Brug af specifikke glycosidases at fjerne sukker fra glycoproteiner efterfulgt af SDS-PAGE er en værdifuld metode til at påvise glycan ændringer på protein prøver og er et godt valg til den indledende glycobiology studier. Ændringer følgende deglycosylation kan detekteres som ændringer i gel mobilitet eller ved farvning med glycan følsomme reagenser.
Glykosylering, tilføjelse af kovalentforbundne sukker, er en stor post-translationelle ændring af proteiner, der væsentligt kan påvirke processer såsom celleadhæsionsmolekyle, molekylær menneskehandel, clearance, og signal transduktion 1-4. I eukaryoter, er den mest almindelige glykosylering ændringer i Udskillelsen tilføjelser til enighed asparagin rester (N-linked) eller på serin eller threonin restprodukter (O-linked) (Figur 1). Indledning af N-glycan syntese er meget bevares i eukaryoter, mens slutprodukterne kan variere meget mellem forskellige arter, væv eller proteiner. Nogle glycans forblive uændrede ("high mannose N-glycans") eller forarbejdes yderligere i Golgi ("komplekse N-glycans"). Større mangfoldighed er fundet for O-glycans, som starter med en fælles N-Acetylgalactosamine (GalNAc) rester i animalske celler, men adskiller sig i lavere organismer 1.
ENT "> Den detaljerede analyse af glykosylering af proteiner er et område i sig selv og kræver omfattende ressourcer og ekspertise til at udføre ordentligt. Men en række af de tilgængelige enzymer, der fjerner sukker (glycosidases) gør det muligt at have en generel idé om glycosylation status . et protein i en standard laboratorium indstilling Her har vi illustrere brugen af glycosidases til analyse af en model glycoprotein:. rekombinant humant choriongonadotropin beta (hCGβ), som bærer to N-glycans og fire O-glycans 5 Den teknik kræver kun simple instrumentering og typiske forbrugsvarer, og det kan let tilpasses til analyse af flere glycoprotein prøver.Flere enzymer kan bruges i parallelt at studere et glycoprotein. PNGase F er i stand til at fjerne næsten alle typer af N-linked glycans 6,7. For O-glycans, er der ingen tilgængelig enzym, som kan kløve en intakt oligosaccharid fra the protein backbone. I stedet er O-glycans trimmes ved exoglycosidases til en kort kerne, som derefter let kan fjernes ved O-Glycosidase. Den Protein Deglycosylation Mix indeholder PNGase F, O-Glycosidase, neuraminidase (sialidase), β1-4 galactosidase, og β-N-Acetylglucosaminidase. Det bruges til samtidigt at fjerne N-glycans og nogle O-glycans 8. Endelig blev Deglycosylation Mix suppleret med en blanding af andre exoglycosidases (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 galactosidase, og β1-3 galactosidase), hvilket bidrager til at fjerne ellers resistente monosaccharider, der kunne være til stede i visse O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blå er brugt til at visualisere forskelle i protein migration før og efter glycosidase behandling. Desuden viser en sukker-specifik farvning metode, ProQ Emerald-300, formindsket signal som glycans er successively fjernet. Denne protokol er designet til analyse af små mængder af glycoprotein (0,5 til 2 mg), selv om enzymatisk deglycosylation kan skaleres op til at rumme større mængder af protein efter behov.
Metoden beskrives her ved hjælp af enzymatisk deglycosylation og SDS-PAGE kan give værdifulde oplysninger om glykosylering tilstand af et protein af interesse, mens glycan-specifikke reagenser lette fortolkningen af data. Denne protokol er beregnet til de indledende undersøgelser af protein glycosylation, og det er særligt velegnet til sekretorisk og membran glycoproteiner fra pattedyrceller: de enzymer, der er valgt i dette tilfælde vil specielt fjerne alle N-glycans, og eller N-glycans plus og de mest almindelige sukker udvidelse og som udgør kernen i O-glycans. Glycosidases har den yderligere fordel af at være milde, sammenlignet med kemiske deglycosylation metoder, bevare integriteten af både sukker og protein backbone.
