Modèle murin de l'asthme induit par les allergènes

Summary

Des modèles de souris expérimentales de l'asthme allergique offrent de nouvelles possibilités pour l'étude de la pathogenèse des maladies et le développement de nouvelles thérapies. Ces modèles sont bien adaptés à des facteurs de mesure relatives à la réponse immunitaire allergique, inflammation des voies respiratoires, et de la physiopathologie pulmonaire.

Abstract

L'asthme est une cause majeure de morbidité et de mortalité, affectant quelque 300 millions de personnes à travers le monde. ¹ Plus de 8% de la population américaine souffre d'asthme, de la prévalence croissante. ² Comme avec d'autres maladies, les modèles animaux de la maladie allergique des voies respiratoires facilitent grandement compréhension de la pathophysiologie sous-jacente, aider à identifier des cibles thérapeutiques potentielles, et de permettre des essais précliniques de possibles nouvelles thérapies. Modèles de la maladie allergique des voies respiratoires ont été développés dans plusieurs espèces animales, mais les modèles murins sont particulièrement attractive en raison du faible coût, disponibilité, et bien caractérisés système immunitaire de ces animaux. ³ Disponibilité d'une variété de souches transgéniques augmente encore l'attrait de ces modèles. ⁴ Ici, nous décrivons deux modèles murins de la maladie allergique des voies respiratoires, à la fois l'ovalbumine employant comme antigène. Après une sensibilisation initiale par injection intrapéritonéale, un modèle LivrERS le défi de l'antigène par nébulisation, l'autre par la livraison intra-trachéale. Ces deux modèles offrent des avantages complémentaires, les uns avec les imitant les principales caractéristiques de l'asthme humain. ⁵

Les principales caractéristiques de l'asthme aigu comprennent une réponse exagérée des voies aériennes à des stimuli tels que la méthacholine (hyperréactivité bronchique; AHR) et inflammation des voies respiratoires éosinophiles riches. Ce sont également des effets importants de provocation allergénique dans nos modèles murins, ^5,6 et nous décrire les techniques permettant de mesurer les et donc d'évaluer les effets de la manipulation expérimentale. Plus précisément, nous décrivons les deux ⁸ invasives ⁷ et non-invasif des techniques de mesure de l'hyperréactivité bronchique ainsi que des méthodes pour évaluer l'infiltration de cellules inflammatoires dans les voies respiratoires et du poumon. Cellules inflammatoires des voies aériennes sont recueillies par lavage broncho-alvéolaire du poumon tandis que l'histopathologie est utilisée pour évaluer les marqueurs de l'inflammation dans l'organe. Cestechniques fournissent des outils puissants pour étudier l'asthme d'une façon qui ne serait pas possible chez les humains.

Protocol

La sensibilisation aux allergènes et I. Défi (voir Figure 1)

A. Pour Défi intratrachéale

1. Pour la sensibilisation initiale, injecter mâle ou femelle C57BL / 6 ou BALB / c (6-8 semaines) par voie intrapéritonéale au jour 0 et à nouveau au jour 7 avec 20 pg d'ovalbumine (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) émulsionné dans 0,2 ml de phosphate stérile (PBS) contenant 2 mg d'hydroxyde d'aluminium (Sigma-Aldrich) ou avec 2 mg d'hydroxyde d'aluminium dans 0,2 ml de PBS stérile comme témoin.
2. Défi avec un antigène, le cas échéant (par exemple, aux jours 14, 16, 18 et 20). Procédure de récusation suit.
3. Anesthésier souris avec une voie intrapéritonéale (ip) d'injection d'un mélange de kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Assurez-vous de la souris est entièrement anesthésié pendant au moins 10 min.
4. Surface de fonctionnement Angle à 45 degrés ou plus. Placez la souris sur cette surface garder la face ventrale vers le haut et la tête en haut.
5. Crochet tHLit sous incisives de tenir la tête en arrière. Niveau les pattes avec l'autre pour assurer la trachée est droite et à utiliser la bande d'étiquettes à maintenir les pieds. Faire tremper site chirurgical avec 70% et EtOH écouvillon.
6. Appliquer bupivacaïne (0,1 à 0,2 ml de solution à 0,25%) par voie topique à l'endroit de l'incision.
7. Nip peau sur la gorge avec une pince et tirez doucement vers l'extérieur. Faire une petite incision verticale avec des ciseaux chirurgicaux. Réduire la taille de l'incision.
8. Préparer une seringue de 1 ml avec 50 ul de PBS ou OVA 0,1% dans du PBS et l'insérer dans une pipette répétitive (Tridak Stepper, Torrington, CT). Prendre la pipette dans une main et utiliser l'autre pour tenir le tissu de retour avec la pince à épiler et d'exposer la trachée.
9. En tenant la seringue comme parallèle à la trachée que possible, d'insérer l'aiguille à travers la trachée mur et injecter la solution.
10. Maintenir la souris dans une suite à l'injection orientation verticale pour laisser le temps pour une solution à s'installer dans les poumons.
11. Surface de la plaie doucement et stérilement étroite avecpince à épiler et joint avec suture.
12. Placez la souris sur le sternum vers le bas sur un coussin chauffant et lui permettre de récupérer jusqu'à totalement ambulatoire. Après la récupération, le retour de la souris à l'établissement de soins des animaux et de la surveiller quotidiennement les signes de sérome, inflammation ou une infection, et déhiscence de la plaie jusqu'à ce que la plaie est complètement guérie.

