Ein vereinfachtes Verfahren für Published: June 12, 2012 doi: 10.3791/3765

DOI

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Mohit Parekh¹, Stefano Ferrari¹, Enzo Di Iorio¹, Vanessa Barbaro¹, Davide Camposampiero¹, Marianthi Karali², Diego Ponzin¹, Gianni Salvalaio¹

¹Fondazione Banca Degli Occhi del Veneto O.N.L.U.S., ²Telethon Institute for Genetics & Medicine (T.I.G.E.M.)

Summary

Das Papier beschreibt ein vereinfachtes Verfahren zur Hornhaut-und Verbrauchssteuern zu retinalen Gewebe aus dem Augapfel von menschlichen Leichen Spendern auszuhöhlen. Die hier beschriebene Technik wird verbrauchsteuerpflichtige guter Qualität zu Geweben zur Transplantation oder chirurgische Zwecke oder Forschungszwecke ohne Beschädigung anderer Gewebe des Augapfels verwendet werden zu helfen.

Abstract

Enukleation ist der Prozess, das Abrufen des Augapfels aus einer Leichenspender Verlassen der Rest der Welt ungestört. Exzision bezieht sich auf den Abruf von Augengewebe, insbesondere Hornhaut, indem er getrennt von dem Augapfel. Ausweiden ist der Prozess des Entfernens der inneren Organe hier genannten Netzhaut. Der Augapfel besteht aus der Hornhaut, der Lederhaut, den Glaskörper, die Linse, der Iris, der Netzhaut, der Aderhaut, Muskeln etc. (Suppl. Abbildung 1). Wenn ein Patient aus Hornhautschäden leiden, muss die Hornhaut entfernt werden und ein gesundes muss man durch keratoplastischer Operationen transplantiert werden. Genetische Störungen oder Defekte in der Netzhaut-Funktion kann beeinträchtigt Vision. Menschliche Auge Globen kann für verschiedene chirurgische Verfahren wie Augen-Banking, Transplantation menschlicher Hornhaut oder Lederhaut und Forschung auf Augengeweben verwendet werden. Allerdings gibt es wenig Informationen über die menschliche Hornhaut und Netzhaut-Exzision, wahrscheinlich aufgrund der limited Zugang zu menschlichen Geweben. Die meisten Studien beschreiben ähnliche Verfahren an Tiermodellen durchgeführt. Forscher verlassen sich auf die Verfügbarkeit von gut präpariert und gut erhaltenen Augengeweben um das Wissen über menschliche Auge Entwicklung, Homöostase und Funktion zu verlängern. Da wir hohe Menge an okularen Globen, aus denen ca. 40% erhalten (Tabelle 1) von ihnen zu Forschungszwecken verwendet werden, sind wir in der Lage, sehr große Menge von Experimenten an diesen Geweben führen, definieren Techniken, um Verbrauchsteuern und bewahren Sie sie regelmäßig.

Die Hornhaut ist eine avaskuläre Gewebe, das die Übertragung von Licht auf die Netzhaut ermöglicht und zu diesem Zweck sollte immer ein gutes Maß an Transparenz. Innerhalb der Hornhaut, hilft der Limbus Region, die ein Reservoir der Stammzellen ist, den Wiederaufbau von Epithelzellen und beschränkt die Wucherung der Bindehaut Aufrechterhaltung Hornhaut Transparenz und Klarheit. Die Größe und th ickness der Hornhaut sind entscheidend für die klare Vision, wie Änderungen in einer von ihnen ablenken, unklare Vision führen könnte. Die Hornhaut besteht aus 5 Schichten: a) Epithel, b) Bowman-Schicht, c) Stroma, d) Descemetschen Membran und e) Endothel. Alle Schichten sollten einwandfrei funktionieren, um sicherzustellen, klare Vision ^4,5,6. Die Aderhaut ist die Zwischenschicht zwischen der Tunika Sklera und der Retina, auf der Innenseite durch die Bruch-Membran begrenzt und ist verantwortlich für den Blutfluss in die Augen. Die Choroidea hilft auch, um die Temperatur und liefert Nahrung zu den äußeren Schichten der Netzhaut ^5,6 zu regeln. Die Retina ist eine Schicht von Nervengewebe, das die Rückseite des Augapfels (Suppl. 1) umfasst und besteht aus zwei Teilen: einem lichtempfindlichen Teil und einen nicht-empfänglichen Teil. Die Netzhaut hilft, das Licht von der Hornhaut und der Linse zu erhalten und wandelt sie in der chemischen Energie schließlich an das Gehirn mit Hilfe des Sehnervs ^5,6 übertragen.

