Упрощенная Техника Published: June 12, 2012 doi: 10.3791/3765

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Mohit Parekh¹, Stefano Ferrari¹, Enzo Di Iorio¹, Vanessa Barbaro¹, Davide Camposampiero¹, Marianthi Karali², Diego Ponzin¹, Gianni Salvalaio¹

¹Fondazione Banca Degli Occhi del Veneto O.N.L.U.S., ²Telethon Institute for Genetics & Medicine (T.I.G.E.M.)

Summary

В статье описывается упрощенная техника акцизного роговицы и сетчатки потрошить тканей глазной шар трупа человека доноров. Техника, описанная здесь поможет акцизного хорошее качество ткани использовать для трансплантации, хирургическому или исследовательских целей, не повреждая другие ткани глазного шара.

Protocol

1. В местах иссечения роговицы от глазных глобус

1. Включите ламинарного потока воздуха шкаф примерно 15 минут перед использованием. Очистите капот ламинарного потока с использованием 70% изопропилового спирта. Положите на индивидуальную защитную одежду, таких как хирургические шапки и маски. Скраб для рук и предплечий и вытереть их насухо стерильной салфеткой. Носите стерильные перчатки и халат или рукава использованием асептических условиях.
2. Настройка стерильной зоне, поставив стерильный лоток инструмент стерильно. Убедитесь, что инструменты стерильны. Откройте стерильный пакет инструментов и щелкнуть на поле стерильными избежать любого загрязнения.
3. Поместите все стерильные материалы и инструменты (табл. 2), а также бутылки (банки глаз), содержащий глаз шары так, чтобы они примыкают к краю стерильной зоны для удобства использования.
4. Этикетка бутылки с заранее подготовленного сохранение / носителе, как это указано в таблице 3 и поместитем на поверхности ламинарного потока воздуха капотом вместе с I-ПВП (поливинилпирролидон йода), тиосульфата натрия и стерильным физиологическим раствором PBS (фосфатный буфер солевом растворе).
5. Позвольте глазные ткани и решений для достижения нормальной комнатной температуре, поскольку они хранятся в холодильниках при температуре 4 ° C. Избегайте повторных потепление / циклов охлаждения. Держите крышки решения и глаз банки с внутренней стороной вверх рядом с их банками.
6. Удаление сетки и губки от глаз банке стерильным пинцетом. Погрузитесь мире в стерильный I-PVP 0,5% в течение 2 минут для очистки глазных глобусы. Поместите два пинцета на крышке стерильный лоток, вне стерильной зоны. Передача мира в тиосульфата натрия 0,1% в течение 1 минуты с помощью другой пары стерильных щипцов. Используя те же щипцы, передает земного шара, чтобы флакон, содержащий стерильный физиологический раствор (PBS) и оставить его, пока он работает. Повторите ту же процедуру для другого мира глазных от тон же донора.
7. Рабочие под капотом поток воздуха ламинарным, обернуть земной шар стерильные марлевые (бандажи), оставляя роговицы и около 5 мм склеры с роговицей раскрыты. Глаза лампы можно просто держать в руке поддержания нормального давления. Ткань должна быть влажной в течение всего операция.
8. Щипцы используются вместе с ножницами, чтобы удалить все возможные остатки конъюнктивы. Держите инструменты, используемые для этой операции отдельно от других инструментов. Используйте лезвие скальпеля для выполнения разреза склеры в 3-4 мм от лимба регионе, то расширить разрез на 360 °, не допуская к перфорации основного увеальной ткани или вызывать деформацию нормальной кривизны роговицы. Отрежьте четыре больших разрезов оставив четыре небольших недостатков избежать выделения стекловидного тела. Все четыре пробелы вырезаются обеспечение не удаление любых других тканей.
9. Наличие небольшого склеры бляшки могут помешать резки, поэтому убедитесь, что компЛете склеры вырезание ножницами микрохирургии. Эта операция должна быть выполнена без повреждения сосудистой оболочки, сетчатки и стекловидного тела.
10. Проверьте разрез чтобы убедиться в его полной. Если разрез был выполнен правильно Corneo-склеры обода придерживается цилиарного тела только в точке в соответствии с роговицы.
11. Установить завернутый глазной шар вниз рядом с центром стерильной зоне. Завершите удаление роговицы с помощью щипцов для хранения склеры обода стационарных и рука используется для удаления тянуть цилиарного тела, сосудистую оболочку вниз и от склеры Corneo-кнопку.
12. Аккуратно отделить оставшиеся спайки с Corneo-склеры кнопку. Ни вытащить Corneo-склеры край таким образом, что может привести к перекрестной роговицы напряжения, ни позволить ей бросить вниз на передней камере.
13. Эндотелиальных плотность клеток роговицы проверяется с помощью гипотонического раствора и клетка смертность проверяется с помощью Trypсиняя окраска около 1 мин, и клетки, затем учитываются в оптический микроскоп и измеряется как клеток / мм ^2. Передняя камера должна быть обращена к крышке, а задние приходится сталкиваться в нижней части чашки Петри. Эндотелиальные клетки плотности можно пересчитать вручную с помощью сетки в цель при увеличении 100х. Минимальная принято клеток для трансплантации в Италии составляет 2200 эндотелиальных клеток / мм ^2.
14. Передача Corneo-склеры обода использованием роговицы когтей на заранее подготовленные роговицы носителе сохраняется при комнатной температуре (комнатной температуры), как показано в таблице 3.
15. Проверьте заднюю камеру для естественного хрусталика. Если склеры готово, удалите все остатки сосудистая оболочка глазного яблока и стекловидного тела с земной шар. Осторожно развернуть и вернуть оставшуюся заднюю часть с соответствующим банка глаз, с использованием асептических условиях. Повторите процедуру для других миру с помощью новых инструментов. Закрепите роговицы остроумиеч роговицы когтей и сохранить под носители (орган культуры) при 31 ° C. Вырезали роговицы, как показано на рисунке 1а, могут быть использованы для кератопластики или исследования.
16. Утилизировать ненужных материалов и биологически опасных отходов в соответствующие мусорные баки. Очистите рабочую область после завершения работ с использованием 70% изопропиловый спирт спрей.
17. Если после 28 дней роговица сохраняет все оценки параметров [такие, как морфология, клеток, прозрачности, толщины и микробиологии тестов - бактериальные и грибковые использовании инструмент Bactec 9240 (Becton Dickinson, Милан, Италия)], это могут быть доставлены в больницы использованием транспортной среды приведены в таблице 4. Роговицы должны быть удалены и помещены на хранение в транспортную среду в ламинарный шкаф воздушного потока.
18. Как во время хранения, роговица становится более толстым, чем его обычный размер необходимых для трансплантации глаза банки используют де-набухание агентов уменьшить толщину. Мыиспользовать 6% декстрана T500, чтобы получить роговицы обратно в нормальный размер, в транспортной среды. Хотя 4-8% декстрана T500 может быть использован, 6% послужило для нас лучше. Это облегчает для хирургов пересадки роговицы, как только они получают его.

