1. Préparer Aiguilles d'injection Préparer borosilicate aiguilles de verre injection microcapillaires (Harvard Apparatus, 300038, 1 mm de diamètre extérieur x 0,78 mm de diamètre) en utilisant un dispositif de traction micropipette (Sutter Instruments Inc, Flaming / Brown p-97 avec les paramètres suivants pour une plus longue pointe: 400 pression de l'air; la chaleur 610; traction 40; vitesse de 50; de 30 et avec les paramètres suivants pour une courte pointe: 500 pression de l'air, la chaleur 510; traction 100; vitesse 200; temps 60). Brisez la pointe de l'aiguille avec des pincettes fines pour obtenir un diamètre d'ouverture de pointe pm 5-10. Il est conseillé de l'ouverture conique pointe de l'aiguille à un angle de 45 degrés avec un microbroyeur (Narishige Inc, EG-400) pour donner un plus nette pointe. Cela facilitera la perforation de la couche épidermique et donc se traduire par davantage d'injections reproductibles avec moins de dommages des tissus qu'avec aiguilles émoussées. Aiguilles à pointe plus sont préférés pour veine caudale (étape 5) et conduit de Cuvier (étape 6.1) et des injections plus courtes aiguilles à boutsont préférés pour les autres protocoles d'injection (étapes 6,2-6,6). 2. Préparer S. typhimurium inoculum Plaque à S. typhimurium d'un stock -80 ° C sur le glycérol plaques d'agar LB (avec des antibiotiques appropriés pour sélectionner des vecteurs d'expression de fluorescence) et incuber une nuit à 37 ° C. Choisissez individuels colonies fluorescence positifs et les remettre en suspension à la concentration souhaitée (voir protocoles 5 et 6) dans stérile tampon phosphate salin (PBS), contenant éventuellement 0,085% (v / v) de rouge de phénol (Sigma-Aldrich) pour faciliter la visualisation de l' processus d'injection. Utiliser directement la suspension frais pour l'injection ou de préparer des stocks de glycérol. Pour préparer les stocks de glycérol, ralentit le stock d'injection fraîchement préparé à la concentration désirée de bactéries et de se concentrer le stock en remettant en suspension le culot dans la moitié du volume à partir de stériles 20% (v / v) de glycérol (Sigma-Aldrich) dans du PBS. Stocker le stock de glycérol à -80 ° C Diluer le stock de glycérol 1:1 (v / v) avant l'injection dans du PBS stérile, contenant éventuellement 0,17% rouge de phénol. Vortex la suspension bactérienne pour éviter les grumeaux. Chargez l'inoculum dans l'aiguille microcapillaire en utilisant une pointe microloader (Eppendorf, 5,242,956,003). En raison de la taille relativement importante de S. bactéries typhimurium et leur brillante Ds-ROUGE fluorescence lors de l'utilisation du vecteur d'expression pGMDs3 3 (souche disponible sur demande), individuels cellules bactériennes peuvent facilement être assimilé à un stéréomicroscope à fluorescence afin de définir la dose d'injection. À cette fin, injecter 1 nL dans une goutte de PBS sur une plaque de gélose, dénombrer les bactéries fluorescentes, et de calculer le volume d'injection qui est nécessaire pour obtenir la dose désirée bactérienne (de préférence conserver le volume d'injection entre 1-2 nL). Injecter des embryons avec S. typhimurium par l'intermédiaire de l'itinéraire sélectionné (voir protocoles 5 et 6). 