B. Pour Défi par nébulisation

1. Sensibiliser les souris au jour 0 par injection intrapéritonéale de 20 mg d'OVA (Sigma-Aldrich) émulsionné dans 0,2 ml de PBS stérile contenant 2 mg d'hydroxyde d'aluminium (Sigma-Aldrich) ou avec 2 mg d'hydroxyde d'aluminium dans 0,2 ml de PBS stérile que le contrôle .
2. Au jour 14, de stimuler une sensibilisation par injection ip tel que décrit ci-dessus.
3. Sur le 21 ^e jour, 22 ^ème, 23 ^ème, 24 ^ème et 25 ^ème après la sensibilisation initiale, les souris défi par une exposition de 30 min à l'OVA 1% nébulisée ou PBS seul livré via un nébuliseur ultrasonique (Buxco Systems Research, Wilmington, Caroline du Nord).
4. Souris lieu dans la salle principale de la WBP; les acclimater dans la chambre de pléthysmographie pendant au moins 10 min.
5. Placer 1 ml de OVA 0,1% dans du PBS stérile ou stérile PBS seul, tel que décrit dans les étapes 4-6 ci-dessous, via un nébuliseur. Nébuliser pendant 30 min.
6. Retirer du nébuliseur et jeter toute solution restante.
7. Nébulisation peut être effectuée sur tous les souris simultanément en utilisant une chambre de nébulisation.

II. Détermination de l'hyperréactivité bronchique à la méthacholine

A. Mesure non invasive de l'hyperréactivité des voies aériennes par pléthysmographie corps entier-(WBP; Buxco recherche sur les systèmes, Wilmington, NC)

1. Laisser la bouteille méthacholine poudre se réchauffer à température ambiante avant ouverture (méthacholine est très hygroscopique et former des amas inutiles si on les laisse à absorber l'eau). Préparer une dose de 200 mg / ml de solution mère dans du PBS stérile, puis assurez-série 2-dilutions (par exemple, 100, 50, 25, 12,5 et 60,25 mg / ml). Conserver les solutions froid.
2. Mettre en place l'équipement comme suit: raccorder l 'entrée principale de la WBP d'un nébuliseur, le biais des flux d'entrée à l'air de la pompe, et la sortie WBP à piéger le gaz en utilisant un tube de caoutchouc étanche. Attacher transducteur de pression pour réduire les sorties des chambres principales et renvoi de la WBP. Connectez transducteur de pression pour préamplificateur avec les câbles fournis, et se connecter au PC en utilisant préamplificateur spécifique d'acquisition de données de la carte.
3. Calibrer le préamplificateur en utilisant le logiciel selon les recommandations du fabricant.
4. Souris lieu dans la salle principale de la WBP; les acclimater dans la chambre de pléthysmographie pendant au moins 10 min, puis des lectures de base de disques (Penhbase) pendant 3 min.
5. Placer 1 ml de PBS stérile dans le nébuliseur. Nébuliser pendant 2 min, puis surveiller les variables respiratoires pour un supplément de 6 min au cours de la phase de séchage. Retirer du nébuliseur et jeter tout reste PBS.
6. Placer 1 ml de 6,25 mg / ml méthacholine dans le nébuliseur et rnébulisation EPEAT pendant 2 min, plus un cycle de suivi de 6 minutes.
7. Répétez la mesure avec 12,5, 25, 50 et 100 mg / ml méthacholine, en utilisant la période de nébulisation même 2-min et cycle de suivi de 6 minutes.
8. Retirer les souris à partir des chambres et de les renvoyer dans leurs cages.
9. Recharge nébuliseur tasse avec 1 ml de PBS stérile et exécuter une autre séquence pour rincer la tubulure.
10. Arrêtez les flux d'air, démonter, et essuyer toutes les chambres avant de lancer une deuxième série d'animaux.