2. Потрошение сетчатки от глазных Globe после вырезания роговицы

1. После удаления, роговицы выбран для трансплантации или исследования, основанные на морфологии и эндотелиальных клеток и плотность находится в хранении и сохранение среды при 31 ° C. Остальные глазного миру затем обрабатывается для дальнейшего использования, такие как изоляция склеры для хирургических целей, сетчатки для исследований и т.д.
2. До удаления сетчатки, убедитесь, что глазные мире цела, и только роговица с частью склеры удаляется. Если желатиновых стекловидным телом является выделять из этого становится трудно удалить ткани сетчатки.
3. Если донор находится ниже 65 лет, склерысохраняется при стерильной PBS для хирургических целей после серологического тестирования. В этом случае, склеры не вырезано, только в стекловидное тело удаляется, а все склеры сохраняется.
4. Для удаления сетчатки, начните с небольшой разрез или разрез от роговицы сторону склеры движется в направлении зрительного нерва использованием стерильного пинцета и ножниц. Держите части склеры с помощью щипцов и вырезать ножницами прямо к зрительному нерву резка по частям избежать повреждения стекловидного тела.
5. Хориоидеи таблички должны быть отделены от склеры, как они слиплись. Вырезать все склеры, чтобы разоблачить сосудистой ткани. После того, склера полностью вырезать, отделить склеры с остальными стекловидного тела за счет сокращения его рядом зрительного нерва. Весь шар стекловидного тела покрыта сосудистой будет видно, как показано на рисунке 2а.
6. Использование двух стерильных щипцов удалите слой сосудистой оболочки осторожно поднять его с однимПара щипцов и удаления его с другими. Кроме того, сосудистого слоя можно удалить с помощью ножниц, но это в идеале должны избегать, так как это может привести к повреждению сетчатки. Удалите слой сосудистой оболочки частично и разрезать его, чтобы облегчить удаление.
7. После того, сосудистое слой удаляется, прозрачный слой сетчатки будет хорошо видно, как показано на рисунке 2б. Сосудистого слоя мембраны Бруха интерьера, которые могут быть удалены, но это трудно определить ее невооруженным глазом.
8. Кроме того, использование двух щипцы для удаления сетчатки слой, как показано на рисунке 2в. Легко выделить большое количество сетчатки, если вырезали около зрительного нерва. Все слои глаза можно теперь рассматривать как показано на рисунке 2-й.
9. После того, ткани сетчатки была удалена, она может быть использована для различных целей и, следовательно, последующие шаги и условия, используемые для сохранения могут отличаться соответственно. Например,ткани сетчатки могут быть помещены в пробирки, содержащие РНК стабилизации реагенты (например, RNAlater) или лизис буфера (для экстракции РНК или ДНК), dispase / трипсина (для выделения клеток), крепежные решения (до вставлять тканей в парафин или октябре для иммуногистохимии).
10. Очистить все рабочую зону и очистить территорию с использованием 70% изопропиловый спирт спрей.