3. Préparer <em> M. marinum inoculum Gardez le M. marinum pression croissante sur Difco Middlebrook 7H10 agar (BD et de l'entreprise) supplémenté avec 10% d'acide oléique-albumine-dextrose-catalase (OADC, BD et de l'entreprise), le glycérol 0,5%, et avec des antibiotiques appropriés pour sélectionner des vecteurs d'expression de fluorescence (souches disponibles sur demande 9), donc il ya toujours un stock frais. Choisissez une colonie de M. marinum et remettre en suspension dans Difco Middlebrook bouillon 7H9 (BD et de l'entreprise) supplémenté avec 10% d'albumine-dextrose-catalase (ADC, BD et de l'entreprise) et 0,05% de Tween 80 (Sigma-Aldrich) et les antibiotiques appropriés. Vérifiez que la densité optique (DO) à 600 nm est de 0,2 à 0,3 et le laisser grandir statiquement pendant une nuit à 28,5 ° C. Le temps de génération de M. marinum est d'environ 4-6 h, variant en fonction de la souche. Mesurer la DO à 600 nm à nouveau le jour des injections. Un DO600 de 1 correspond à environ 10 8 M. marinum / ml(Cela peut varier en fonction de la souche bactérienne utilisée et devrait donc être basée sur une courbe de croissance pour la souche particulière). Récolter les bactéries quand ils sont en phase logarithmique (ne laissez pas le DO600 dépasser 1,00) par centrifugation et les laver trois fois dans du PBS stérile. Mesurer la DO600 nouveau de la suspension bactérienne dans du PBS, ralentit, et remettre en suspension les bactéries à la concentration souhaitée (voir protocoles 5 et 6) dans du PBS ou dans Polyvinylpyrrolidone 2% (PVP40) dans du PBS (w / v), ce qui améliore l'homogénéité de la suspension bactérienne. Le rouge de phénol (Sigma-Aldrich) peut être ajouté à une concentration de 0,085% pour faciliter la visualisation du processus d'injection. Utiliser directement la suspension frais pour l'injection ou de préparer des stocks de glycérol. Pour préparer les stocks glycérol centrifuger le stock d'injection fraîchement préparé avec la concentration désirée de bactéries et de concentrer le stock en remettant en suspension du culot dans la moitié du volume à partir de 20% de glycérol stérile dans du PBS. Stocker le glycstock de erol à -80 ° C. Diluer le stock de glycérol 01:01 (volume / volume) dans du PBS stérile, contenant éventuellement 4% PVP40 et / ou 0,17% de rouge de phénol. 4. Préparer embryons de poisson zèbre pour préparations injectables Mettre en place de couples reproducteurs de poisson zèbre et de recueillir des embryons comme le montre dans un autre article 10 vidéo. Gardez embryons dans une boîte de Pétri remplie d'eau d'œuf (60 sels de la Mer pg / ml; 60. Ca embryons / boîte) et incuber à 28,5 ° C. Si nécessaire, ajouter 0,003% N-phénylthiourée (PTU, Sigma-Aldrich) à l'eau d'œuf lorsque les embryons sont environ 12 HPF afin de prévenir la mélanisation. Environ 24 heures après la fécondation (HPF), dechorionate les embryons avec des pincettes FINE (fine sciences Tools Inc, Dumont # 5 forceps – Biologie Inox. Conserver les embryons dans une boîte de Pétri remplie d'eau et d'oeuf avec une couche de 1% d'agarose sur le fond pour éviter embryons de coller à la surface de matière plastique. Anesthésier les embryons avec 200 ug / ml tampon 3Acide p-aminobenzoïque (tricaïne, Sigma-Aldrich) environ 10 min avant les injections. 5. L'injection intraveineuse de bactéries dans une journée embryons vieux Stade des embryons à 28 HPF 11 par la vérification de la circulation du sang compatible, en commençant de la pigmentation dans les yeux, une queue droite, et le cœur étant positionné juste ventralement à l'œil. Anesthésier les embryons, voir l'étape 4.5. Chargez l'aiguille avec l'inoculum bactérien en utilisant une pointe microloader. Montez l'aiguille chargée sur un micromanipulateur (Instrument Sutter, MM-33) relié à un support (Instruments de précision du monde, M10L support magnétique) et le positionner sous un microscope stéréo (Leica M50, achromat 1x objectif 0,15 NA, base de la lumière transmise TL ST). Réglez le temps d'injection à 0,2 s et la pression de compensation à 15 hPa (Eppendorf, FemtoJet). Régler la pression d'injection entre 700 et 900 hPa pour obtenir le volume d'injection de l'aiguilleutilisée. Ajuster la taille de la goutte en fonction du diamètre voulu à l'aide d'une barre d'échelle sur une lame de microscope ou dans l'oculaire. Pour la détermination de la taille de la goutte peut être injecté dans l'huile minérale sur une lame de microscope, ou la taille peut être estimée en injectant dans l'air, ce qui laisse la goutte suspendue sur la pointe de l'aiguille. Le rayon d'une goutte d'une nL est 0,062 mm (V = 4/3 π r 3). Réglez le micromanipulateur avec l'aiguille chargée dans la position correcte avant d'injecter (soit environ à un angle de 45 ° par rapport à la surface de la plaque d'injection) et seulement le déplacer d'avant en arrière à injecter. Les embryons sont anesthésiés à la pipette sur une plaque plane d'agarose 1% injection et de l'eau en excès est éliminé oeuf, ce qui permet la tension de surface pour contenir les embryons en place lors des injections. Utilisez un outil de boucle de cheveux (Figure 2) pour aligner les embryons. Orienter la plaque d'injection à la main lors des injections de placer des embryons dans la position préférée pour inserting de l'aiguille, c'est à dire avec leurs queues pointant vers la pointe de l'aiguille. Placez le bout de l'aiguille directement au-dessus de la clôture veine caudale à l'ouverture uro-génital (figure 1A), percer le périderme avec le bout de l'aiguille et injecter la dose voulue de bactéries, nous utilisons environ. 250 UFC de S. typhimurium de type sauvage (wt) souche SL1027, contenant l'expression Ds-ROUGE vecteur pGMDs3, et ca. 120 ufc de M. marinum souche Mma20. La suspension bactérienne injectée va suivre le flux sanguin dans la veine caudale vers le cœur. Surveiller si l'injection a été exécutée correctement par la vérification d'un volume en expansion du système vasculaire directement après l'impulsion de 2. Pour les expériences de dose-réponse, 2-3 injections consécutives peut être effectuée sans extraction de l'aiguille. Vérifiez fréquemment que le volume d'injection reste le même pendant l'expérience. Pour fournir un contrôle de la cohérence des injections dans l'expérience, injecter un drop des bactéries directement dans une goutte de PBS stérile sur milieu de croissance bactérienne après environ chaque injection d'embryons 30 e. Plaque à cette baisse et de compter les colonies bactériennes après incubation pour déterminer les unités formant colonies (UFC) dans le volume d'injection. Utilisez un stéréomicroscope à fluorescence (protocole 7) pour observer individuelle fluorescente S. cellules typhimurium circulant dans le sang directement après l'injection, et jeter les embryons qui ne sont pas correctement injectés. Individuel fluorescente M. bactéries marinum peut pas être observée par microscopie à fluorescence stéréo directement après les injections, mais les agrégats fluorescents de cellules infectées doit être visible par 2 jours après l'infection (dpi) et grossissent au fil du temps. 6. Autres voies d'infection Conduits d'injection Cuvier: line up embryons anesthésiés (2-3 dpf) sur une plaque plane d'agarose 1% injection que pour les injections veine caudale (voir 5.6). Orienter la injecterplaque d'ions à la main lors des injections de placer des embryons dans la position préférée pour l'insertion de l'aiguille, c'est à dire en diagonale sous un angle de 45 ° de sorte que le conduit de Cuvier peut être approché par la pointe de l'aiguille de la face dorsale de l'embryon (figure 1B) . Insérez l'aiguille dans le point de départ du canal de Cuvier tout dorsale à l'endroit où le conduit commence élargissement sur le sac jaune et injecter 100-200 bactéries (1-3 nL). L'injection est correcte si le volume intérieur du conduit se dilate directement après l'impulsion et le sac vitellin n'est pas rompu. Comme pour les injections veine caudale (voir 5.7), plusieurs injections consécutives peut être effectuée sans extraction de l'aiguille. D'injection ventricule rhombencéphale: aligner embryons anesthésiés (32 HPF) sur une plaque plane d'agarose 1% injection de telle sorte que les embryons sont positionnés avec leur côté dorsal vers le bout de l'aiguille. Insérez l'aiguille dans le ventricule du cerveau postérieur d'une position antérieure sans toucher à la neuroepithelium (figure 1C) et injecter 20-100 bactéries (0.5-1 nL). Pour pratiquer la procédure, utilisez un colorant fluorescent (comme le Texas-Red dextran), comme indiqué dans un autre article vidéo 13. D'injection musculaire Queue: embryons de position anesthésiés (1-2 dpf) que pour les injections veine caudale (voir 5.6). Ajuster la micromanipulateur avec l'aiguille chargée à un angle d'environ 65 ° par rapport à la surface de plaque d'injection. Injecter une suspension bactérienne (0.5-1 nL) contenant 20 à 50 ufc dans le muscle au-dessus de l'ouverture uro-génital (figure 1D) sans causer de dommages à la notocorde ou des vaisseaux sanguins. Injection vésicule otique: embryons de position anesthésiés (2-3 dpf) que pour les injections veine caudale (voir 5.6). Ajuster la micromanipulateur avec l'aiguille chargée à un angle d'environ 65 ° par rapport à la surface de plaque d'injection. Injecter environ 20 bactéries (0,5 nL) dans la vésicule otique (figure 1E) avec la presse à faibleure pour éviter une rupture du tissu local. Injection notochorde: line up embryons anesthésiés (1-2 dpf) sur une plaque plane d'agarose 1% injection de telle sorte que les embryons sont positionnés avec leur queue pointant vers l'extérieur de la pointe de l'aiguille. Insérez l'aiguille dans le tissu musculaire queue dans la notochorde (Figure 1F) et injecter environ 20-50 bactéries (maximale 0,5 nL). Prenez soin de ne pas injecter trop de volume pour éviter une rupture de la notocorde. Injection jaune d'oeuf: oeufs de position contenant des embryons au stade de 16 à 1000 cellules sur une plaque d'agarose 1% injection avec canaux rectangulaires ou en forme de V faites avec un moule de 12 canaux ou en ligne à http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Percer l'aiguille à travers le chorion dans le centre du jaune (figure 1G) et injecter bactéries 20-40 (1-2 nL). L'utilisation de la solution de 2% pour les porte-PVP40 la suspension bactérienne (voir l'étape 3.5)est important de prévenir la propagation des bactéries au début dans l'embryon. 7. L'image stéréo de l'infection Anesthésier les embryons infectés dans un plat agarose à 1% en couches de Petri couverte avec de l'eau contenant l'œuf tricaïne (voir 4.5). Alignez les embryons dans la bonne position pour l'imagerie sous un microscope à fluorescence stéréo avec un outil en boucle les cheveux (Figure 2). Avant la vessie natatoire a gonflé (1-5 dpf), les embryons seront à plat sur les côtés permettant d'imagerie à vision latérale. Si une position différente de celle du point de vue latérale est nécessaire, monter les embryons dans la méthylcellulose 1,5%. Manipuler l'embryon dans la position souhaitée avec un outil en boucle les cheveux (Figure 2). Retour des embryons d'œufs à l'eau après l'imagerie. 8. Imagerie confocale de l'infection Déposer une goutte de bas point de fusion d'agarose (Lonza Inc, 1,5% (p / v) dans l'eau d'œuf) sur le fond de verre d'unWillCo-vaisselle (WillCo puits, GWSt-5040) si un microscope inversé confocal est utilisé, ou sur une lame dépression seule cavité (gélose scientifique, L4090) si un microscope confocal est utilisé en position verticale. Placez l'embryon anesthésié dans la goutte d'agarose avec une quantité limitée d'eau oeuf et de manipuler l'embryon en position avec un outil en boucle les cheveux (Figure 2). Lors de l'utilisation d'un microscope inversé, il est important que la région de l'embryon d'intérêt est à plat contre le fond de verre de l'antenne d'imagerie. Un microscope droit peut être utilisé en combinaison avec immersion dans l'eau ou des objectifs interurbains sèches et l'embryon doit être positionné de telle sorte que la région d'intérêt est le plus près de l'objectif que possible. Laissez l'agarose se solidifier et de submerger la chute d'agarose dans l'eau d'œuf contenant tricaïne (voir 4.5). Si un microscope droit est utilisé, placer une lamelle de verre sur le dessus de la cavité dépression (ne permettent pas de bulles d'air pour former). Séquentiellement acquérir la grippeorescence et des images de transmission. Retirez délicatement le agarose de l'embryon avec des pincettes fines et placez l'embryon de retour dans l'eau d'œuf si elle est nécessaire pour d'autres expériences. 9. Les résultats représentatifs L'injection de Salmonella typhimurium ou Mycobacterium marinum bactéries dans l'île du sang d'embryons à 1 résultats dpf dans la phagocytose par les macrophages rapide. Le gène mpeg1 a récemment été identifié comme un marqueur fidèle de macrophages embryonnaires, colocalisent avec le CSF1R bien établie macrophages marqueur (FMS) et ne se chevauchent pas avec des marqueurs de neutrophiles tels que megapixels (MPO) et Lyz 4, 14. Pour l'imagerie en direct de la phagocytose bactérienne, nous avons utilisé des lignées transgéniques dans lesquelles le promoteur dirige l'expression mpeg1 protéine fluorescente dans des macrophages 14. Ces lignées transgéniques soit le promoteur f mpeg1utilisée directement pour le gène GFP ou employer un système à deux composants, où le promoteur dirige l'expression mpeg1 du facteur de transcription de levure GAL4 qui active un second transgène avec la séquence de reconnaissance de Gal4 (UAS, en amont activation des séquences) fusionnés au gène kaede. Lorsque l'injection de sang île (protocole n ° 5; Figure 1A) est effectuée correctement, les bactéries seront immédiatement circuler à travers la circulation sanguine et se propager dans l'embryon. Diffusion de la relativement grande et vive fluorescente Ds-ROUGE étiqueté S. bactéries typhimurium peut être directement représentées avec un microscope stéréo fluorescence (figure 3A), et l'imagerie confocale à des salons hpi 2 que de nombreuses bactéries sont phagocytées par des macrophages fluorescentes (figure 3B-C). L'injection d'aussi peu que 25 ufc de type sauvage S. bactéries typhimurium se traduira par une infection mortelle, alors qu'une dose similaire de bactéries d'un s avirulentetrain, comme Ra, peut être effacé par le système immunitaire 3 embryonnaire. Une dose d'injection de 250 ufc a été utilisé pour déterminer les réponses transcriptionnelles à S. l'infection typhimurium chez l'embryon de poisson zèbre et démontré l'induction d'une forte pro-inflammatoire de réponse l'expression des gènes 15. En revanche, l'injection intraveineuse de M. marinum bactéries ne provoque pas une forte réponse pro-inflammatoire, mais conduit à une infection persistante où les macrophages infectés former des agrégats serrés qui sont considérés comme les premières étapes de granulomes, qui sont la marque distinctive de la tuberculose 2. Imagerie confocale d'un tel agrégat granulome-comme dans la Tg (mpeg1: EGFP) gl22 la ligne 14 à 5 dpi montre la croissance intracellulaire de mCherry marqué M. bactéries marinum l'intérieur des macrophages verts fluorescents (Figure 3D-E). Otses voies d'infection sont utiles à des fins différentes. Bactéries peut être injecté dans le ventricule rhombencéphale à 32 hpf (figure 1C), qui est un compartiment sans macrophages. Injection de 20-100 mCherry marqué M. bactéries marinum dans ce compartiment conduit à l'infiltration rapide par les macrophages phagocytent les bactéries que (figure 4A). Une autre méthode pour étudier la migration dirigée de cellules immunitaires innées est l'injection de bactéries dans le muscle queue (figure 1D). Cependant, les injections musculaires queue aussi causer des dommages aux tissus qui en elle-même suscite une certaine attraction des leucocytes. Une telle réaction traumatique peuvent être évités lorsque attentivement l'injection d'un petit volume (0.5-1 nL) dans la vésicule otique (figure 1E). Comme le montre ici en utilisant la Tg (mpx: EGFP) I114 ligne 16, l'injection d'environ 20 UFC de S. typhimurium dans la vésicule otique conduit à l'attraction des neutrophiles à 3 hpi ( <strong> Figure 4D), tandis que cette réponse n'est pas observée dans du PBS de contrôle des injections (figure 4E). La notocorde, qui semble être résistant à l'infiltration par les leucocytes, est un compartiment permissive pour la croissance de M. mutants marinum qui sont fortement atténué lorsqu'il est injecté dans d'autres tissus (7; Figure 4F). Enfin, l'injection précoce de M. marinum dans le jaune d'embryons fournit une méthode alternative pour parvenir à une infection systémique. En général, nous effectuer ces injections autour de la scène 16 cellules (Figure 1G), mais des injections bactériennes dans le jaune d'oeuf peut également être effectuée à un stade ultérieur (jusqu'à l'étape de 1000 cellules), ou plus tôt (1 à 8 stade cellulaire) pour la co-injections avec morpholinos 8. Après injection de jaune d'une dose de 20-40 ufc, M. bactéries marinum étalé sur plusieurs jours dans les tissus embryonnaires et le formulaire de granulome-comme des agrégats semblables à ceux observés sur le classiqueméthode d'injection par voie intraveineuse 8; (4G Figure). Procédé d'injection jaune n'est pas adapté pour S. l'infection typhimurium, parce que sa croissance rapide dans le jaune provoque létalité précoce. La méthode d'infection jaune pour M. l'infection marinum sera utile pour applications à haut débit car il peut être automatisé en utilisant un robot d'injection 8. Figure 1. Aperçu des méthodes d'injection utilisées pour établir des infections systémiques ou locales dans les embryons de poisson zèbre. (AB) injections intraveineuses pour établir une infection systémique rapide sont réalisées dans la veine caudale à l'île du sang postérieure au 1 dpf (A) ou dans le canal de Cuvier à 2-3 dpf (B). (CE) injections locales pour l'étude des macrophages et la chimiotaxie des neutrophiles sont effectuées dans le ventricule du cerveau postérieur au 1 dpf (C), Le muscle queue à 1-2 dpf (D) ou de la vésicule otique à 2-3 dpf (E). (F) Injections pour créer une infection apparemment inaccessible aux phagocytes sont effectuées dans la notochorde à 1-2 dpf. (G) Injections de créer une infection systémique précoce avec lenteur la croissance des bactéries telles que M. marinum peut être effectuée dans le jaune, au stade de 16 à 1000 cellules. Toutes les images ont été prises avec un Leica M165C, Planapo 1.0x relié à une caméra Leica DFC420 (Leica 10446307 0.8x). Figure 2. Outil de boucle de cheveux. Un morceau de cheveu humain est inséré comme une boucle dans l'ouverture d'une pipette Pasteur et fixé en place avec la super glue ou avec Tipp-Ex. Cela fournit un outil pratique pour manipuler délicatement embryons de poisson zèbre fragiles. Figure 3. Les injections intraveineuses derouge fluorescent Salmonella typhimurium et Mycobacterium marinum. Ds-ROUGE marqué S. typhimurium SL1027 bactéries (AC) et mCherry marqué M. marinum Mma20 bactéries (DE) ont été injectés dans l'île du sang de la Tg (mpeg1: Gal4-VP16) GL24; Tg (UAS-E1b: Kaede) s1999t (AC) ou Tg (mpeg1: EGFP) embryons de poisson zèbre gl22 (DE) à 28 HPF. (A) superposition d'image stéréo-fluorescence et à champ clair montrant la diffusion de S. typhimurium dans la circulation sanguine à 2 hpi (Leica MZ16FA microscope avec Leica DFC420C caméra). (Colombie-Britannique) confocale Z-stack projections montrant rouge S. bactéries typhimurium phagocytées par des macrophages verts à 2 hpi (Leica TCS SPE, HCX objectif 40x APO 0,8 NA). Les bactéries qui sont encore extracellulaire peut également être observée. (D) confocale z-stack de projection montrant un agrégat granulome-comme contenant M. macrophages marinum Mma20-infectés et non infectés à 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40×0,8 NA). Les macrophages et les bactéries en vert en rouge. (E) confocale z-stack projection d'un macrophage individuelle (vert) avec M. intracellulaire bactéries marinum (rouge). La zone représentée en D par le rectangle blanc a été imagées avec un objectif plus fort grossissement (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1,2 NA). Scalebars: 20 pm. Figure 4. Des itinéraires alternatifs pour l'infection d'embryons de poisson zèbre. (A) mCherry marqué M. marinum Mma20 bactéries ont été injectés dans le ventricule du cerveau postérieur au 32 HPF. Fluorescence et superposition d'image transmission montrant des bactéries mCherry-étiquetés phagocytées par des macrophages à 5 hpi (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0,7 NA). (B) S. typhimurium a été injecté dans le muscle queue à 1 dpf. Attraction des cellules myéloïdes au site d'injection (cercle blanc) est montré à 3 hpi par fluorescent hybridation in situ en 4, (C), tandis que dans les embryons non-injecté, il ya normalement pas de cellules myéloïdes à ce site morphologique. Bien que les embryons ne contiennent pas de neutrophiles matures à ce stade, deux populations de cellules myéloïdes peuvent être distingués, l'un exprimant le marqueur de macrophages mfap4 (rouge) et un exprimant le marqueur de neutrophiles megapixels (vert) (Leica TCS SPE, HC PL Fluotar 10.0x 0,3 NA). Fluorescence des bactéries est perdue après la procédure en hybridation in situ. (D) Ds-ROUGE marqué S. bactéries typhimurium ont été injectés dans la vésicule otique de Tg (mpx: EGFP) I114 poisson-zèbre à 2 dpf. Superposer des images stéréo-fluorescence et lumineux champ montrent que megapixels: EGFP cellules marquées neutrophiles sont attirés par la vésicule otique infectée (en pointillés ellipse) à 3 hpi, (E) alors que l'injection de contrôle de PBS dans la vésicule otique de Tg (mpx: EGFP ) I114 le poisson-zèbre ne montre pas l'attraction des neutrophiles à l'ai infecté otiquesicle (en pointillés ellipse) (Leica MZ16FA avec Leica DFC420C caméra). (F) mCherry marqué M. bactéries marinum de la eccCb1 atténué E11 :: tn souche mutante 17 ont été injectés dans la notochorde à 1 dpf. Prolifération à l'intérieur de la notocorde a été imagée à 5 dpi (Leica MZ16FA microscope avec DC500 appareil photo). (G) mCherry marqué M. marinum bactéries E11 ont été injectés dans le jaune de 16 cellules embryons de poisson zèbre en scène de la Tg (fli1a: EGFP) ligne qui exprime la GFP dans les cellules endothéliales de vaisseaux sanguins et lymphatiques. Formation d'un granulome-comme des agrégats de cellules infectées dans la région caudale est observée à 5 dpi (microscope Leica MZ16FA avec Leica DFC420C caméra; l'image de 8).