Summary
एलर्जी अस्थमा के प्रयोगात्मक माउस मॉडल रोग रोगजनन का अध्ययन करने और नई चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए नई संभावनाओं की पेशकश करते हैं. इन मॉडलों को अच्छी तरह से मापने एलर्जी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, airway सूजन, और फेफड़े के pathophysiology शासी कारक के लिए अनुकूल हैं.
Abstract
अस्थमा रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है, दुनिया भर में कुछ 300 मिलियन लोगों को प्रभावित 8 अमेरिका की आबादी का 1% से अधिक अस्थमा है, अन्य बीमारियों, एलर्जी airway रोग के पशु मॉडल की सुविधा बहुत साथ के रूप में प्रसार में वृद्धि के साथ 2. अंतर्निहित pathophysiology की समझ में मदद करने के लिए, संभावित चिकित्सात्मक लक्ष्यों की पहचान, और संभव नए उपचारों के preclinical परीक्षण की अनुमति है. कई पशु प्रजातियों में एलर्जी airway रोग का मॉडल विकसित किया गया है, लेकिन murine मॉडल विशेष रूप से आकर्षक कम लागत, तैयार की उपलब्धता है, और इन जानवरों की अच्छी तरह से विशेषता प्रतिरक्षा प्रणाली के कारण हैं. ट्रांसजेनिक उपभेदों के एक किस्म के 3 उपलब्धि आगे आकर्षण बढ़ जाती है इन मॉडलों के 4 यहाँ हम एलर्जी airway रोग के दो murine मॉडल का वर्णन, दोनों प्रतिजन के रूप में रोजगार ovalbumin. Intraperitoneal इंजेक्शन, एक मॉडल deliv द्वारा प्रारंभिक संवेदीकरण के बादnebulization, intratracheal वितरण द्वारा अन्य द्वारा प्रतिजन चुनौती ERS. इन दो मॉडल पूरक लाभ प्रदान करते हैं, प्रत्येक मानव अस्थमा के प्रमुख विशेषताओं में नकल उतार के साथ 5.
और eosinophil अमीर airway सूजन, तीव्र अस्थमा के प्रमुख विशेषताएं एक अतिरंजित airway के (Ahr airway के hyperresponsiveness) methacholine जैसे उत्तेजनाओं के जवाब शामिल हैं. ये भी हमारे murine मॉडल, 5,6 में allergen चुनौती का प्रमुख प्रभाव और हम उन्हें मापने के लिए तकनीक का वर्णन है और इस प्रकार प्रयोगात्मक हेरफेर के प्रभाव का मूल्यांकन. विशेष रूप से, हम दोनों की airway hyperresponsiveness को मापने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वायुमार्ग और फेफड़ों में सूजन कोशिकाओं की घुसपैठ का आकलन करने के लिए तरीकों के लिए 7 आक्रामक और गैर इनवेसिव 8 तकनीक का वर्णन. Airway सूजन कोशिकाओं ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना द्वारा एकत्र कर रहे हैं जबकि फेफड़ों के ऊतकविकृतिविज्ञानी अंग भर में सूजन के मार्कर का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इनतकनीक तरीके कि मानव में संभव नहीं होगा में अस्थमा के अध्ययन के लिए शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं.
Protocol
मैं Allergen संवेदनशील और चैलेंज (चित्रा 1 देखें)
ए Intratracheal चैलेंज के लिए
- प्रारंभिक संवेदीकरण के लिए, 0 दिन और फिर 7 दिन पर ovalbumin के 20 μg (, सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO OVA) के साथ पुरुष या महिला C57BL / 6 या / BALB सी (6-8 सप्ताह पुराने) चूहों intraperitoneally इंजेक्षन बाँझ फॉस्फेट की 0.2 मिलीलीटर में emulsified (पीबीएस) खारा एल्यूमीनियम हीड्राकसीड के 2 मिलीग्राम (सिग्मा Aldrich) युक्त बफर या बाँझ नियंत्रण के रूप में पीबीएस की 0.2 मिलीलीटर में 2 मिलीग्राम एल्यूमीनियम हीड्राकसीड के साथ.
- प्रतिजन के साथ चुनौती के रूप में उपयुक्त (उदाहरण के लिए, 14 दिन, 16, 18, और 20 पर). चैलेंज प्रक्रिया इस प्रकार है.
- Ketamine का एक मिश्रण के एक intraperitoneal (आईपी) इंजेक्शन (90 मिग्रा / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ माउस चतनाशून्य करना. सुनिश्चित करें माउस पूरी तरह से कम से कम 10 मिनट के लिए anesthetized है.
- 45 डिग्री या अधिक से अधिक कोण आपरेशन सतह. इस उदर पक्ष के ऊपर रखने के सतह और शीर्ष पर सिर पर जगह माउस.