3. Представитель Результаты

Corneo-склеры край, как показано на рисунке 1а правильно вырезали роговицы с необходимым количеством склеры обода и эндотелиальных морфологии, этот вид роговицы, как правило, используются для сквозной кератопластики. Если передняя стромы роговицы вырезали поврежден при наличии прозрачности, роговица может быть использован для эндотелиальной кератопластики / задние пластинчатые кератопластики (эндотелий с частью стромы). Принимая во внимание, если эндотелиальные слой поврежден или, если эндотелиальные клетки плотностью <2200 клеток / мм ² (онаАлеан стандарт), роговицы могут быть использованы для передних кератопластика пластинчатые (эпителий с частью передней стромы). Если количество клеток эндотелия меньше, чем требуется, роговицы могут быть использованы для передних пластинчатые кератопластика или исследования в то время как, если роговица повреждена полностью, она может быть использована для исследования, как показано на рисунке 1б, 3б и 3в или выбросить. Ущерб может быть причиной неправильной ткани, до операции катаракты приводит к стромальные или десцеметовой эндотелиальных шрамов, развитию физической травмы в течение жизни и т.д. пациента Таким образом, возникает необходимость проверить каждую ткань с щелевой лампой, а затем под оптическим микроскопом штрафа шрамы / складки / отрядов. Роговицы, как правило, сохраняется при двух различных условиях, таких как органной культуры (около 31 ° C) обычно используется в европейских странах или гипотермия условиях (около 4 ° С) обычно используется в США. Мы используем органной культуры, поскольку это помогает восстанавливать плотинувозраста эпителиальные клетки, чтобы вновь оживить эндотелиальные клетки проверки с высоким время после смерти, срок хранения 4 недели, что дает достаточный окно для планирования операции, дает достаточно времени для микробиологических (бактерий и грибков) и серологическое тестирование и т.д. роговицы могут быть также сохранены в транспортной среде в течение 7 дней.

Склеры могут быть сокращены по частям обеспечения нежного удаления всех хориоидеи бляшек. Стекловидной жидкости могут выделять при зрительного нерва, сосудистого или сетчатки резко сократить, как показано на рисунке 4. Сетчатки, если вырезали для анализа РНК должна быть сохранена в RNAlater как только ткань вырезали. Обычно 1X1 см от сосудистой оболочки и сетчатки слой вырезали и, продержав его в RNAlater в течение 24 часов при температуре 4 ° С сохраняется при -80 ° С в свежих труб Эппендорф (безопасный замок труб, 2 мл) до использования или отгружено с сухим льда. Ткани сетчатки должны быть изъяты при помощи двух пинцетов около зрительного нерва от диафрагмыили ресничного края, чтобы избежать загрязнения с другими пигментированных структур и должны быть переданы в сохранении контейнер сразу же, как РНК становится неустойчивым при получении сетчатки.

Рисунок 1 Сравнение между хорошим и плохим качеством роговицы.) Правильно вырезали роговицы. Такая роговица обычно сохраняется при органной культуры в течение 4 недель. Микробиологические (с помощью инструмента Bactec 9240) и морфологических (окрашивание клеток с трипановым синим для мобильных определение смертности и наблюдения клеток под оптическим микроскопом с увеличением 100х), осмотр проводится до его транспортировки в больницу (рис. 3а), б) изогнутые роговицы , которые в конечном итоге приводит к отторжения трансплантата из-за складок высокий Десцеметова и высокой повреждение эндотелия клетки исследовали с помощью микроскопа щелевой лампы. Такая роговица обычно используется для разрешенияearch или удаляется.

Рисунок 2. Метод, используемый для обеспечения точного иссечения ткани сетчатки.) Разбор склеры из глазного миру использованием 24mm лезвия 95 мм изогнутые или тупым концом стерильными ножницами и 100 мм 11x2 правит 0,70 мм зубов стерильными щипцами. Склеры должны быть сокращены, держа одну сторону с щипцы резки его прямо к зрительному нерву помощью ножниц. Сосудистого слоя, теперь легко увидеть, б) с помощью двух 100 мм 11x2 правит 0,70 мм зубы стерильный пинцет, сосудистая оболочка удаляется разрывая его на части, которая раскрывает основные прозрачный слой сетчатки, в) прозрачный слой сетчатки вырезали очень осторожно рядом зрительного нерва без выделения стекловидной жидкости с использованием тех же пинцетом. И щипцы должны держать обе стороны сетчатки и ткани должны быть удалены осторожно Startinг около зрительного нерва движется к роговице, чтобы получить хорошее количество ткани сетчатки. Ткань может быть разрезана на различные размеры и используются для анализа экспериментов, г) различные слои роговицы глаза после удаления можно посмотреть на этом рисунке. Сосудистое тело сначала удаляется затем сетчатки без повреждения других частей глаза.

Рисунок 3. Сравнение различных типов плотности клеток и морфология рассматривается под 100X увеличение оптического микроскопа.) Хорошо эндотелиальной клеточной плотности (> 2200 клеток / мм ²⁾ и морфологии (менее полиморфизм, низкая дегенерации, дистрофии и не 0% смертность) в роговице, которая подходит для трансплантации, б) Бедный эндотелиальной клеточной плотности (около 1200 - 1400 клеток / мм ²⁾ и морфологии (очень высокий полиморфизм и вырождениечество клеток), а примерно 30-40% общей смертности наблюдаются после окрашивания трипанового синий, в) часть эндотелиальных клеток повреждены из-за отряд эндотелиальных лист при получении от глазной роговицы миру. Это подтверждают наблюдения смертность клеток в регионе окрашенных по трипанового синий, г) складки Десцеметова образуются в результате неправильного обращения с роговицы изгиб, создавая поперечное напряжение роговицы, используя инструменты, активно и т.д. во время удаления. На рисунке показана толстая развитых ятрогенные складки находится между периферией и оптической зоны роговицы.

Рисунок 4. Повреждение сосудистой оболочки и сетчатки тканей в то время как вырезанием роговицы в конечном итоге приводит к выделению стекловидной жидкостью. Сетчатка получает вовлечены в стекловидное тело затрудняет акцизного хорошее качество ткани шthout загрязнения.

Таблица 1. Резюме спектр деятельности, осуществляемой с использованием человеческих глобусы глазные в течение 2009 и 2010 в Fondazione Banca дельи Occhi (Венеция, Италия). Примерно 60% тканей для трансплантации, в результате чего большое количество глазных шаров (около 40%) для научных и медицинских исследований.

Дополнительные рисунке 1. Анатомия человеческого глаза ^5. Различные части человеческого глаза указывается в эту цифру, используемых для контроля за точное положение ткани.

Discussion

И, правильное удаление и надлежащую сохранность роговицы и сетчатки тканей являются критическими как незначительные дефекты, такие как повреждение эндотелия или большим количеством складок Десцеметова может привести к недостаточности трансплантата роговицы в то время как температура изменения или неправильного обращения может поставить под угрозу целостность сетчатки тканей. Целью данной статьи является показать, как роговицы и сетчатки тканей может быть выделен оптимально, не вызывая повреждения или изменения, которые могут поставить под угрозу их использования для трансплантации или научных целях. Необходимая минимальная плотность клеток (> 2200 клеток / мм ^2), хорошая морфология, такие как размер ячейки, структура, низкая дегенерации межклеточные границы и отсутствие дистрофия наряду с хорошей прозрачности и надлежащей толщины роговицы являются отличительными чертами, которые делают ткань подходит для трансплантации. Если лезвие скальпеля используется примерно или других документов, которые используются интенсивно, он не только повредить роговицу, но и стекловидного тела, что делает Furtее удаления других тканей сложнее (рис. 4). Сетчатка представляет собой прозрачную ткань, и поэтому трудно определить, если стекловидной жидкости выходит с ним, это обычно делают иссечение ткани сетчатки сложнее. Если вырезали с стекловидного тела, качество ткани сетчатки или РНК, выделенной будет очень плохим из-за загрязнения с другими частями глаз. Таким образом, адекватный метод акцизного роговицы или сетчатки очень важно получить превосходное качество ткани.

Наши предыдущие данные за последние два года (таблица 1) показывают, что примерно 60% от роговицы, которые мы получаем от глаз шары подходят для различных видов трансплантации. Это еще одно доказательство того, что удаление роговицы техника описана в этой статье является хорошим методом для сбора высококачественной ткани роговицы с глазной глобусы. Роговицы может, конечно, не подходит для трансплантации в связи с другими параметрами суч как стромальные нарушений, загрязнений, плотность эндотелиальных / морфология, донор пригодности и механические / физические травмы, причиненный при сохранении роговицы. Однако, если эти параметры в порядке, техника, которую мы описали здесь позволяет поиска хороших тканей качества, которые будут использоваться для трансплантации у пациентов с поверхности глазных болезней.

Хотя информация о потрошения сетчатки тканей животных широко доступны ^11,12, насколько нам известно, это первый случай, когда такой метод описан для изоляции сетчатки тканей человеческого глаза глобусы. Действительно, исследования по литературе, не дали никакого результата на бумаге обсуждать эту тему. Мы считаем, что если человек вскрытие глазного мира осуществляется, как описано, ученые-исследователи могли бы иметь тканей высокого качества для использования в своих исследовательских проектов. Многие банки глаз по всему миру, скорее всего, получит глаза лампы (но и роговицы), которые не сuitable для трансплантации. В нашем случае, около 40% от роговицы (и глаза луковиц), которые мы собираем, и процесс не может быть применено (в связи с широким спектром причин), но все еще может быть использован для исследовательских целей. Техника, описанная в этой статье действительно позволяет коллекции тканей высокого качества. Это было недавно продемонстрировано в нашей группе при анализе РНК с Т <24 часов, извлеченные из тканей сетчатки, которые были собраны по методике, описанной в этой статье ^10. Мы считаем, что тот же метод может быть использован для изоляции сетчатки тканей и для многих других различных целей, например, (я) для исследования сетчатки транскриптом, (II) для изучения и продвижения использования человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в персонализированной медицины ⁸ (III ) разработать РНК выражение атлас ретинит пигментный генов в человеческой сетчатке ⁹ (IV), чтобы оптимизировать метод выделения РНК, (V) исследования стволовых клеток для регенерации сетчатки тканей, и т.д.

Эта технология Wплохо быть полезным для тех, кто хочет выполнять такие вырезания или экспериментов, но имеют ограниченную информацию о методе, чтобы использовать человеческие роговицы или сетчатки.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials for excision of cornea and retina.
Guarded disposable scalpel	Blade size 15	Swann-Morton
Sterile bandages	5 cm X 5 cm, 8 layered, 5 pcs	Artsana
Sterile disposable medical towel	35 X 50 cm	U.Jet
Sterile scissors	Blades 24 mm / overall length. 95 mm curved, blunt	e.janach
Sterile forceps	Stainless steel -100 mm 11 X 2 ruled by 0.70 mm teeth	e.janach
Corneal claw – Disposable medical device		NIIOS (Hippocratech)
PBS	100 ml PBS [10x] in 900 ml d/w (distilled water)	Sigma-Aldrich
Na-thiosulphate	1 gm Na-thiosulphate in 1 litre of PBS [1x]	Sigma-Aldrich
I-PVP	5 gm I-PVP in 1 litre d/w	Sigma-Aldrich
Table 2. The table describes the materials used for excision of cornea and retina and the company they are received from.
Materials for storage medium (2000 ml).
MEM (1X) liquid	Invitrogen	32360-034
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-039	1mM (10ml/l)
L-glutamine	Invitrogen	25030-032	2mM (10ml/l)
Antibiotic/antimycotic	Sigma-Aldrich	A5955-20ML	10ml/l
Newborn calf serum	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml/l)
Table 3. Materials for storage medium.
Preparation of storage medium
Add all the ingredients using the specific concentrations as given above in a jar and mix well. Filter them using pore size of 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) with help of a peristaltic pump. Preserve the medium in the bottles at RT.
Materials for transport medium (2000 ml).
MEM (1X) liquid	Invitrogen	32360-034
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360-039	1mM (10 ml/l)
L-glutamine	Invitrogen	25030-032	2mM (10 ml/l)
Newborn calf serum	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml/l)
Dextran t500	Pharmacosmos	551005004007	6% (60 gm/litre)
Table 4. Material for transport medium.
Preparation of transport medium
Add Dextran 6% in ~ 1.5 litre of MEM and leave it overnight. Add the rest of ingredients in the media and filter using 0.2 micron filter (Millipore, Milan, Italy) using a vacuum pump. Preserve the medium in the bottles at RT.