B. Mesure invasive de la réactivité des voies respiratoires par commandée par ordinateur Ventilateur (flexiVent; SCIREQ Inc, Montréal, Canada)

1. Peser la souris et anesthésier par voie intrapéritonéale (ip) d'injection de 60 mg de sodium par kg de poids corporel pentobarbital.
2. Après anesthésie, position adéquate les souris ventro-dorsale pour trachéotomie.
3. Désinfectez la peau du cou avec de l'éthanol 70%. Appliquer bupivacaïne (0,1 à 0,2 ml de solution à 0,25%) par voie topique à l'ile site ncision. Incisez et ouvrir la peau du cou. Séparez les muscles du cou et d'exposer la trachée.
4. Faire un 1 - à 2 mm de l'incision dans la trachée avec des ciseaux fins (être certain de ne pas couper la trachée) et insérez la sonde trachéale avec prudence. Attachez un fil de suture autour de la trachée pour empêcher une fuite d'air.
5. Poser la souris dans la chambre de pléthysmographe et connecter le tube inséré la trachée et la ventilation.
6. Démarrer une ventilation mécanique. Réglez la fréquence respiratoire approprié et le volume courant / course (150 coups / min et 200 pi, respectivement pour une souris de 20 g). Assurez-vous que le thorax se déplace en synchronie avec le ventilateur. Si la souris est la «lutte» avec le ventilateur (auto-respiration), injecter plus d'anesthésie et d'attendre la synchronisation.
7. Après les mesures de base, de maintenir la souris sous ventilation de base pour un autre 3 min, puis prendre un 2 ^e série de mesures d'impédance. Cette 2 ^ème série de mesures de base est utilisé pour calcmuler les valeurs de référence moyennes.
8. Livrer CPE ou à la méthacholine (MCH) (défis 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 mg / ml) par la canalisation de débit inspiratoire du ventilateur grâce à un nébuliseur ultrasonique.
9. Après chaque défi avec MCh (6,25, 12,5, 25, 50 et 100 mg / ml), le retour du piston à fournir un Vt de 10 ml / kg à 120 respirations par minute et de prendre des mesures d'impédance.

III. Mesure de l'infiltration cellulaire dans l'espace aérien

A. Effectuer lavage broncho-alvéolaire (LBA)

1. Après la mesure de la procréation assistée, l'euthanasie des souris avec du CO _2, et de positionner chaque souris sur le dos sur le pavé chirurgicale.
2. Faire tremper la zone avec de l'EtOH 70%.
3. Commençant à l'abdomen inférieur, ouvrir la cavité abdominale et enlever la peau / supérieure du muscle, se déplaçant vers le haut vers les côtes.
4. Une fois les côtes sont visibles, utiliser des ciseaux pour bien percer la membrane. Poumons devrait se rétracter, le diaphragme. Soyez particulièrement careful à ne pas entailler les poumons ou le cœur.
5. Coupez la cage thoracique pour bien exposer les poumons et le cœur (éviter de couper les principaux vaisseaux sanguins pour empêcher le sang de remplir le site).
6. En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de calibre 27 (BD seringues, Franklin Lakes, NJ), la ponction des ventricules cardiaques et lentement et soigneusement retirer la seringue pour prélever le sang. Prenez soin d'éviter l'effondrement du cœur.
7. Recueillir le sérum de ce sang en utilisant le protocole standard. Conserver à -70 ° C jusqu'à son utilisation.
8. Coupez la peau et les tissus de la gorge jusqu'à ce que la trachée est révélé. Dégagez suffisamment de tissu pour travailler facilement dans le domaine (encore une fois, éviter de couper les principaux vaisseaux sanguins).
9. L'aide de ciseaux courbes, coupées en vertu de la trachée se frayer un chemin.
10. Passez le point d'une pince courbes sous la trachée et de saisir la fin d'un morceau de fil de suture. Tirer le fil de suture dans la trachée.
11. Faire un demi-nœud lâche à propos de la trachée, faible dans la gorge.
12. CAREFully une entaille, de taille suffisante pour la canule, au-dessus du fil de suture.
13. Soin insérer la canule dans le trou et dans la trachée-delà du point du fil de suture. Appuyez doucement sur l'avant jusqu'à ce que la canule émerge juste à l'entrée dans les poumons (trop loin: poumons de crevaison; trop court: la trachée effondrement lors de la tentative de récupérer BAL).
14. Serrer fil de suture et faire un nœud complet pour sceller la trachée autour canule.
15. Seringue Lock (contenant 1 ml de PBS) sur la canule, et appuyez doucement sur le fluide dans les poumons. Lobes du poumon devrait individuellement gonfler lentement. Ne pas trop remplir. Pour une souris pleine de 0,9 à 1,0 ml cultivé est le maximum absolu. 0,8 ml peut être plus sûr. Verrouiller la seringue à canule lâche, sinon il est susceptible de causer des dommages lors d'une tentative de se désengager.
16. Retirer du fluide à partir de poumons. Si on rencontre une résistance (tissu aspiré dans la canule), appuyez sur la canule lentement plus loin dans les poumons et reprendre les enlever. Aussi essayez de tourner la canule en place. Si tous les else échoue, retirer la canule à mi-chemin; la trachée est beaucoup plus susceptible de s'effondrer dans ce cas.
17. Détacher la seringue de la canule, le dépôt liquide de LBA dans le récipient, et répéter 2 fois avec une solution de PBS frais.
18. Conserver la solution sur de la glace jusqu'à ce que BAL filé vers le bas.
19. Utilisez le liquide de LBA et le sérum pour mesurer l'OVA IgE spécifique à l'aide disponible dans le commerce IgE de souris kits ELISA (bioproduits MD, St. Paul, MN).

B. Compter les cellules et détermination des taux différentiels

1. Centrifuger le liquide BAL 5 min à ~ 600 × g, 4 ° C.
2. Remettre en suspension le culot cellulaire doucement dans du PBS et de garder sur la glace.
3. Chargez un hématimètre norme Neubauer avec la suspension cellulaire diluée et de compter les cellules.
4. Retirer aliquotes de 2 × 10 ⁴ cellules 10 à 40 du volume ul pour cytospins. Diluer les cellules si nécessaire.
5. Pour cytospins, mélanger 2 × 10 ⁴ cellules, 130 pi de PBS et 10 ul FBS. Ajouter le mélange de cellule entière à double cytospin entonnoir et centrifuger 10 min à 700 rpm, en utilisant cytoslides doubles pour les échantillons en double.
6. Laisser les lames sécher à température ambiante pendant 1 h avant la coloration.
7. Colorer les lames en utilisant Diff-Quick tache (Siemens, Newark, DE).

IV. Les résultats représentatifs

Constriction des voies respiratoires à la suite des stimuli provocateurs excessive est une caractéristique importante de la clinique de l'asthme. Nous décrivons deux méthodes de mesure de l'hyperréactivité bronchique à la méthacholine telle chez les souris sensibilisées et OVA contestée: l'ensemble du corps pléthysmographie (Figure 2) et l'oscillation forcée à l'aide du système flexiVent (Figure 3). Les deux méthodes montrent que la sensibilisation et le défi OVA produit une hyperréactivité bronchique chez la souris.

Inflammation des voies respiratoires éosinophiles riche en est une autre caractéristique importante de l'asthme et la maladie clinique allergique des voies respiratoires chez les souris. Comme le montre la figure 4

Les données indiquent que les résultats allergiques maladies des voies respiratoires de la surproduction d'anticorps IgE aux antigènes sensibilisants. Sensibilisation et un défi à l'OVA en utilisant les protocoles que nous décrivons augmente les taux d'IgE dans le sérum et le fluide BAL des souris traitées (figure 5).

Figure 1. Schéma d'expérimentation pour l'OVA induit l'asthme allergique. Souris ont été sensibilisées à deux reprises ip avec 20 pg d'OVA émulsionnée dans 2 mg d'hydroxyde d'aluminium dans 0,2 ml de PBS stérile, ou 2 mg d'hydroxyde d'aluminium dans 0,2 ml de PBS stérile seul, suivi à la points de temps indiqué par le contester avec 0,1% OVA ou une solution stérile de PBS ou par ex quotidienne posure pendant 30 minutes à l'OVA 1% nébulisée dans du PBS ou du PBS seul livré via un nébuliseur ultrasonique (Buxco). Vingt-quatre heures après l'exposition OVA final, la réactivité bronchique a été déterminée. Par la suite, le liquide de LBA, des échantillons de sang, les cellules pulmonaires, et les tissus ont été prélevés pour une analyse plus approfondie.

Figure 2. Souris d'évaluation des induite par l'allergène hyperréactivité bronchique par une méthode non invasive. (N = 4/groupe) ont été sensibilisés et mis au défi avec de l'OVA. Vingt-quatre heures qui suivent le dernier défi, l'hyperréactivité bronchique à la métacholine inhalée a été déterminée en utilisant la pléthysmographie corps entier tel que décrit dans le protocole. Penh a été déterminée et exprimée en rapport Penh (moyenne Penh sur l'intervalle de temps de 8 minutes avec de la méthacholine, divisé par le Penh moyenne sur l'intervalle de 8 minutes avec du PBS). * P <0,05 vs PBS.

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Figure 3. Souris d'évaluation des induite par l'allergène hyperréactivité bronchique par une méthode invasive (oscillations forcées). (N = 4/groupe) ont été sensibilisés et mis au défi avec de l'OVA. Vingt-quatre heures qui suivent le dernier défi, l'hyperréactivité bronchique à des concentrations croissantes de métacholine inhalée a été déterminée par l'oscillation forcée (flexiVent) méthode telle que décrite dans le protocole. Une résistance, B) des voies respiratoires; élastance pulmonaire C). * P <0,05 vs PBS.

Figure 4. BAL nombre de cellules de fluide. Souris (n = 4/groupe) ont été sensibilisés et mis au défi avec de l'OVA. Vingt-quatre heures qui suivent le dernier défi, (Haut) Cellules BAL ont été recueillis et nombre total de cellules ont été comptées comme décrit dans le protocole. (Bas) diapositives Cytospin étaient préparé et colorées avec Diff-Quick. TOT = nombre total de cellules; Eos = Une éosinophiles; Neu = Une neutrophiles; Mac = macrophages; Lym = Lymphocytes. * P <0,05 vs PBS.

Figure 5. OVA-IgE spécifiques. Souris (n = 4/groupe) ont été sensibilisés et mis au défi avec de l'OVA. Vingt-quatre heures qui suivent le dernier défi, IgE a été mesurée dans le liquide BAL et dans le sérum du sang recueilli par ponction cardiaque tel que décrit dans le protocole. * P <0,05 vs PBS.

Discussion

Les modèles animaux de la maladie allergique des voies respiratoires fournissent des outils importants pour les études pertinentes à l'asthme clinique. Un certain nombre de modèles différents, qui emploient diverses espèces et les antigènes, ont été développés. La souris, une espèce de laboratoire attrayants et fréquemment utilisée, offre également un certain nombre d'avantages pour les modèles de la maladie allergique des voies respiratoires. ^9,10 Bien que ces modèles ne reproduisent pas l'asthme, à tous égards, ¹¹ avec les aspects de la maladie chronique étant particulièrement difficile à reproduire, ^12,13 nous confirmons ici que bon nombre des principales caractéristiques sont reproduites. Nous montrons aussi que, comme dans l'asthme de l'homme, ces caractéristiques sont associées à des augmentations spécifiques de l'antigène IgE dans le liquide à la fois le sérum et le BAL. Nous présentons deux modèles murins, à la fois OVA employant comme l'antigène, mais en utilisant des techniques différentes défi. L'administration intratrachéale est quelque peu complexe et chronophage, mais offre l'avantage de fournir une quantité connue d'antigène directement à ladu poumon. Il est également possible que cette méthode offre l'antigène plus profondément dans les poumons que les autres do. Nous décrivons une méthode invasive pour la livraison intra-trachéale, mais antigène peut également être livré par voie intratrachéale par l'intermédiaire d'un tube ou la canule insérée par l'intermédiaire de la cavité buccale. Cette méthode est décrite ailleurs dans JoVE ^14. Nébulisation est plus simple et plus directement imite le parcours habituel de l'exposition humaine. La quantification est plus variable, cependant, et la livraison dans les poumons peut être moins efficace. ^{15 En} effet, il est probable qu'une fraction non négligeable, mais inconnu de la dose est déposée dans les voies aériennes supérieures. Une troisième alternative, non décrite ici, est la livraison par voie intranasale. Encore une fois, il est probable qu'une fraction importante de la dose sera déposé dans les voies aériennes supérieures.

Bien que notre démonstration est réalisée en utilisant C57BL / 6, la preuve suggère que certaines souches d'autres peuvent donner des résultats plus robustes sur des paramètres spécifiques. Dans les comparaisons de C57BL / 6 avec BALB / c ¹⁶ ou à la fois BALB / c et FVB / NJ ¹⁷ souris, les souris C57BL / 6 a montré la plus faible augmentation sur la procréation assistée. D'autre part, les souris C57BL / 6 ont montré des augmentations plus importantes dans éosinophilie dans une étude ^16, mais pas dans l'autre. ¹⁷ élévations des cytokines étaient à la fois la souche et de cytokines spécifiques. La souche préférée peut donc dépendre du point de terminaison jugés les plus importants.

Deux principales caractéristiques de la maladie allergique des voies respiratoires sont couramment choisie pour l'évaluation afin de déterminer les effets de manipulations expérimentales: la procréation assistée et l'étendue de l'inflammation des voies respiratoires. La procréation assistée peut être mesurée soit par l'ensemble du corps pléthysmographie (WBP) ou par oscillations forcées. Dans les deux cas, la méthacholine est utilisé comme le défi provocateur. WBP est une fonctionnelle dans la mesure in vivo qui permet l'analyse de la réactivité des voies respiratoires sur conscient, se déplaçant librement ou souris mini sobres sans chirurgie invasive et de l'anesthésie. Réactivité des voies aériennes est exprimé en utilisant la"Pause renforcée» (Penh) en tant que paramètre de la fonction respiratoire altérée. Penh est un paramètre empirique qui reflète les changements dans la forme d'onde d'écoulement boîte à la fois inspiration et l'expiration et il se combine avec la comparaison des flux de boîte de début et de fin d'expiration. WBP présente plusieurs avantages potentiels par rapport aux moyens invasifs pour mesure de la résistance du poumon, car il est techniquement moins exigeant et permet des mesures de la réactivité bronchique à des stimulants sous forme d'aérosol. Cette méthode minimise à la fois les effets du stress psychologique et le temps de préparation des animaux, qui le rend idéal pour des mesures répétées (examen de l'animal même à des moments différents) et de mesure sur de longues périodes de temps (> 24 h), au cours desquelles une variété d'aérosols peut être administré de manière contrôlée et reproductible. Les résultats sont fortement corrélés avec ceux des méthodes invasives, mais il est plus rapide et plus facile.

Deux autres méthodes non invasives de fournir des mesures que l'on ditd'être plus directement lié à la constriction des voies respiratoires. Dans double chambre pléthysmographie la souris est forcé à coller la tête à travers un trou dans la face de la chambre de thoraco. ¹⁸ possédant une chambre nasale est ensuite placé à l'avant de la chambre et une tête thoraco-trou est découpé dans le film d'étanchéité en latex entre les chambres. Ce trou est précisément conçu pour fournir un joint étanche à l'air entre les chambres sans restreindre circulation d'air respiratoire. Mesures pléthysmographiques sont alors pris dans les deux chambres et le délai entre les flux nasal et thoraco-abdominale sont utilisés pour calculer la résistance spécifique des voies aériennes (sRAW). Tête de sortie pléthysmographie est similaire, sauf que l'air circule librement dans la chambre nasale et aucune mesure pléthysmographiques sont là. ¹⁹ Le paramètre primaire est calculée vitesse d'écoulement à la phase midexpiratory (EF _50). Les deux techniques, comme WBP, sont appropriés pour des mesures répétées sur un certain nombre d'heures, permettant d'évaluer bOth réponses précoces et tardives. Toutefois, à la fois exiger que les animaux puissent être retenue, ce qui peut produire des résultats erratiques, sauf si les animaux sont habitués à l'appareil au cours de plusieurs jours. Il peut aussi être difficile à assurer une application effective de l'air joint étanche, ce qui est essentiel dans les deux cas. En outre, puisque les deux Penh et sRAW Il a été démontré une forte corrélation avec les mesures invasives, et Penh et sRAW Il a été démontré une corrélation directe chez le cobaye, ²⁰ on peut se demander si l'information supplémentaire obtenue justifie la difficulté accrue expérimentale.

Dans le procédé oscillation forcée, souris profondément anesthésiés sont trachéotomisé et un ventilateur mécanique est relié au tube. Pression d'écoulement des mesures que le ventilateur gonfle et se dégonfle les poumons, puis permettre la mesure directe de la résistance pulmonaire et la compliance dynamique. Il fournit des informations sur la mécanique des voies respiratoires qui ne sont pas disponibles avec WBP. Pourced oscillation est techniquement plus difficile, cependant, et est généralement une procédure terminale. Comme les points de terminaison expérimentales, les deux procédures donnent généralement des résultats similaires ^19.

L'autre caractéristique importante de la clinique de l'asthme couramment utilisé pour évaluer l'effet de manipulations expérimentales dans la maladie des voies respiratoires murin allergique est une inflammation à éosinophiles. Bien d'autres aspects de l'inflammation peut être mesurée ainsi, le plus souvent cette implique la détermination de l'étendue de cellules inflammatoires (en particulier des éosinophiles) l'infiltration dans les voies respiratoires, les poumons, ou les deux. Le nombre et le type de cellules dans les voies respiratoires est déterminée dans le BAL fluide: Première nombre total de cellules est déterminée par comptage dans un hématimètre, puis type de cellule est déterminée par cytospin coloration différentielle suivante. Bien que la collecte de fluide BAL peut en principe être réalisée chez des souris vivantes, comme il est chez l'homme, il est plus habituellement et commodément effectuée à la suite l'euthanasie. Éosinophilesinfiltration dans les poumons est évaluée par l'excision du poumon suivie par des techniques classiques histopathologiques.

Dans certains cas, il peut également être utile pour évaluer la mesure dans laquelle l'antigène et de sensibilisation défi stimule gobelet (mucus production) la prolifération cellulaire. Ceci est facilement accompli par coloration, les coupes du poumon avec l'acide périodique-Schiff, qui est spécifique pour le mucus. Antigène spécifique IgE peut également être mesurée dans le liquide BAL et le sérum en utilisant des kits facilement disponibles. IgE de mesure peut être importante dans les milieux où le degré de sensibilisation, à la différence de la réponse des organes cibles, est un paramètre crucial. Il ya une grande variété de mesures, y compris d'autres cytokines et réponses des cellules T, qui sont un précieux complément à l'étude de la maladie allergique des voies respiratoires chez des modèles animaux que nous n'avons pas décrit ici. Il est la grande variété des réponses pertinentes que la sensibilisation et l'antigène défi peut susciter que de rendre ces modèles précieux dans le goujony de cette maladie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovalbumin	Sigma-Aldrich	A5503
Aluminum hydroxide	Sigma-Aldrich	239186
Acetyl-β-methylcholine chloride	Sigma-Aldrich	A2251
Pentobarbital sodium salt	Sigma-Aldrich	P3761
Whole body plethysmography (WBP) system	Buxco Research Systems		http://www.buxco.com
FlexiVent	SCIREQ, Inc.		http://www.scireq.com
Light microscope	Leica Microsystems
Cytospin 4	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Diff-Quick stain	Siemens AG	B4132-1A
Repetitive pipette	Tridak	STP4001-0025