ove_content "> Das Ziel dieses Papiers ist es, ein Protokoll für die Präparation des Hornhaut-und Netzhaut-Gewebe aus menschlichen Auges Globen stellen. Vermeidung von Kreuzkontaminationen in das umgebende Gewebe und die Erhaltung RNA-Integrität ist von fundamentaler Bedeutung als solche Gewebe zu Forschungszwecken ausgerichtet sind unverzichtbar an (i) die Charakterisierung der Transkriptom der Augengewebe, (ii) Isolierung von Stammzellen für die regenerative Medizin-Projekte, und (iii) Bewertung der histologischen Unterschiede zwischen den Geweben von normal / den betroffenen Fächern. In diesem Beitrag beschreiben wir die Technik, die wir derzeit zur Entfernung Die Hornhaut, die Aderhaut und Netzhaut-Gewebe aus einem Augapfel. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für das Sezieren des menschlichen Augapfels und der Entfernung der Hornhaut und Netzhaut-Gewebe. Das dazugehörige Video wird den Forschern helfen, eine geeignete Technik für den Abruf lernen von kostbaren menschlichen Geweben, die schwer zu finden sind regelmäßig.

Protocol

1. In-situ-Exzision der Hornhaut von Ocular Globes

1. Schalten Sie die laminare Luftströmung Schrank ca. 15 Minuten vor dem Gebrauch. Reinigen Sie die Sterilbank mit 70% Isopropylalkohol. Setzen Sie auf persönliche Schutzkleidung wie OP-Mütze und Maske. Schrubben Sie Hände und Unterarme und trocknen Sie mit einem sterilen Tuch. Trage sterile Handschuhe und Kittel oder Hülsen unter aseptischen Bedingungen.
2. Richten Sie den sterilen Bereich, indem ein steriles Instrument Tablett aseptisch. Stellen Sie sicher, dass die Instrumente steril sind. Öffnen Sie die sterile Instrumente und Flip-Pack auf den sterilen Bereich Vermeidung jeglicher Kontamination.
3. Positionieren Sie alle sterilen Materialien und Instrumente (Tabelle 2) zusammen mit Flaschen (Auge Gläser) mit Auge Globen, so dass sie neben dem Rand des sterilen Feldes für Benutzerfreundlichkeit sind.
4. Beschriften Sie die Flaschen mit vorher vorbereitete Konservierung / Speichermedium wie in Tabelle 3 angegeben und legen Sie diem auf der Oberfläche des laminaren Luftstrom Haube gemeinsam mit I-PVP (Polyvinylpyrrolidon Iod-), Natriumthiosulfat und einer sterilen Kochsalzlösung PBS (phosphatgepufferter Kochsalzlösung).
5. Lassen Sie die Augengewebe und Lösungen in den normalen Raumtemperatur erreichen, wie sie in Kühlschränken bei 4 ° C aufbewahrt werden Vermeiden Sie wiederholte Erwärmung / Abkühlung Zyklen. Halten die Deckel der Lösung und das Auge Gläser mit inneren Seite nach oben neben dem entsprechenden Gefäßen.
6. Entfernen Gaze und Schwämme aus dem Auge Glas mit einer sterilen Pinzette. Tauchen Sie den Globus in sterilen I-PVP 0,5% für 2 Minuten auf die Augen-Globen zu dekontaminieren. Platzieren Sie die beiden Zangen am Deckel des sterilen Behälter, außerhalb des sterilen Feldes. Übertragen Sie die Welt in Natriumthiosulfat 0,1% für 1 Minute mit einem anderen Paar sterilen Pinzette. Mit den gleichen Zangen, überweisen Sie den Globus, um die Flasche mit steriler Kochsalzlösung (PBS) und lassen Sie ihn, bis er betrieben wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den anderen Augapfel von ter demselben Spender.
7. Arbeiten unter dem Laminar Air Flow Kapuze, wickeln Sie den Globus mit steriler Gaze (Bandagen) Verlassen der Hornhaut und Lederhaut ca. 5 mm von der Hornhaut freigelegt. Das Auge Glühbirne könnte einfach in der Hand Aufrechterhaltung des angemessenen Druck gehalten werden. Das Gewebe sollte feucht gehalten werden während der gesamten Operation.
8. Zangen sind zusammen mit einer Schere benutzt, um alle eventuellen Resten der Bindehaut zu entfernen. Halten Sie die Instrumente für die obige Operation getrennt von anderen Instrumenten eingesetzt. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen skleralen Einschnitt von 3-4 mm vom Limbus Region durchzuführen, dann verlängern die Schnitt um 360 °, die Vermeidung, die zugrunde liegende Uvea perforieren oder zu keiner Verformung der Hornhaut des normalen Krümmung. Schneiden Sie vier große Einschnitte Verlassen vier kleine Lücken zu vermeiden die Sekretion des Glaskörpers. Alle vier Lücken geschnitten Gewährleistung keine Entfernung von jedem anderen Gewebe.