For at belyse graden af belægning (som aminosyrer er glykosyleret), omfanget af glykosylering, eller til at bestemme fine struktur glycans, mere sofistikerede teknikker som mrøv spektrometri, væskekromatografi eller NMR er påkrævet.
På grund af sin enkelhed, kan flere skridt i denne protokol justeres, erstattes, og / eller kombineres for at tilgodese forskellige eksperimentelle behov. Men for at opnå resultater, som klart kan tolkes, er det vigtigt at forstå sine styrker og begrænsninger. For det første specificitet og renheden af glycosidases er afgørende: kun velkarakteriseret enzymer testet til at være fri for proteaser og andre forurenende aktiviteter bør anvendes. Desværre er der ingen standard enzymenhed definition glycosidases, at brugeren skal fastsætte en passende erstatning i henhold til producentens specifikationer. For det andet, et omhyggeligt valg af påvisning er nødvendige: a) Protein farvningsreagenser er kun nyttig, hvis deglycosylation resulterer i et markant skift i molekylær masse. En sådan et klart resultat, som vist her er ikke altid opnås. I andre tilfælde har vi set unormal migration efter deglycosylation (langt fra den forventede molekylvægt eller endnu langsommere migration). Dette fænomen er ikke godt forstået, men det kan siges, at enhver ændring i migration er bevis på, at protein er blevet deglycosylated. B) Sukker detektion med antistoffer præsenterer unikke udfordringer begrænser deres anvendelighed. Det har været meget vanskelige at uddrage generelle anti-glycan antistoffer, de er som regel rejst mod en kompleks glycan mål, som begrænser deres anvendelse. Desuden har flere monoklonale anti-glycan antistoffer display uønsket krydsreaktivitet 10. C) lektiner (proteiner med iboende sukker affinitet) er velegnede for sukker detektion, plus de giver indsigt i glycan struktur. Men ikke alle af dem har en smal specificitet, og mange er kun delvist præget (hvilket betyder, at de kunne have ukendt tilhørsforhold). Som en konsekvens positiv lektin farvning giver indikation, der ikke bevis for tilstedeværelsen af en giHven sukker. d) Kemisk mærkning kits (baseret på periodate oxidation af sukker) er den foretrukne metode til farvning af alle glycoproteiner, og dermed velegnet til at følge deglycosylation.
Ved behandling af en ukendt prøve, er det en god praksis at inkludere glykoprotein kontrol. Fetuin er en let tilgængelig N – og O-glycoprotein, choriongonadotropin (begge subunits) er også et godt valg. Bovin serum albumin (BSA) kan anvendes som negativ kontrol. Dog skal det bemærkes, at nogle ikke-glykosyleret proteiner reagerer let med Pro-Q Emerald 300, især når de anvendes ved høje koncentrationer. Ikke-glykosyleret molekylvægt standarder, såsom prestained protein markør anvendes i denne protokol, har den fordel at vise skarpe bands. Kun ved en tilfældighed er en af disse proteiner (80 kDa) reaktiv til Pro-Q Emerald 300. Derfor kan brugeren ønsker at køre et glykoprotein standard stigen i stedet, som f.eks Candy-Cane fra InvitrogeN.
Endelig er enkel i-gel detektering af nucleocytosolic glycoproteiner (som er modificeret med en enkelt O-GlcNAc) er mulig ved brug af et monoklonalt antistof, langs β-N-Acetylglucosaminidase for specificitet kontrol 11. Beskrivelsen af denne teknik er uden for rammerne af denne artikel, men det bør nævnes som glycosidases er nyttige værktøjer til studiet af mange andre glycoproteiner og glycoconjugates til stede i celler. En omfattende behandling af alle kendte former for glycosylation kan findes i den anden udgave af "Essentials of glycobiology" gratis tilgængelig online på NCBI Reol (Boghylde ID: NBK1908; PMID: 20301239) 12.
The authors have nothing to disclose.
Don Comb
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human chorionic gonadotropin β | Sigma Aldrich | C6572 | |
PCR Tubes | VWR | 20170-004 | |
PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10% NP-40 | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |