) возможно с использованием моноклональных антител, а также β-N-Acetylglucosaminidase за специфики управления 11. Описание этой техники находится за пределами рамки данной статьи, но она должна быть упомянутым в качестве гликозидазы являются полезным инструментом для изучения многих других гликопротеинов и гликоконъюгатов присутствуют в клетках. Комплексное лечение всех известных форм гликозилирования могут быть найдены в второе издание "Основы гликобиологии" и доступен бесплатно онлайн на книжной полке NCBI (Книжная полка ID: NBK1908; PMID: 20301239) 12.
Disclosures
Авторы являются сотрудниками Новой Англии Биолабс, который производит многие из реагентов, используемых в этой статье.
Acknowledgments
Расческа Дону
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human chorionic gonadotropin β | Sigma-Aldrich | C6572 | |
| PCR Tubes | VWR international | 20170-004 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
| Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
| α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
| α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
| α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
| β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
| 10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 10% NP-40 | New England Biolabs | --- | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
| 3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
| ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
| 10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
| Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
| Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
| Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
| Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B0149 | |
| AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |
References
- Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease. Cell. 126, 855-867 (2006).
- Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins. Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).
- Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function. Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).
- Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit. Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).
- Tarentino, A. L., Plummer, T. H. Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).
- Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. Novel endo-α-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity. Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).
- Thakur, D. Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).
- Park, S., Lee, M. R., Shin, I. Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes. Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).
- Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine. Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).
- Varki, A. Essentials of Glycobiology. , 2nd Ed, Clod Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
