Att använda särskilda glycosidases att ta bort socker från glykoproteiner följt av SDS-PAGE är en värdefull metod för att upptäcka glycan ändringar på protein prover och är ett bra val för en första Glycobiology studier. Förändringar efter deglycosylation kan upptäckas så förskjutningar i gel rörlighet eller genom färgning med glycan känsliga reagenser.
Glykosylering, tillägg av kovalent kopplade socker, är en stor post-translationell modifiering av proteiner som väsentligt kan påverka processer såsom cell adhesion, molekylär människohandel, clearance och signaltransduktion 1-4. I eukaryoter, den vanligaste glykosylering ändringar i Utsöndringsvägarna är tillägg på rester konsensus asparagin (N-linked), eller på serin eller treonin rester (O-linked) (Figur 1). Inledande av N-glycan syntes är starkt konservativa i eukaryoter, medan slutprodukterna kan variera mycket mellan olika arter, vävnader eller proteiner. Vissa glycans förblir oförändrade ("high mannos N-glykaner") eller bearbetas ytterligare i Golgi ("komplex N-glykaner"). Ökad mångfald är för O-glykaner, som börjar med ett gemensamt N-acetylgalaktosamin (GalNAc) rester i djurceller men skiljer sig i lägre organismer 1.
ENT "> En detaljerad analys av glykosylering av proteiner är ett område i sig själv och kräver omfattande resurser och kompetens för att utföra ordentligt. Men en mängd som finns enzymer som tar bort socker (glycosidases) gör det möjligt att ha en allmän uppfattning om glykosylering status . ett protein i en vanlig laboratoriemiljö Här illustrera användningen av glycosidases för analys av en modell glykoprotein:. rekombinant humant koriongonadotropin beta (hCGβ), som bär två N-glykaner och fyra O-glykaner 5 Tekniken kräver endast enkel instrumentering och typiska förbrukningsvaror och den kan lätt anpassas till analys av flera glykoprotein prover.Flera enzymer kan användas parallellt för att studera ett glykoprotein. PNGase F kan ta bort nästan alla typer av N-bundna glykaner 6,7. För O-glykaner, så finns inga tillgängliga enzym som kan klyva en intakt oligosackarid från the protein ryggrad. Istället är O-glykaner trimmas genom exoglycosidases till en kort kärna, som sedan lätt bort med O-Glycosidase. Den Protein Deglycosylation Mix innehåller PNGase F, O-Glycosidase, neuraminidas (sialidase), β1-4 galaktosidas och β-N-Acetylglucosaminidase. Det används för att samtidigt ta bort N-glykaner och några O-glykaner 8. Slutligen var Deglycosylation Blanda kompletteras med en blandning av andra exoglycosidases (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 galaktosidas och β1-3 galaktosidas), som bidra till att undanröja annars resistenta monosackarider som kan finnas i vissa O-glykaner.
SDS-PAGE/Coomasie blått används för att visualisera olika protein migration före och efter glycosidase behandling. Dessutom visar en socker-specifik färgning metod, ProQ Emerald-300, minskade signal glykaner är Succéssively bort. Detta protokoll är utformad för analys av små mängder glykoprotein (0,5 till 2 mikrogram), även enzymatiska deglycosylation kan skalas upp för att rymma större mängder protein som behövs.
Metoden som beskrivs här med enzymatisk deglycosylation och SDS-PAGE kan ge värdefull information om glykosylering tillståndet av ett protein av intresse, medan glycan-specifika reagenser underlätta tolkningen av data. Detta protokoll är avsedd för inledande studier av protein glykosylering och det är särskilt lämpad för sekretoriska och glykoproteiner membran från däggdjursceller: de enzymer som valts i detta fall kommer särskilt att ta bort alla N-glykaner och eller N-glykaner plus och de vanligaste socker förlängning och utgör kärnan i O-glykaner. Glycosidases har den extra fördelen av att vara mild, jämfört med kemiska deglycosylation metoder, bevara integriteten av både socker och protein ryggrad.
För att belysa beläggning (som aminosyror är glykosylerat), omfattning av glykosylering, eller för att bestämma den fina struktur glykaner, mer sofistikerade tekniker som mass spektrometri, vätskekromatografi eller NMR behövs.
På grund av sin enkelhet, kan flera steg i detta protokoll justeras, ersättas, och / eller kombineras för att tillgodose olika experimentella behov. Men för att få resultat som klart kan tolkas är det viktigt att förstå dess styrka och begränsningar. Första, specificitet och renhet glycosidases är avgörande: endast välkarakteriserad enzymer testade för att vara fri från proteaser och andra förorenande verksamhet bör användas. Tyvärr finns det ingen standard enhet enzym definition för glycosidases, användaren bör bestämma lämplig ersättning enligt tillverkarens specifikationer. För det andra är ett noggrant val av upptäckt nödvändiga: a) Protein färgreagenser är användbara endast om deglycosylation resulterar i en betydande förändring i molekylmassa. Ett sådant tydligt resultat som visas här är inte alltid uppnås. I andra fall har vi sett onormalt miintegration efter deglycosylation (långt ifrån den förväntade molekylvikten, eller ännu långsammare migration). Detta fenomen är inte bra förstås, men det kan sägas att någon förändring i migration är bevis för att protein har deglycosylated. B) Socker detektion med antikroppar innebär unika utmaningar begränsar deras tillämplighet. Det har varit mycket svårt att skapa allmänna anti-glycan antikroppar, de är oftast riktas mot en komplex glycan mål, vilket begränsar deras användning. Dessutom har ett flertal monoklonala anti-glycan antikroppar visa oönskade korsreaktivitet 10. C) Lektiner (proteiner med inneboende socker affinitet) är väl lämpade för socker upptäckt, plus att de ger insikt om glycan struktur. Men inte alla av dem har en smal specificitet, och många är bara delvis kännetecknas (vilket innebär att de kunde ha okända tillhörighet). Som en följd av positiv lektin färgning ger indikation, inga bevis om förekomsten av ett GIven socker. d) Kemisk märkning kit (baserat på periodate oxidation av socker) är en lämplig metod för att färga alla glykoproteiner, och därmed väl lämpad att följa deglycosylation.
Vid bearbetning av ett okänt prov, är det en god idé att inkludera glykoprotein kontroller. Fetuin är en lättillgänglig N – och O-glykoprotein, koriongonadotropin (båda subenheter) är också ett bra val. Bovint serumalbumin (BSA) kan användas som en negativ kontroll. Det bör dock noteras att vissa icke glykosylerat protein reagerar lätt med Pro-Q Emerald 300, särskilt när de används vid höga koncentrationer. Icke glykosylerat molekylvikt standarder, såsom prestained protein som markör i detta protokoll, har fördelen av att visa vassa band. Bara av en slump är ett av dessa proteiner (80 kDa) reaktiv till Pro-Q Emerald 300. Därför kan användaren vill köra en stege glykoprotein standard istället, till exempel Candy-Cane från Invitrogen.
Slutligen är enkel i-gel detektion av nucleocytosolic glykoproteiner (som är modifierade med en O-GlcNAc) möjligt med hjälp av en monoklonal antikropp, längs β-N-Acetylglucosaminidase för specificitet kontroll 11. Beskrivningen av denna teknik ligger utanför ramen för denna artikel, men det bör nämnas som glycosidases är användbara verktyg för att studera många andra glykoproteiner och Glycoconjugates finns i celler. En omfattande behandling av alla kända former av glykosylering finns i den andra upplagan av "Essentials of Glycobiology", tillgänglig gratis online på NCBI Bookshelf (Bokhylla ID: NBK1908; PMID: 20.301.239) 12.
The authors have nothing to disclose.
Don Comb
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human chorionic gonadotropin β | Sigma Aldrich | C6572 | |
PCR Tubes | VWR | 20170-004 | |
PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 4359659 | |
PNGase F | New England Biolabs | P0704 | Supplied with buffers |
Protein Deglycosylation Mix | New England Biolabs | P6039 | Supplied with buffers |
α-N-Acetylglalactosaminidase | New England Biolabs | P0734 | Supplied with buffer |
α1-2 Fucosidase | New England Biolabs | P0724 | Supplied with buffer |
α1-3,6 Galactosidase | New England Biolabs | P0731 | Supplied with buffer |
β1-3 Galactosidase | New England Biolabs | P0726 | Supplied with buffer |
10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
10% NP-40 | New England Biolabs | — | Supplied with PNGaseF or Degl Mix |
3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) | New England Biolabs | B7703 | Supplied with 1.25M DTT |
ColorPlus Prestained Protein Marker | New England Biolabs | P7709 | |
10-20% Tris-Glycine Multigel | Cosmo Bio Co. | DCB-414893 | |
Cassette Electrophoresis Unit | Cosmo Bio Co. | DCB-303111 | |
Electrophoresis Power Supply EPS 301 | GE Healthcare | 18-1130-01 | |
Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit | Invitrogen | P-21857 | |
Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
AlphaImager HP System | Cell Biosciences | 92-13823-00 |