9. Vorhandensein von kleinen Sklera-Plaques kann das Schneiden behindern, so stellen Sie sicher, compLete die Sklera Exzision mit mikrochirurgischen Schere. Dieser Vorgang sollte ohne Beschädigung der Aderhaut, Netzhaut und des Glaskörpers durchgeführt werden.
10. Untersuchen Sie den Einschnitt, um sicherzustellen, es ist vollständig. Wenn der Schnitt ist richtig der Corneo-Sklera-Felge haftet an den Ziliarkörper nur an dem Punkt, in Korrespondenz mit der Hornhaut durchgeführt.
11. Stellen Sie den Augapfel nach unten eingewickelt in der Nähe der Mitte des sterilen Feldes. Füllen Sie das Hornhaut-Entfernung mit einer Pinzette, um die Sklerarand stationäre und die Hand zur Exzision verwendet, um den Ziliarkörper-Aderhaut nach unten und weg von der Hornhaut-Sklera-Taste ziehen zu halten.
12. Vorsichtig trennen Sie alle verbleibenden Verwachsungen von der Hornhaut-Sklera-Taste. Weder ziehen die Hornhaut-Sklera-Felge in einer Weise, die Cross-Hornhaut Spannungen führen könnten, und vermeiden Sie fallen wieder nach unten auf die vordere Kammer.
13. Die Endothelzelldichte der Hornhaut wird anhand eine hypotonische Lösung und die Zellmortalität wird anhand einer Trypsinein Blau-Färbung für etwa 1 min und die Zellen werden dann unter einem optischen Mikroskop gezählt und gemessen, wie Zellen / mm ^2. Die Vorderkammer sollte nach den Deckel während der hintere den Boden der Petrischale stellen sollte. Die Endothelzelldichte könnte manuell gezählt werden mit einem Gitter in dem Ziel von 100-facher Vergrößerung. Die mindestens benötigte Zellzahl für die Transplantation in Italien ist 2200 Endothelzellen / mm ^2.
14. Übertragen der Cornea-Sklerarand Verwendung einer Hornhaut Klaue zuvor hergestellten Hornhaut Speichermedium bei RT (Raumtemperatur), wie in Tabelle 3 gezeigt erhalten.
15. Untersuchen Sie die hintere Kammer für einen natürlichen Linse. Wenn die Lederhaut ist bereit, entfernen Sie alle Rückstände von Uvea und Glaskörper aus der ganzen Welt. Vorsichtig auspacken und zurück den verbleibenden hinteren Segment ihrer jeweiligen Auges Glas, unter aseptischen Bedingungen. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Welt mit neuen Instrumenten. Befestigen Sie die Hornhaut Witzh Hornhaut Klaue und bewahren unter den Speichermedien (Organkultur) bei 31 ° C Das herausgeschnittene Hornhaut, wie in Abbildung 1a dargestellt ist, kann dann für Keratoplastik oder Forschung verwendet werden.
16. Entsorgen Sie die nicht benötigten Materialien und Bio-gefährlicher Abfälle in geeignete Abfallbehälter. Reinigen Sie den Arbeitsbereich, sobald die Arbeit abgeschlossen ist mit 70% Isopropylalkohol Spray.
17. Wenn nach 28 Tagen die Hornhaut behält alle Bewertungsparameter [wie Morphologie, Zellzahl, Transparenz, Dicke und mikrobiologische Tests - Bakterien und Pilzen mit BACTEC 9240 Instrument (Becton Dickinson, Mailand, Italien)], kann es dann zu transportierenden die Krankenhäuser mit dem Transportmedium in Tabelle 4 gezeigt. Die Hornhaut sollte entfernt und platziert aus dem Speicher zu Medium unter Laminar Air Flow Schrank zu transportieren.
18. Da während der Lagerung, die Hornhaut dicker als seine übliche Größe für eine Transplantation erforderlich wird, verwenden Auge Banken de-Quellmittel, um Dicke zu reduzieren. Wirnutzen 6% Dextran T500, um die Hornhaut wieder zu seiner normalen Größe in Transportmedium. Obwohl 4-8% Dextran T500 verwendet werden könnte, hat 6% für uns am besten gedient. Dies macht es einfacher für die Chirurgen, um die Hornhaut, sobald sie es empfangen zu transplantieren.

2. Das Ausweiden der Netzhaut von der Augapfel nach dem Herausschneiden der Hornhaut

1. Nach der Exzision wird die Hornhaut für die Transplantation oder Forschung auf der Grundlage seiner Morphologie und Endothelzelldichte ausgewählt ist und in der Aufnahme bzw. Konservierung Medium bei 31 platziert ° C Die verbleibenden des Augapfels wird dann zur weiteren Verwendung wie Sklera Isolierung für chirurgische Zwecke verarbeitet, Netzhaut der Forschung usw.
2. Vor der Netzhaut Exzision, stellen Sie sicher, dass der Augapfel intakt und nur die Hornhaut mit einem Teil der Lederhaut entfernt ist. Wenn die gelatinöse Glaskörper absondert heraus, dass es schwierig wird, ein Netzhaut-Gewebe zu entfernen.
3. Wenn der Spender ist unter 65 Jahre alt, ist die Lederhauterhalten unter sterilen PBS für chirurgische Zwecke nach serologische Untersuchungen. In diesem Fall wird die Sklera geschnitten, nur die Glaskörper entfernt und die gesamte Sklera erhalten.
4. Für retinalen Exzision, mit einem kleinen Schnitt oder Schnitt von der Seite der Hornhaut-Sklera Weg zu den Sehnerv mit einer sterilen Pinzette und Schere zu starten. Halten Sie den Teil der Lederhaut mit einer Pinzette und schneiden mit der Schere direkt in Richtung des Sehnervs Schneiden Teil für Teil Vermeidung von Schäden in den Glaskörper.
5. Choroidales Plaques sollten aus der Lederhaut getrennt werden, wie sie aneinander haften. Schneiden Sie die gesamte Lederhaut, die Aderhaut Gewebe freizulegen. Sobald der Lederhaut ganz abgeschnitten ist, trennen Sie die Lederhaut mit dem verbleibenden des Glaskörpers durch Schneiden in der Nähe des Sehnervs. Ein ganzes Knäuel Glaskörper mit Aderhaut gedeckt wird sichtbar, wie in Abbildung 2a dargestellt.
6. Mit zwei sterilen Pinzette entfernen Sie die Aderhaut sanft, indem man es mit einemZange und Entfernen mit dem anderen. Alternativ kann die Aderhaut mit einer Schere entfernt werden, aber dies sollte idealerweise vermieden werden, da Schäden an der Netzhaut verursacht werden kann. Entfernen Sie die Aderhaut teilweise und schneiden Sie es, um das Entfernen zu erleichtern.
7. Sobald der Aderhaut entfernt wird, wird eine transparente Schicht der Netzhaut deutlich gesehen, wie in Abbildung 2b gezeigt werden. Die Aderhaut eine innere Bruch-Membran, die auch entfernt werden konnten, aber es ist schwierig, sie mit dem bloßen Auge zu erkennen.
8. In ähnlicher Weise, verwenden Sie zwei Zangen, um die Netzhaut zu entfernen, wie in Abbildung 2c gezeigt. Es ist einfach, eine hohe Menge von Retina, wenn in der Nähe des Sehnervs ausgeschnitten zu isolieren. Alle Schichten des Auges kann nun zu sehen ist, wie in 2d gezeigt.
9. Sobald der retinalen Gewebe entfernt wurde, könnte es für verschiedene Zwecke verwendet werden und daher die nachfolgenden Schritte und Bedingungen für die Konservierung verwendet werden, können entsprechend abweichen. Zum Beispiel,Das Retinagewebe in Röhrchen, die RNA-Stabilisierung Reagenzien (z. B. RNAlater) oder Lyse-Puffer (RNA oder DNA-Extraktion), Dispase / Trypsin (für die Isolierung von Zellen), Fixierlösungen (vor Gewebe in Paraffin eingebettet oder ÜLG gebracht werden Immunhistochemie).
10. Alle löschen den Arbeitsbereich und reinigen Sie den Bereich mit 70% Isopropylalkohol Spray.

3. Repräsentative Ergebnisse

Die Hornhaut-Sklera-Felge, wie in Abbildung 1a zu sehen ist ein richtig ausgeschnitten Hornhaut mit erforderliche Menge an Sklerarand und endotheliale Morphologie, diese Art der Hornhaut wird in der Regel für Keratoplastik verwendet. Wenn die vordere Stroma der Hornhaut mit ausgeschnitten Gegenwart von Opazität beschädigt ist, kann die Hornhaut für Endothel Keratoplastik / posterioren lamellären Keratoplastik (Endothel mit einem Teil des Stroma) verwendet werden. Für den Fall der Endothel-Schicht beschädigt ist oder wenn die Endothelzelldichte ist <2200 Zellen / mm ² (Esalian Standard), könnte die Hornhaut für die vorderen lamellären Keratoplastik (Epithel mit einem Teil des vorderen Stroma) verwendet werden. Wenn die endotheliale Zellen kleiner ist als der Bedarf könnten die Hornhaut für die anteriore lamelläre Keratoplastik oder Forschung verwendet werden, während, wenn die Cornea vollständig beschädigt ist, in der Forschung verwendet werden könnte, wie in 1b, 3b und 3c gezeigt, oder verworfen. Der Schaden könnte eine Ursache für ordnungsgemäßen Umgang mit dem Gewebe sein, vor Kataraktoperationen, die zu Stroma-oder Endothelzellen Descemet Narben, die Entwicklung von Verletzungen während das Leben des Patienten usw. Daher wird es notwendig, jedes Gewebe mit Spaltlampe und überprüfen Sie dann unter dem optischen Mikroskop für feine Narben / Falten / Abteilungen. Die Hornhaut ist in der Regel unter zwei verschiedenen Bedingungen wie Organkultur (ca. 31 ° C) in der Regel in den europäischen Ländern oder Hypothermie verwendet (etwa 4 ° C) in der Regel in den USA verwendet. Erhalten Wir verwenden Organkultur, wie es um den Damm zu regenerieren hilftim Alter von Epithelzellen, neu zu beleben Endothelzellen Scheck mit einer hohen post mortem Zeit, gibt eine Lagerzeit von 4 Wochen, die ausreicht, Fenster gibt für die Planung einer Operation, ausreichend Zeit für die mikrobiologische (Bakterien und Pilze) und serologische Untersuchungen der Hornhaut usw. können auch im Transportmedium für 7 Tage aufbewahrt werden.

Die Sklera konnten Stück für Stück eine schonende Entfernung aller choroidalen Plaques geschnitten werden. Der Glaskörper Flüssigkeit ausscheiden kann, wenn der Sehnerv, Netzhaut oder Aderhaut ist scharf wie in Abbildung 4 dargestellt geschnitten. Netzhäute, wenn für die RNA-Analyse ausgeschnitten sollte in RNAlater erhalten, sobald die Gewebe herausgeschnitten sind. In der Regel 1x1 cm der Aderhaut und Netzhaut wird ausgeschnitten und nach halten sie in RNAlater für 24 Stunden bei 4 ° C unter -80 ° C konserviert in frischen Eppendorf-Röhrchen (Safe-Lock Reaktionsgefäße, 2 ml) bis zur Verwendung oder Auslieferung mit einem trockenen Eis. Die Netzhautgewebe sollten exzidiert mit zwei Pinzetten in der Nähe des Sehnervs weg von Iris werdenoder Ciliarrande um eine Kontamination mit anderen pigmentierte Strukturen zu vermeiden und sollte auf die Erhaltung Behälter überführt werden sofort als RNA instabil wird beim Abrufen der Netzhaut.

Abbildung 1: Vergleich zwischen einer guten und einer schlechten Qualität Hornhaut:. A) Ein richtig ausgeschnitten Hornhaut. Eine solche Hornhaut ist in der Regel unter Organkultur 4 Wochen lang aufbewahrt. Mikrobiologische (BACTEC 9240 mit Instrument) und morphologischen (Färbung der Zellen mit Trypanblau für Zellmortalität Bestimmung und Beobachtung von Zellen unter einem optischen Mikroskop mit 100facher Vergrößerung) Prüfung wird vor dem Transport ins Krankenhaus (Abbildung 3a) durchgeführt, b) eine gebogene Hornhaut , die schließlich führt zu Abstoßungsreaktionen durch hohe Descemet-Falten und hohe Endothelzellschäden unter Verwendung eines Spaltlampenmikroskop. Eine solche Hornhaut ist in der Regel für res verwendetcrystal oder verworfen wird.

Abbildung 2. Methode verwendet, um eine genaue Exzision des retinalen Gewebes sicherzustellen. A) Grundlagen zur Lederhaut aus dem Augapfel mit 24mm Klinge mit 95 mm gebogen oder stumpfen Ende einer sterilen Schere und 100 mm 11x2 von 0,70 mm Zähne sterilen Pinzette regiert. Die Sklera sollte, indem die eine Seite mit der Pinzette Schneiden Sie ihn gerade zum Sehnerv hin mit Hilfe der Schere geschnitten werden. Die Aderhaut wird nun leicht gesehen werden, b) Verwendung von zwei 100 mm 11x2 von 0,70 mm Zähne sterilen Pinzette ausgeschlossen, Aderhaut wird durch Abreißen entfernt, das zeigt die zugrunde liegenden transparenten Schicht der Netzhaut, c) Transparente Schicht der Netzhaut wird sehr sorgfältig in der Nähe exzidiert der Sehnerv ohne Ausscheidung von Glaskörperfluid mit den gleichen Zange. Sowohl die Zange halten sollte jede Seite der Netzhaut, und das Gewebe sollte vorsichtig entfernt werden starting in der Nähe des Sehnervs Weg zu der Hornhaut, um eine gute Menge von Netzhaut-Gewebe zu erhalten. Das Gewebe könnte in verschiedenen Größen geschnitten werden und für die Analyse Versuche, d) verschiedene Schichten des Auges nach Entfernen der Hornhaut kann in dieser Figur gesehen werden. Die Choroidea Körper entfernten ersten gefolgt von Retina ohne Beschädigung der anderen Teile des Auges.

3. Vergleich der verschiedenen Zelltypen Dichte und Morphologie unter 100-facher Vergrößerung eines optischen Mikroskop betrachtet. A) Gute Endothelzelldichte (> 2200 Zellen / mm ²⁾ und Morphologie (weniger Polymorphismus niedrigen Degeneration, keine Dystrophie und 0% Mortalität) in einer Hornhaut, die für eine Transplantation geeignet ist, b) Mangelhaft Endothelzellen Dichte (etwa 1200 bis 1400 Zellen / mm ²⁾ und Morphologie (sehr hohen Polymorphismus und DegenerationZusammenarbeit von Zellen) zusammen mit etwa 30-40% Gesamtmortalität Nach Trypanblau-Färbung beobachtet, c) Ein Teil der endothelialen Zellen geschädigt werden durch Lösen eines Endothelzellen Folie beim Abrufen der Hornhaut von Augapfel. Dies wird durch Beobachtung der Mortalität der Zellen in der Region durch Trypanblau gefärbt bestätigt, d) die Descemetsche Falten aufgrund falscher Handhabung der Hornhaut durch Biegen, wodurch Querschnitt Hornhaut Spannung unter Verwendung von Instrumenten stark usw. an die Exzision ausgebildet. Die Abbildung zeigt die dicke entwickelten iatrogene Falten zwischen Peripherie und optischen Zone der Hornhaut gefunden.

Abbildung 4. Schäden an der Aderhaut und Netzhaut-Gewebe während Exzision der Hornhaut führt schließlich zu einer Ausscheidung von Glaskörperfluid. Die Netzhaut wird im Glaskörper verwickelt macht es schwierig, eine gute Qualität Verbrauchsteuern Gewebe wiThout Kontamination.

Tabelle 1. Zusammenfassung der Reihe von Aktivitäten durchgeführt, unter Verwendung von humanen okulären Globen Jahren 2009 und 2010 der Fondazione Banca degli Occhi (Venezia, Italien). Etwa 60% der Gewebe wurden zur Transplantation verwendet, womit eine hohe Anzahl von Augen-Kugeln (ca. 40%) für wissenschaftliche und medizinische Forschung.

Ergänzende Abbildung 1. Anatomie des menschlichen Auges ^5. Verschiedene Teile des menschlichen Auges in dieser Figur gezeigt ist, verwendet, um die genaue Position der Gewebe folgen.

Discussion

Sowohl richtige Exzision und Haltbarmachung von Hornhaut und Netzhaut-Gewebe sind kritisch, da kleinere Mängel wie endotheliale Schäden oder hohe Anzahl von Descemet-Falten können Transplantatversagen der Hornhaut während Temperaturänderungen oder falscher Handhabung kann die Integrität der retinalen Gewebe Kompromittierung führen. Das Ziel dieser Arbeit ist es zu zeigen, wie Hornhaut und Netzhaut-Gewebe optimal isoliert werden kann, ohne Schäden oder Veränderungen zu induzieren, die ihre Verwendung zur Transplantation oder Forschungszwecken gefährden könnten. Die erforderliche minimale Zelldichte (> 2200 Zellen / mm ^2), gute Morphologie wie Zellgröße sind; geringe Degeneration interzellulären Grenzen und Abwesenheit von Dystrophie mit guter Transparenz und richtige Dicke der Hornhaut Merkmale, die ein Gewebe für machen Transplantation. Wenn das Skalpell wird grob oder andere Instrumente eingesetzt werden intensiv genutzt, ist es nicht nur Schäden an der Hornhaut, sondern auch der Glaskörper, die furt machtihrem Exzision anderer Gewebe schwieriger (Abbildung 4). Retina ist ein transparentes Gewebe und daher schwierig zu identifizieren, wenn die glasartige Flüssigkeit dazu freigegeben wird, ist dies normalerweise Exzision des Retinagewebes komplizierter. Wenn mit Glaskörper herausgeschnitten wird die Qualität des retinalen Gewebe-oder RNA extrahiert sehr schlecht auf eine Kontamination mit anderen Augen-Teile. Daher ist eine geeignete Technik, um eine Verbrauchsteuer Hornhaut oder Netzhaut sehr wichtig, eine hohe Qualität Gewebe abzurufen.

Unsere bisherigen Daten aus den letzten zwei Jahren (Tabelle 1) zeigen, dass ca. 60% der Hornhäute, die wir von Auge Globen geeignet für verschiedene Arten von Transplantationen sind. Dies ist ein weiterer Beweis, dass die Hornhaut Exzision Technik in diesem Beitrag beschrieben eine gute Methode zur Erfassung von hoher Qualität Hornhautgewebe von Ocular Globen ist. Die Hornhäute kann natürlich als ungeeignet für die Transplantation durch andere Parameter such als Stroma-Anomalien, Kontamination, endotheliale Dichte / Morphologie, Eignung des Spenders und mechanischen / physikalischen Trauma verursacht unter Beibehaltung der Hornhaut. Wenn jedoch die oben genannten Parameter in Ordnung sind, kann die Technik, die wir hier beschrieben Abrufen von guter Qualität Gewebe für die Transplantation bei Patienten mit Erkrankungen der Augenoberfläche verwendet werden.

Während Informationen über Ausnehmen von Netzhautgewebe aus Tiermodellen ist weit verbreitet ^11,12, um unserem Wissen ist dies das erste Mal, dass eine derartige Technik zur Isolierung von retinalen Gewebe von menschlichen Auges Kugeln beschrieben. In der Tat, Forschung über die Literatur, ergaben keine Ergebnis auf Papiere der Erörterung dieses Themas. Wir glauben, dass, wenn die menschliche Augapfel Dissektion wird wie beschrieben durchgeführt, Wissenschaftler der Lage wäre, Gewebe von guter Qualität haben, um für ihre Forschungsprojekte verwendet werden. Viele Auge Banken auf der ganzen Welt sind wahrscheinlich Auge Glühbirnen (aber auch Hornhäute), die nicht s empfangenuitable für die Transplantation. In unserem Fall können fast 40% der Hornhaut (Auge und Zwiebeln), die wir sammeln und zu verarbeiten nicht transplantiert werden (aufgrund einer Vielzahl von Ursachen) werden konnte aber noch zu Forschungszwecken verwendet werden. Die Technik in diesem Papier beschrieben tut erlauben die Sammlung von qualitativ hochwertigen Geweben. Dies wurde kürzlich von unserer Arbeitsgruppe gezeigt, bei der Analyse von RNA mit T <24 Stunden von Netzhaut-Gewebe, die geerntet werden unter Verwendung der Technik in diesem Papier ¹⁰ beschrieben wurden extrahiert. Wir glauben, dass die gleiche Technik verwendet werden könnten, um die Netzhaut-Gewebe für viele andere verschiedene Zwecke wie zum Beispiel (i) für Netzhaut-Transkriptom-Studien, (ii) zu untersuchen und fördern die Verwendung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in der personalisierten Medizin ⁸ zu isolieren, (iii ) zu entwickeln RNA-Expression Atlas von Retinitis Pigmentosa Gene in der menschlichen Netzhaut ^9, (iv) die RNA-Extraktionsverfahren, (v) zu optimieren Stammzellen Studien retinalen Gewebe zu regenerieren, etc.

Diese Technik wkrank von Nutzen sein für diejenigen, die solche Exzisionen oder Experimente durchführen möchten, haben aber begrenzte Informationen über die Verfahren für die menschliche Hornhäute oder Netzhaut zu verwenden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials for excision of cornea and retina.
Guarded disposable scalpel	Blade size 15	Swann-Morton
Sterile bandages	5 cm X 5 cm, 8 layered, 5 pcs	Artsana
Sterile disposable medical towel	35 X 50 cm	U.Jet
Sterile scissors	Blades 24 mm / overall length. 95 mm curved, blunt	e.janach
Sterile forceps	Stainless steel -100 mm 11 X 2 ruled by 0.70 mm teeth	e.janach
Corneal claw – Disposable medical device		NIIOS (Hippocratech)
PBS	100 ml PBS [10x] in 900 ml d/w (distilled water)	Sigma-Aldrich
Na-thiosulphate	1 gm Na-thiosulphate in 1 litre of PBS [1x]	Sigma-Aldrich
I-PVP	5 gm I-PVP in 1 litre d/w	Sigma-Aldrich
Table 2. The table describes the materials used for excision of cornea and retina and the company they are received from.
Materials for storage medium (2000 ml).
MEM (1X) liquid	Invitrogen	32360-034
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-039	1mM (10ml/l)
L-glutamine	Invitrogen	25030-032	2mM (10ml/l)
Antibiotic/antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955-20ML	10ml/l
Newborn calf serum	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml/l)
Table 3. Materials for storage medium.
Preparation of storage medium
Add all the ingredients using the specific concentrations as given above in a jar and mix well. Filter them using pore size of 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) with help of a peristaltic pump. Preserve the medium in the bottles at RT.
Materials for transport medium (2000 ml).
MEM (1X) liquid	Invitrogen	32360-034
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-039	1mM (10 ml/l)
L-glutamine	Invitrogen	25030-032	2mM (10 ml/l)
Newborn calf serum	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml/l)
Dextran t500	Pharmacosmos	551005004007	6% (60 gm/litre)
Table 4. Material for transport medium.
Preparation of transport medium
Add Dextran 6% in ~ 1.5 litre of MEM and leave it overnight. Add the rest of ingredients in the media and filter using 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) using a vacuum pump. Preserve the medium in the bottles at RT.