- हुक टीसामने incisors के तहत hread सिर पकड़ वापस. स्तर एक दूसरे के साथ पंजे करने के लिए सुनिश्चित करें ट्रेकिआ सीधे और लेबल टेप का उपयोग करने के लिए पैर पकड़. 70% EtOH और झाड़ू के साथ शल्य साइट भिगोएँ.
- Bupivicaine (0.25% समाधान के 0,1 0,2 मिलीग्राम) चीरा साइट पर topically लागू करें.
- संदंश के साथ गले पर चुटकी त्वचा और धीरे जावक खींच. शल्य कैंची के साथ एक छोटी सी खड़ी चीरा. चीरा के आकार को कम करने.
- पीबीएस की 50 μl या पीबीएस में 0.1% ओवीए के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज तैयार है और यह एक दोहराव विंदुक (Tridak Stepper, Torrington, सीटी) में डालें. एक हाथ में पिपेट ले लो और अन्य का उपयोग करने के लिए चिमटी के साथ ऊतक वापस पकड़ और ट्रेकिआ बेनकाब.
- होल्डिंग के रूप में संभव के रूप में ट्रेकिआ के समानांतर सिरिंज, ट्रेकिआ दीवार के माध्यम से सुई डालने और समाधान इंजेक्षन.
- एक ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास निम्नलिखित इंजेक्शन में माउस को बनाए रखने के लिए फेफड़ों में व्यवस्थित करने के लिए समाधान के लिए समय की अनुमति है.
- धीरे और sterilely करीब घाव क्षेत्र के साथचिमटी और सीवन के साथ सील.
- जगह एक हीटिंग पैड पर माउस उरोस्थि के नीचे और यह पूरी तरह से चल जब तक ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. वसूली के बाद, जानवरों की देखभाल की सुविधा के लिए माउस लौटने और यह seroma, सूजन या संक्रमण, और घाव स्फुटन के संकेत के लिए दैनिक की निगरानी तक घाव पूरी तरह चंगा है.
Nebulization द्वारा चैलेंज के लिए बी.
- ओवीए के 20 μg की intraperitoneal इंजेक्शन (सिग्मा Aldrich) बाँझ पीबीएस के 0.2 मिलीलीटर में बाँझ पीबीएस के 0.2 मिलीग्राम एल्यूमीनियम हीड्राकसीड के 2 मिलीग्राम (सिग्मा Aldrich) युक्त में या नियंत्रण के रूप में 2 मिलीग्राम एल्यूमीनियम हीड्राकसीड के साथ emulsified द्वारा 0 दिन चूहों को संवेदनशील बनाना .
- 14 दिन, आईपी इंजेक्शन द्वारा संवेदीकरण को बढ़ावा देने के रूप में ऊपर वर्णित है.
- 21 वीं, 22, 23, 24 वें और 25 वें दिन के बाद प्रारंभिक संवेदीकरण, 30 nebulized ने 1% ओवीए या पीबीएस अकेले एक अल्ट्रासोनिक छिटकानेवाला (Buxco रिसर्च सिस्टम्स, Wilmi के माध्यम से वितरित करने के लिए एक मिनट के लिए चुनौती चूहों जोखिम द्वाराngton, नेकां).
- जगह चूहों WBP के मुख्य कक्ष में, उन्हें plethysmography कक्ष के भीतर कम से कम 10 मिनट के लिए जलवायु का अभ्यस्त बनाना.
- जगह - बाँझ पीबीएस या बाँझ पीबीएस अकेले, के रूप में 4-6 नीचे दिए गए चरणों में वर्णित में 0.1% की ओवीए की एक छिटकानेवाला कप के माध्यम से 1 मिलीग्राम. 30 मिनट के लिए Nebulize.
- छिटकानेवाला कप निकालें और किसी भी शेष समाधान त्यागें.
- Nebulization एक nebulization कक्ष का उपयोग करने के द्वारा एक साथ सभी चूहों पर किया जा सकता है.
द्वितीय. को श्वासनली hyperresponsiveness की Methacholine करने के लिए दृढ़ संकल्प
ए पूरे शरीर Plethysmography के द्वारा airway hyperresponsiveness की अवेध्य मापन (WBP, Buxco रिसर्च सिस्टम्स, Wilmington, नेकां)
- पाउडर methacholine बोतल खोलने से पहले कमरे के तापमान को गर्म करने की अनुमति दें (methacholine बहुत हीड्रोस्कोपिक है और बेकार फार्म clumps अगर पानी को अवशोषित करने की अनुमति दी है). 200 / बाँझ पीबीएस में मिलीलीटर स्टॉक समाधान मिलीग्राम तैयार है, तो धारावाहिक 2 गुना dilutions (उदाहरण के लिए, 100, 50, 25, 12.5, और 60.25 मिलीग्राम / एमएल). समाधान ठंडा रखें.
- उपकरण के रूप में सेट करें: WBP की छिटकानेवाला, पूर्वाग्रह प्रवाह हवा पंप करने के लिए प्रवेश, और WBP गैस जाल चुस्त रबर टयूबिंग का उपयोग करने के लिए आउटलेट के लिए मुख्य प्रवेश कनेक्ट. दबाव transducer संलग्न WBP की मुख्य और संदर्भ कक्षों की दुकानों पुल. केबल के साथ प्रदान की preamplifier दबाव transducer कनेक्ट, और विशिष्ट डाटा अधिग्रहण कार्ड का उपयोग कर पीसी के लिए preamplifier कनेक्ट.
- निर्माता की सिफारिशों के अनुसार सॉफ्टवेयर का उपयोग कर preamplifier जांचना.
- जगह चूहों WBP के मुख्य कक्ष में, उन्हें plethysmography कक्ष के भीतर कम से कम 10 मिनट है, तो 3 मिनट के लिए रिकॉर्ड आधारभूत रीडिंग (Penhbase) के लिए जलवायु का अभ्यस्त बनाना.
- छिटकानेवाला कप में 1 जगह बाँझ पीबीएस के मिलीलीटर. 2 मिनट के लिए Nebulize और फिर सुखाने चरण के दौरान अतिरिक्त 6 मिनट के लिए श्वसन चर की निगरानी. छिटकानेवाला कप निकालें और किसी भी शेष पीबीएस त्यागें.
- छिटकानेवाला कप और अनुसंधान में 6.25 मिलीग्राम / एमएल methacholine की जगह 1 मिलीग्राम2 मिनट से अधिक एक निगरानी 6 मिनट चक्र के लिए EPEAT nebulization.
- 12.5, 25, 50, और 100 मिलीग्राम / methacholine मिलीलीटर के साथ माप दोहराएँ, वही nebulization 2 मिनट अवधि और 6 मिनट निगरानी के चक्र का उपयोग.
- कक्षों से चूहों निकालें और उन्हें अपने पिंजरों में लौटने.
- 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ फिर से भरना छिटकानेवाला कप और एक और अनुक्रम चलाने के लिए टयूबिंग फ्लश.
- नीचे बंद हवा बहती, अलग करना, और जानवरों की एक दूसरे सेट चलाने से पहले सभी कक्षों साफ पोंछे.
बी कम्प्यूटर नियंत्रित वेंटीलेटर द्वारा airway जवाबदेही की इनवेसिव मापन (flexiVent, SCIREQ इंक, मॉन्ट्रियल, कनाडा)
- माउस वजन और 60 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम शरीर के वजन pentobarbital सोडियम की intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) द्वारा चतनाशून्य करना.
- पर्याप्त संज्ञाहरण, स्थिति (उदार) का समास मे प्रयुक्त रूप से पीछे की ओर रक्ताधान के लिए चूहों के बाद.
- 70% इथेनॉल के साथ गर्दन की त्वचा कीटाणुरहित करना. Bupivicaine (0.25% समाधान के 0,1 0,2 मिलीग्राम) मैं पर topically लागू करेंncision साइट. काटकर अलग कर देना और गर्दन की त्वचा को खोलने के लिए. अलग गर्दन की मांसपेशियों और ट्रेकिआ बेनकाब.
- एक 1 - ठीक कैंची के साथ ट्रेकिआ में चीरा 2 मिमी (ट्रेकिआ नहीं तोड़ कुछ हो) और सावधानी से सांस की नली ट्यूब डालें. ट्रेकिआ चारों ओर सीवन एक हवा रिसाव को रोकने के बाँधो.
- माउस शरीर plethysmograph कक्ष में निर्धारित करना और वेंटीलेटर डाला सांस की नली ट्यूब कनेक्ट.
- यांत्रिक वेंटीलेशन शुरू करो. उचित श्वसन दर और ज्वारीय / स्ट्रोक मात्रा (150 स्ट्रोक / मिनट और 200 μl, क्रमशः एक माउस 20 - जी के लिए) निर्धारित करें. यकीन है कि छाती synchrony में वेंटीलेटर के साथ बढ़ रहा है. अगर माउस वेंटीलेटर (आत्म - श्वसन) के साथ "लड़" अधिक संवेदनाहारी इंजेक्षन और तुल्यकालन के लिए प्रतीक्षा करें.
- आधारभूत माप के बाद, एक और 3 मिनट के लिए आधारभूत वेंटिलेशन के तहत चूहों को बनाए रखने, और फिर एक 2 एन डी प्रतिबाधा माप सेट ले. यह आधारभूत मापन के 2 सेट एन डी चूना करने के लिए प्रयोग किया जाता हैमतलब आधारभूत मूल्यों ulate के.
- Channeling एक अल्ट्रासोनिक कणित्र के माध्यम से वेंटीलेटर से सांस खींचने का प्रवाह द्वारा पीबीएस या methacholine (मच) चुनौतियों (6.25, 12.5, 25, 50 और 100 मिलीग्राम / एमएल) उद्धार.
- मच (6.25, 12.5, 25, 50 और 100 मिलीग्राम / एमएल) के साथ प्रत्येक चुनौती के बाद, पिस्टन 120 साँस / मिनट पर 10 मिलीग्राम / किग्रा का एक VT पहुंचाने के लिए लौटने और प्रतिबाधा माप ले.
III. सेलुलर घुसपैठ के हवाई क्षेत्र में मापन
ए में प्रदर्शन ब्रोन्कोएल्वियोलर Lavage (बाल)
- Ahr मापने के बाद, सीओ 2 के साथ चूहों euthanize और शल्य पैड पर अपनी पीठ पर प्रत्येक माउस की स्थिति.
- 70% EtOH साथ क्षेत्र भिगोएँ.
- पेट के निचले हिस्से में शुरुआत है, उदर गुहा खुला कटौती और त्वचा / पेशी ऊपरी निकालने के लिए, पसलियों की ओर ऊपर की तरफ बढ़ने.
- एक बार पसलियों दिखाई दे रहे हैं, ध्यान से डायाफ्राम पंचर कैंची का उपयोग करें. फेफड़े डायाफ्राम से दूर गिर चाहिए. विशेष रूप से careful फेफड़ों या दिल निक के लिए नहीं है.
- का ribcage काटें दूर फेफड़ों / दिल साइट भरने से रक्त रखने के लिए किसी भी प्रमुख रक्त वाहिकाओं में कटौती से बचने के लिए पूरी तरह से बेनकाब.
- एक 27 गेज (बी सीरिंज, फ्रेंकलिन Lakes, NJ) सुई, पंचर दिल निलय और धीरे से और ध्यान खींचने के लिए वापस सिरिंज रक्त एकत्र के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर. ध्यान रखना दिल टूट से बचने के लिए.
- इस मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए रक्त से सीरम ले लीजिए. -70 में स्टोर ° सी का उपयोग करें जब तक.
- त्वचा और गले से ऊतक कटौती जब तक ट्रेकिआ से पता चला है. दूर साफ़ क्षेत्र के भीतर आसानी से काम के लिए पर्याप्त ऊतक (फिर से, किसी भी प्रमुख रक्त वाहिकाओं में कटौती से बचने के लिए).
- घुमावदार कैंची, ट्रेकिआ के तहत कटौती के लिए एक रास्ता साफ.
- ट्रेकिआ के तहत एक घुमावदार संदंश के बिंदु से गुजारें और सिवनी का एक टुकड़ा के अंत समझ. ट्रेकिआ के तहत सीवन धागा ड्रा.
- ट्रेकिआ के बारे में एक आधा गाँठ ढीला, कम गले में टाई.
- Carefully एक पायदान में कटौती, प्रवेशनी के लिए आकार में पर्याप्त है, सीवन धागे ऊपर,.
- ध्यान से छेद में और ट्रेकिआ नीचे सीवन धागे के बिंदु अतीत प्रवेशनी डालें. धीरे आगे दबाएँ जब तक प्रवेशनी (बहुत दूर: पंचर फेफड़ों, बहुत कम: पतन के लिए बाल ठीक करने का प्रयास जब ट्रेकिआ) फेफड़ों के लिए प्रवेश द्वार पर उभर रहा है.
- सिवनी धागा और पूरा गांठ कस प्रवेशनी के आसपास ट्रेकिआ सील.
- प्रवेशनी पर बंद सिरिंज (1 मिलीलीटर पीबीएस है युक्त), और धीरे से फेफड़ों में तरल पदार्थ दबाएँ. फेफड़े lobes व्यक्तिगत धीरे धीरे बढ़ जाना चाहिए. अधिक भरने मत करो. एक पूर्ण विकसित माउस 0.9-1.0 मिलीग्राम के लिए निरपेक्ष अधिकतम है. 0.8 मिलीग्राम सुरक्षित हो सकता है. सिरिंज प्रवेशनी शिथिल लॉक, अन्यथा यह करने के लिए नुकसान का कारण करने के लिए छुड़ाना करने का प्रयास करते समय होने की संभावना है.
- फेफड़ों से तरल पदार्थ को वापस ले लें. यदि प्रतिरोध का सामना करना पड़ा है (प्रवेशनी में चूसा ऊतक), प्रवेशनी दबाएँ धीरे फेफड़ों में आगे और हटाने के फिर से शुरू. इसके अलावा जगह में प्रवेशनी घूर्णन की कोशिश करो. यदि सब एल्सई विफल रहता है, प्रवेशनी हिस्सा वापस लेने का रास्ता, ट्रेकिआ और अधिक इस मामले में पतन की संभावना है.
- सिरिंज प्रवेशनी, कंटेनर में जमा बाल तरल पदार्थ, से अलग करें और ताजा पीबीएस समाधान के साथ 2 बार दोहराएँ.
- बर्फ पर बाल समाधान रखें जब तक नीचे घूमती है.
- बाल तरल पदार्थ और ओवीए विशिष्ट IgE का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस IgE एलिसा किट (एमडी Bioproducts, सेंट पॉल, MN) को मापने के लिए सीरम का प्रयोग करें.
बी कोशिकाओं की गणना और निर्धारित भिन्नता
- बाल द्रव ~ 600 × छ में 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र
- सेल गोली धीरे के पीबीएस में और Resuspend बर्फ पर रहते हैं.
- पतला सेल निलंबन के साथ एक मानक NEUBAUER hemacytometer के लोड और कोशिकाओं गिनती.
- 10 से 40 cytospins के लिए μl मात्रा में 2 की aliquots × 10 4 कोशिकाओं निकालें. यदि आवश्यक कोशिकाओं पतला.
- Cytospins के लिए, मिश्रण 2 × 10 4 कोशिकाओं, 130 μl पीबीएस और 10 μl FBS. पूरे सेल मिश्रण जोड़ें doubकीप ले cytospin और 700 rpm पर 10 मिनट अपकेंद्रित्र, नकली नमूने डबल cytoslides के लिए का उपयोग.
- स्लाइड को धुंधला करने के लिए पहले एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
- फर्क जल्दी दाग (सीमेंस, Newark, DE) का उपयोग करके दाग स्लाइड.
चतुर्थ. प्रतिनिधि परिणाम
अत्यधिक airway के उत्तेजक उत्तेजनाओं के बाद कसना नैदानिक अस्थमा की एक प्रमुख विशेषता है. पूरे शरीर plethysmography (चित्रा 2) और मजबूर दोलन flexiVent प्रणाली (चित्रा 3) का उपयोग करने: हम methacholine ओवीए अवगत और चुनौती दी चूहों में इस तरह के airway hyperresponsiveness को मापने के लिए दो विधियों का वर्णन. दोनों तरीकों का प्रदर्शन है कि ओवीए संवेदीकरण और चुनौती चूहों में airway hyperresponsiveness उत्पादन.
Eosinophil अमीर airway सूजन दोनों नैदानिक और चूहों में एलर्जी airway रोग अस्थमा के एक अन्य प्रमुख विशेषता है. चित्रा 4 में दिखाया
सबूत है कि एलर्जी airway के IgE एंटीबॉडी के overproduction से संवेदनशील एंटीजन को रोग परिणाम इंगित करता है. संवेदीकरण और ओवीए साथ प्रोटोकॉल हम वर्णन का उपयोग चुनौती इलाज चूहों के दोनों सीरम और बाल तरल पदार्थ (चित्रा 5) में IgE के स्तर बढ़ता है.
आकृति 1. ओवीए प्रेरित एलर्जी अस्थमा के लिए प्रयोगात्मक स्कीमा चूहे अवगत दो बार एल्यूमीनियम हीड्राकसीड के 2 मिलीग्राम में बाँझ, Pbs, या बाँझ पीबीएस अकेले की 0.2 मिलीलीटर में 2 मिलीग्राम एल्यूमीनियम हीड्राकसीड के 0.2 मिलीलीटर में emulsified ओवीए के 20 μg साथ है आईपी पर पीछा संकेत यह द्वारा समय अंक 0.1 ओवीए% या बाँझ पीबीएस समाधान के साथ या दैनिक पूर्व चुनौती 30 मिनट के लिए nebulized पीबीएस या पीबीएस में 1% ओवीए posure अकेले एक अल्ट्रासोनिक छिटकानेवाला (Buxco) के माध्यम से दिया. अंतिम ओवीए प्रदर्शन के बाद चौबीस घंटे, airway जवाबदेही निर्धारित किया गया था. बाद में, बाल तरल पदार्थ, रक्त के नमूनों, फेफड़ों की कोशिकाओं और ऊतकों को आगे के विश्लेषण के लिए एकत्र किए गए.
चित्रा 2. Allergen प्रेरित airway hyperresponsiveness की एक noninvasive विधि द्वारा मूल्यांकन (एन = 4/group) चूहे अवगत थे और ओवीए साथ चुनौती दी है. अंतिम चुनौती के बाद चौबीस घंटे, airway hyperresponsiveness साँस methacholine पूरे शरीर के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित plethysmography का उपयोग करके निर्धारित किया गया था. पेन्ह और निर्धारित पेन्ह अनुपात (औसत पेन्ह 8 मिनट methacholine पीबीएस के साथ 8 मिनट के अंतराल पर औसत पेन्ह से विभाजित के साथ समय अंतराल पर) के रूप में व्यक्त किया गया था. *, पी <.05 बनाम पीबीएस.
/ iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg ">
चित्रा 3. Allergen प्रेरित airway hyperresponsiveness की एक आक्रामक तरीके से मूल्यांकन (मजबूर दोलन). चूहे (एन 4/group =) अवगत थे और ओवीए साथ चुनौती दी है. अंतिम चुनौती के बाद चौबीस घंटे, airway hyperresponsiveness साँस methacholine की सांद्रता में वृद्धि करने के लिए मजबूर (flexiVent) दोलन विधि के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित द्वारा निर्धारित किया गया था. ए, बी) श्वासनली प्रतिरोध, सी) फेफड़े elastance. *, पी <.05 बनाम पीबीएस.
चित्रा 4. बाल तरल पदार्थ कोशिका गिनती. चूहे (एन 4/group =) अवगत थे और ओवीए साथ चुनौती दी है. अंतिम चुनौती, (शीर्ष) के बाद चौबीस घंटे बाल कोशिकाओं को एकत्र किया गया और कुल कोशिकाओं प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में गिना रहे थे. (नीचे) Cytospin स्लाइड पी थेrepared और डिफ - त्वरित साथ दाग. मुन्ना = कुल कोशिकाओं, Eos = इयोस्नोफिल्स, Neu = neutrophils, मैक = मैक्रोफेज, Lym लिम्फोसाइटों =. *, पी <.05 बनाम पीबीएस.
चित्रा 5. ओवीए विशिष्ट IgE. चूहे (एन = 4/group) अवगत थे और ओवीए साथ चुनौती दी है. अंतिम चुनौती के बाद चौबीस घंटे, IgE के बाल तरल पदार्थ में और कार्डियक पंचर द्वारा प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में एकत्र रक्त से सीरम में मापा गया था. *, पी <.05 बनाम पीबीएस.
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Discussion
एलर्जी airway रोग के पशु मॉडल नैदानिक अस्थमा के लिए प्रासंगिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करते हैं. अलग अलग मॉडल, अलग प्रजातियों और प्रतिजनों को रोजगार का एक संख्या में विकसित किया गया है. माउस, एक आकर्षक और अक्सर इस्तेमाल किया प्रयोगशाला प्रजातियों, एलर्जी airway रोग के मॉडल के लिए भी लाभ का एक नंबर प्रदान करता है 9,10. हालांकि इस तरह के मॉडल विशेष रूप से कठिन होने को पुन: पेश पुरानी बीमारी के पहलुओं के साथ हर मामले में अस्थमा के 11, नहीं की नकल करते हैं, 12,13 हम यहाँ इस बात की पुष्टि करते हैं कि प्रमुख विशेषताओं के कई reproduced हैं. हम यह भी पता चलता है कि, मानव अस्थमा के रूप में इन सुविधाओं प्रतिजन विशिष्ट IgE में दोनों सीरम और बाल तरल पदार्थ में वृद्धि के साथ जुड़े रहे हैं. हम दो murine मॉडल, दोनों प्रतिजन के रूप में रोजगार ओवीए मौजूद है, लेकिन अलग चुनौती तकनीक का उपयोग. Intratracheal प्रशासन कुछ जटिल और समय लेने वाली है, लेकिन प्रतिजन के एक ज्ञात मात्रा देने के लिए सीधे का लाभ प्रदान करता हैफेफड़ों. यह भी संभव है कि इस विधि को करते हैं विकल्पों की तुलना में फेफड़ों में प्रतिजन अधिक गहरा उद्धार है. हम intratracheal प्रसव के लिए एक आक्रामक तरीके का वर्णन है, लेकिन प्रतिजन भी एक ट्यूब या मौखिक गुहा के माध्यम से डाला प्रवेशनी के माध्यम से intratracheally दिया जा सकता है. इस विधि में कहीं जौव में वर्णित 14 nebulization सरल और अधिक सीधे मानव जोखिम के सामान्य मार्ग mimics के है. Quantitation अधिक चर रहा है, तथापि, और फेफड़ों को प्रसव के कम कुशल 15 दरअसल, यह संभावना है कि खुराक का एक बड़ा लेकिन अज्ञात अंश ऊपरी वायुमार्ग में जमा है. हो सकता है. एक तीसरा विकल्प, यहाँ वर्णित नहीं है, intranasal वितरण है. फिर, यह संभावना है कि खुराक का एक बड़ा अंश ऊपरी वायुमार्ग में जमा किया जाएगा.
हालांकि हमारे प्रदर्शन C57BL / 6 चूहों का उपयोग किया जाता है, सबूत पता चलता है कि कुछ अन्य उपभेदों विशिष्ट endpoints के बारे में अधिक मजबूत परिणाम दे सकता है. C57BL / 6 बी के साथ तुलना में/ ALB 16 ग या दोनों BALB / ग और 17 / FVB न्यू जर्सी चूहों के साथ, C57BL / 6 चूहों Ahr में छोटी वृद्धि देखी गई. दूसरी ओर, C57BL / 6 चूहों लेकिन अन्य में नहीं 17 cytokine उन्नयन दोनों तनाव और साइटोकाइन विशिष्ट थे eosinophilia में एक 16 अध्ययन में अधिक से अधिक बढ़ जाती है दिखाया. पसंदीदा तनाव इसलिए सबसे महत्वपूर्ण समझा endpoint पर निर्भर हो सकता है.
एलर्जी airway रोग के दो मुख्य विशेषताएं आमतौर पर मूल्यांकन के लिए चुना जाता है क्रम में करने के लिए प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के प्रभाव का निर्धारण: Ahr और airway सूजन के हद है. Ahr पूरे शरीर plethysmography (WBP) या मजबूर दोलन द्वारा मापा या तो किया जा सकता है. दोनों ही मामलों में, methacholine उत्तेजक चुनौती के रूप में प्रयोग किया जाता है. WBP vivo में माप है कि जागरूक पर airway जेट के विश्लेषण की अनुमति देता है एक कार्यात्मक है, स्वतंत्र रूप से बढ़ या न्यूनतम इनवेसिव सर्जरी और संज्ञाहरण के बिना स्र्द्ध चूहों. Airway जवाबदेही का उपयोग करते हुए व्यक्त किया हैबदल airway समारोह के एक पैरामीटर के रूप में "बढ़ाया ठहराव" (पेन्ह). पेन्ह एक अनुभवजन्य पैरामीटर है कि दोनों प्रेरणा और समाप्ति से बॉक्स प्रवाह तरंग में परिवर्तन को दर्शाता है और यह जल्दी और देर से expiratory बॉक्स प्रवाह की तुलना के साथ जोड़ती है. WBP फेफड़ों के प्रतिरोध को मापने के लिए आक्रामक साधनों की तुलना में कई संभावित लाभ है, क्योंकि यह तकनीकी रूप से कम मांग और aerosolized उत्तेजक की airway जवाबदेही की माप की अनुमति देता है. इस विधि दोनों मनोवैज्ञानिक तनाव के प्रभाव और पशु तैयारी के समय कम से कम, यह दोहराया (अलग समय बिंदुओं पर एक ही पशु की परीक्षा) पर समय की लंबी अवधि (24 घंटे), और माप माप के लिए आदर्श बना रही है जिसके दौरान एयरोसौल्ज़ के एक किस्म कर सकते हैं एक नियंत्रित तरीके से और repeatable में दिलाई. परिणाम आक्रामक तरीके से उन लोगों के साथ मजबूती से सहसंबंधी, लेकिन यह तेज और आसान है.
दो वैकल्पिक noninvasive तरीकों माप है कि कहा जाता है प्रदान करते हैंअधिक सीधे की airway कसना से संबंधित हो. माउस डबल कक्ष plethysmography में करने के लिए thoracoabdominal कक्ष के सामने में एक छेद के माध्यम से अपने सिर छड़ी मजबूर है 18. एक नाक कक्ष तो thoracoabdominal कक्ष के सामने करने के लिए फिट है और एक सिर छेद सील लाटेकस फिल्म में कट जाता है कक्षों के बीच. इस छेद को ठीक करने के लिए सीमित सांस airflow के बिना कोठरियों के बीच एक हवा तंग सील प्रदान आकार है. Plethysmographic माप तो दोनों कक्षों में लिया जाता है और नाक और thoracoabdominal प्रवाह के बीच में देरी के लिए विशिष्ट airway प्रतिरोध (sRaw) की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. हेड बाहर plethysmography के समान है सिवाय इसके कि हवा नाक कक्ष में स्वतंत्र रूप से बहती है और कोई plethysmographic माप वहाँ बना रहे हैं 19 प्राथमिक गणना पैरामीटर midexpiratory चरण (50 एफई) में प्रवाह दर है. दोनों तकनीकों, WBP की तरह, घंटे के एक नंबर पर दोहराया माप के लिए उपयुक्त हैं, ख के मूल्यांकन की अनुमतिजल्दी और देर से प्रतिक्रियाओं oth. हालांकि, दोनों जानवरों स्र्द्ध होना करने के लिए, जो अनिश्चित परिणाम का उत्पादन जब तक पशुओं के लिए कई दिनों के पाठ्यक्रम पर उपकरण के लिए आदी रहे हैं हो सकता है की आवश्यकता है. यह भी मुश्किल हो सकता है के लिए एक प्रभावी हवा तंग सील है, जो दोनों ही मामलों में आवश्यक है आश्वस्त कर सकते हैं. इसके अलावा, के बाद से दोनों पेन्ह और sRaw के आक्रामक माप के साथ दृढ़ता से सहसंबंधी दिखाया गया है, और पेन्ह और sRaw गिनी सूअरों, 20 में सीधे सहसंबंधी दिखाया गया है यह सवाल कर सकते हैं कि क्या अतिरिक्त जानकारी प्राप्त बढ़ प्रयोगात्मक कठिनाई को सही ठहराते हैं.
मजबूर दोलन विधि में, में चूहों tracheotomized गहरा संवेदनाहृत और एक यांत्रिक वेंटीलेटर ट्यूब से जुड़ा है. वेंटीलेटर दबाव के रूप में प्रवाह माप फुलाते और फेफड़ों तो deflates फेफड़े के प्रतिरोध और गतिशील अनुपालन के प्रत्यक्ष माप के लिए अनुमति देते हैं. इस airway के यांत्रिकी कि WBP साथ उपलब्ध नहीं है के बारे में जानकारी प्रदान करता है. के लिएced दोलन तकनीकी रूप से अधिक कठिन है, तथापि, और आम तौर पर एक टर्मिनल प्रक्रिया है. प्रयोगात्मक endpoints के रूप में, दो प्रक्रियाओं को आम तौर पर इसी तरह के परिणाम दे 19.
नैदानिक आमतौर murine एलर्जी airway रोग में प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया अस्थमा के अन्य प्रमुख विशेषता इओसिनोफिलिक सूजन है. हालांकि सूजन के अन्य पहलुओं के रूप में अच्छी तरह से मापा जा सकता है, यह सबसे अधिक भड़काऊ (विशेष रूप से eosinophil) वायुमार्ग, फेफड़ों, या दोनों में सेल घुसपैठ की हद का निर्धारण शामिल है. और वायुमार्ग में कोशिकाओं की संख्या और प्रकार में निर्धारित किया जाता है बाल द्रव पहले कुल सेल नंबर hemacytometer में गिनती से निर्धारित होता है, और फिर सेल प्रकार अंतर धुंधला निम्नलिखित cytospin से निर्धारित किया जाता है. हालांकि बाल द्रव संग्रह सिद्धांत में रहने वाले चूहों में प्रदर्शन किया जा सकता है, क्योंकि यह मानव में है, यह आमतौर पर अधिक है और आसानी से इच्छामृत्यु का पालन किया है. इयोसिन प्रेमीफेफड़ों में घुसपैठ मानक histopathological तकनीक द्वारा फेफड़ों छांटना द्वारा मूल्यांकन किया है.
कुछ उदाहरणों में यह भी उपयोगी हो करने के लिए हद तक जो प्रतिजन संवेदीकरण और चुनौती जाम (बलगम उत्पादक) सेल प्रसार को बढ़ावा देने का आकलन कर सकते हैं. यह आसानी से आवधिक एसिड शिफ़, जो बलगम के लिए विशिष्ट है साथ फेफड़ों वर्गों धुंधला द्वारा पूरा किया है. प्रतिजन विशिष्ट IgE भी बाल तरल पदार्थ और आसानी से उपलब्ध किट का उपयोग कर सीरम में मापा जा सकता है. IgE के माप सेटिंग में महत्वपूर्ण हो सकता है, जहां संवेदीकरण की डिग्री, अंत अंग से अलग प्रतिक्रिया के रूप में, एक महत्वपूर्ण पैरामीटर हो सकता है. साइटोकिन्स और टी सेल प्रतिक्रिया सहित अन्य माप, कि पशु मॉडल में एलर्जी airway रोग के अध्ययन है कि हम यहाँ वर्णित नहीं है मूल्यवान adjuncts हैं की एक विस्तृत विविधता हैं. यह प्रासंगिक प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता है कि प्रतिजन संवेदीकरण और चुनौती के प्रकाश में लाना कर सकते हैं कि इस तरह के मॉडल संवर्धन में मूल्यवान प्रस्तुत करनाइस रोग के y.
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Disclosures
जानवरों पर प्रयोग के दिशा निर्देशों और नियमों अटलांटा VAMC IACUC समिति द्वारा आगे # V010-10 प्रोटोकॉल के तहत स्थापित के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
इस काम के एनआईएच अनुदान (RCR) के HL093196 और अटलांटा अनुसंधान और शिक्षा फाउंडेशन (Aref) के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | |
| Aluminum hydroxide | Sigma-Aldrich | 239186 | |
| Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A2251 | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Whole body plethysmography (WBP) system | Buxco Research Systems | http://www.buxco.com | |
| FlexiVent | SCIREQ, Inc. | http://www.scireq.com | |
| Light microscope | Leica Microsystems | ||
| Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Diff-Quick stain | Siemens AG | B4132-1A | |
| Repetitive pipette | Tridak | STP4001-0025 |
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