विशिष्ट glycosidases का उपयोग करने के लिए एसडीएस – पेज द्वारा पीछा glycoproteins से शर्करा को दूर करने के लिए प्रोटीन के नमूने पर glycan संशोधन का पता लगाने के लिए एक मूल्यवान तरीका है और प्रारंभिक glycobiology के अध्ययन के लिए एक अच्छा विकल्प है है. Deglycosylation निम्नलिखित परिवर्तन जेल गतिशीलता में बदलाव के रूप में या glycan संवेदनशील अभिकर्मकों के साथ धुंधला करके पता लगाया जा सकता है.
Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified (“high mannose N-glycans”) or are further processed in the Golgi (“complex N-glycans”). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCGβ), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), β1-4 Galactosidase, and β-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3,6 Galactosidase, and β1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 μg), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.
विधि यहाँ वर्णित एंजाइमी deglycosylation और एसडीएस पृष्ठ का उपयोग ब्याज की एक प्रोटीन की ग्लाइकोसिलेशन राज्य के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं, जबकि glycan विशेष अभिकर्मकों डेटा की व्याख्या की सुविधा. इस प्रोटोकॉल प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन के प्रारंभिक अध्ययन के लिए इरादा है और यह विशेष रूप से स्रावी और स्तनधारी कोशिकाओं से झिल्ली glycoproteins के लिए अनुकूल है: इस मामले में चुना एंजाइमों विशेष रूप से सभी एन – glycans को हटाने जाएगा और या एन glycans प्लस और सबसे आम शर्करा विस्तार और हे glycans की कोर का गठन . Glycosidases हल्के होने का अतिरिक्त लाभ है, रासायनिक deglycosylation तरीकों के साथ तुलना में, दोनों शर्करा और प्रोटीन रीढ़ की अखंडता बनाए रखने.
अधिभोग का दर (जो एमिनो एसिड ग्लाइकोसिलेटेड हैं), ग्लाइकोसिलेशन की हद तक, या glycans के ठीक संरचना, ऐसे मी के रूप में में और अधिक परिष्कृत तकनीक का निर्धारण स्पष्टगधा स्पेक्ट्रोमेट्री, तरल क्रोमैटोग्राफी या एनएमआर आवश्यक हैं.
अपनी सादगी की वजह से, इस प्रोटोकॉल में कई कदम, समायोजित किया जा सकता एवजी है, और / या विभिन्न प्रयोगात्मक जरूरतों को समायोजित करने के लिए संयुक्त. हालांकि, के क्रम में परिणाम है कि स्पष्ट रूप से व्याख्या की जा सकती प्राप्त करने के लिए यह महत्वपूर्ण है के लिए अपनी शक्तियों और सीमाओं को समझने. सबसे पहले, विशिष्टता और glycosidases की शुद्धता महत्वपूर्ण हैं: केवल अच्छी तरह से विशेषता एंजाइमों proteases और अन्य गतिविधियों contaminating के मुक्त होने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. दुर्भाग्य से, वहाँ glycosidases के लिए कोई मानक एंजाइम इकाई परिभाषा है, उपयोगकर्ता निर्माता विनिर्देशों के अनुसार उपयुक्त प्रतिस्थापन निर्धारित करना चाहिए. दूसरा, का पता लगाने के एक सावधान पसंद जरूरी है:) प्रोटीन धुंधला अभिकर्मकों उपयोगी होते हैं केवल आणविक जन में एक महत्वपूर्ण बदलाव में deglycosylation परिणाम अगर. इस तरह के एक स्पष्ट परिणाम के रूप में यहाँ दिखाया हमेशा प्राप्त नहीं है. अन्य मामलों में, हम असामान्य मील देखा हैdeglycosylation बाद gration भविष्यवाणी की आणविक वजन, या भी धीमी प्रवास (दूर से). इस घटना अच्छी तरह समझ नहीं है, लेकिन यह कहा जा सकता है कि प्रवास में किसी भी परिवर्तन सबूत है कि प्रोटीन deglycosylated किया गया है ख) एंटीबॉडी के साथ चीनी का पता लगाने में अद्वितीय चुनौतियों उनकी प्रयोज्यता सीमित प्रस्तुत करता है.. यह बहुत मुश्किल सामान्य विरोधी glycan एंटीबॉडी उत्पन्न किया गया है, वे आम तौर पर एक जटिल glycan लक्ष्य है, जो उनके उपयोग को प्रतिबंधित के खिलाफ उठाया जाता है. इसके अलावा, कई मोनोक्लोनल विरोधी glycan एंटीबॉडी अवांछित पार जेट 10 प्रदर्शित ग) lectins (आंतरिक चीनी आत्मीयता के साथ प्रोटीन) अच्छी तरह से चीनी का पता लगाने के लिए अनुकूल हैं, प्लस वे glycan संरचना पर अंतर्दृष्टि दे .. हालांकि, उन सभी को नहीं एक संकीर्ण विशिष्टता है, और कई केवल आंशिक रूप से (जिसका अर्थ है कि वे अज्ञात समानताएं हो सकता है) विशेषता है. के रूप में एक परिणाम सकारात्मक लेक्टिन धुंधला एक सैनिक की उपस्थिति का संकेत सबूत है, नहीं, प्रदान करता हैउपक्रम चीनी घ) रासायनिक लेबलिंग किट (शर्करा की periodate ऑक्सीकरण पर आधारित) पसंद की विधि सभी glycoproteins दाग रहे हैं, और इस प्रकार अच्छी तरह से deglycosylation का पालन करने के लिए अनुकूल है.
जब एक अज्ञात नमूना प्रसंस्करण, यह ग्लाइकोप्रोटीन नियंत्रण को शामिल करने के लिए एक अच्छा अभ्यास है. Fetuin एक एन आसानी से उपलब्ध है और हे ग्लाइकोप्रोटीन, chorionic gonadotropin (दोनों सब यूनिटों) भी एक अच्छा विकल्प है. गोजातीय सीरम albumin (BSA) एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, यह उल्लेखनीय है कि कुछ गैर ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन समर्थक क्यू पन्ना 300 के साथ थोड़ा प्रतिक्रिया, खासकर जब उच्च सांद्रता में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. गैर ग्लाइकोसिलेटेड prestained प्रोटीन इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता मार्कर के रूप में आणविक भार मानकों, तेज बैंड को प्रदर्शित करने का लाभ है. केवल मौका द्वारा इन (80 केडीए) प्रोटीन समर्थक क्यू पन्ना 300 करने के लिए प्रतिक्रियाशील है. इसलिए, उपयोगकर्ता के लिए एक glycoprotein मानक सीढ़ी बजाय चलाने चाहते हैं, Invitroge से इस तरह के रूप में कैंडी – केनएन
अंत में, सरल का पता लगाने में जेल nucleocytosolic glycoproteins (जो एक एकल O-GlcNAc के साथ संशोधित कर रहे हैं) के एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उपयोग के साथ संभव है, विशिष्टता 11 नियंत्रण के लिए β एन Acetylglucosaminidase साथ इस तकनीक का वर्णन से परे है . के रूप में glycosidases कई अन्य glycoproteins और glycoconjugates कोशिकाओं में मौजूद के अध्ययन के लिए उपयोगी उपकरण हैं इस लेख के दायरे, लेकिन यह उल्लेख किया जाना चाहिए. ग्लाइकोसिलेशन के सभी ज्ञात रूपों का एक व्यापक उपचार "Glycobiology के अनिवार्य है" के दूसरे संस्करण में पाया जा सकता है है: 12; NCBI (20,301,239 PMID NBK1908 Bookshelf आईडी) Bookshelf पर मुफ्त उपलब्ध ऑनलाइन, .
The authors have nothing to disclose.
डॉन कंघी
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human chorionic gonadotropin β | Sigma Aldrich | C6572 | |
PCR Tubes | VWR | 20170-004 | |
PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10% NP-40 | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |