1. הכן מחטים בהזרקה הכן בורוסיליקט microcapillary זכוכית הזרקת מחטים (הרווארד Apparatus, 300038, 1 מ"מ OD × 0.78 מזהה מ"מ) באמצעות מכשיר חולץ micropipette (סאטר מכשירים בע"מ, לוהטים / בראון p-97 עם ההגדרות הבאות עבור עצה יותר: לחץ אוויר 400; חום 610, משיכה 40, מהירות 50, 30 ו הזמן עם ההגדרות הבאות עבור טיפ קצר: לחץ האוויר 500, חום 510, משיכה 100, מהירות 200, הפעם 60). לנתק את קצה המחט עם פינצטה בסדר לקבל עצה הפתיחה בקוטר של 5-10 מיקרומטר. מומלץ שפוע קצה המחט הפתיחה של 45 מעלות זווית microgrinder (Narishige בע"מ, EG-400) להניב עצה חדה יותר. זה יקל על ניקוב שכבת אפידרמיס ובכך לגרום זריקות לשחזור נוספים עם נזק לרקמות פחות עם מחטים קהים. מחטים שקצהו כבר עדיפים על וריד הזנב (שלב 5) ו Duct של קיביה (שלב 6.1) זריקות ומחטים שקצהו קצריםהם העדיפו את הזרקת פרוטוקולים אחרים (צעדים 6.2-6.6). 2. הכינו ש ' typhimurium הבידוד צלחת את ס ' typhimurium מ -80 המניות גליצרול C ° על צלחות אגר ליברות (באמצעות אנטיביוטיקה המתאימה כדי לסמן את דרכי הביטוי הקרינה) ו דגירה לילה ב 37 ° C. בחר מושבות חיוביות fluorescently בודדים resuspend אותם לריכוז הרצוי (ראה פרוטוקולים 5 ו -6) ב סטרילית פוספט בופר סליין (PBS), אופציונלי המכיל 0.085% (V / V) פנול אדום (Sigma-Aldrich) לסייע ויזואליזציה של תהליך ההזרקה. להשתמש ישירות על השעיית טרי להזרקה או להכין מלאי וגליצרול. להכין מלאי וגליצרול, ספין למטה המניות הזרקת טריים עם הריכוז הרצוי של חיידקים ולהתרכז המניות על ידי resuspending גלולה בנפח 1/2 החל גליצרול סטרילית (V / V) 20% (Sigma-Aldrich) ב PBS. אחסן את המניה ב -8 גליצרול0 ° C. לדלל את המניות גליצרול 1:1 (V / V) לפני הזריקה ב סטרילית PBS, לחלופין המכילה פנול אדום 0.17%. המערבולת ההשעיה חיידקי גם להימנע clumping. טען את הבידוד לתוך מחט microcapillary משתמש קצה microloader (Eppendorf, 5242956.003). בשל גודל גדול יחסית של ס ' חיידקים typhimurium ו-DS אדום בוהק הקרינה שלהם כאשר באמצעות וקטור pGMDs3 הביטוי 3 (זן זמין על פי דרישה), תאים חיידקיים בודדים ניתן בקלות לספור עם סטראו הקרינה כדי לקבוע את מינון ההזרקה. לשם כך, להזריק 1 NL לתוך ירידה של PBS על צלחת אגר, לספור את החיידקים ניאון, ולחשב את נפח ההזרקה הדרוש כדי להשיג את המינון הרצוי חיידקי (רצוי לשמור את עוצמת הזריקה בין 1-2 NL). להזריק את העוברים עם ס ' typhimurium דרך כביש שנבחר (ראה פרוטוקולים 5 ו – 6). 3. להכין <eמ> מ ' marinum הבידוד שמור מ marinum המתח הגובר על אגר Difco 7H10 מידלברוק (BD החברה) השלימו עם אולאית 10% חומצה אלבומין דקסטרוז, catalase (OADC, BD החברה), גליצרול 0.5%, ועם אנטיביוטיקה המתאימה כדי לסמן את דרכי הביטוי הקרינה (זנים זמין לפי בקשה 9), אז תמיד יש מלאי חדש. בחר מושבה של מ ' marinum ו resuspend אותו Difco מידלברוק 7H9 מרק (BD החברה) השלימו עם 10% אלבומין דקסטרוז, catalase (ADC, BD החברה) ו – 0.05% Tween 80 (Sigma-Aldrich) לבין טיפול אנטיביוטי מתאים. בדוק כי צפיפות אופטית (OD) ב 600 ננומטר הוא 0.2-0.3 ולתת לו לגדול בין לילה באופן סטטי על 28.5 ° C. זמן הדור של מ ' marinum הוא כ 4-6 שעות, משתנה בהתאם לזן. למדוד את OD ב 600 ננומטר שוב ביום זריקות. OD600 של 1 מתאים כ 10 8 מ ' marinum / mL(זה עשוי להשתנות על פי זן חיידקי בשימוש, וכך צריך להיות מבוסס על עקומת הצמיחה של זן מסוים). לקצור את החיידקים כשהם בשלב לוגריתמי (לא נותנים OD600 יעלה 1.00) על ידי צנטריפוגה כביסה אותם שלוש פעמים PBS סטרילית. למדוד את OD600 שוב ההשעיה החיידקים PBS, ספין למטה, resuspend החיידקים לריכוז הרצוי (ראה פרוטוקולים 5 ו -6) ב PBS או Polyvinylpyrrolidone 2% (PVP40) ב PBS (W / V), אשר משפר את ההומוגניות ההשעיה של חיידקים. פנול אדום (Sigma-Aldrich) ניתן להוסיף בריכוז של 0.085% כדי לסייע להדמיה של תהליך ההזרקה. להשתמש ישירות על השעיית טרי להזרקה או להכין מלאי וגליצרול. להכין מלאי וגליצרול לסובב את המניות הזרקת טריים עם הריכוז הרצוי של חיידקים ולהתרכז המניות על ידי resuspending גלולה בנפח 1/2 החל גליצרול 20% סטרילי ב PBS. אחסן את glycארול המניה ב -80 ° C. לדלל את המניות גליצרול 1:1 (V / V) ב סטרילית PBS, לחלופין המכיל 4% PVP40 ו / או 0.17% פנול אדום. 4. עוברים להכין דג הזברה זריקות הגדרת זוגות רבייה דג הזברה ולאסוף עוברים כפי שמוצג במאמר אחר וידאו 10. שמור עוברים בצלחת פטרי מלא מים ביצה (60 מיקרוגרם / מ"ל מלחי ים,. ע"א 60 / עוברים צלחת) ו – דגירה על 28.5 ° C. במידת הצורך, להוסיף 0.003% N-Phenylthiourea (PTU, Sigma-Aldrich) למים ביצה כאשר הם עוברים כ 12 hpf למנוע melanization. בסביבות 24 שעות שלאחר ההפריה (hpf), dechorionate את העוברים עם פינצטה פיין (פיין המדע כלים בע"מ, דומונט # 5 מלקחיים – ביולוגיה Inox. שמור את העוברים בצלחת פטרי מלא מים ביצה בשכבת agarose 1% למטה כדי למנוע עוברים להידבק למשטח הפלסטיק. להרדים את העוברים עם 200 מיקרוגרם / מ"ל שנאגרו 3Aminobenzoic-acid (Tricaine, Sigma-Aldrich) כ 10 דקות לפני זריקות. 5. הזרקה תוך ורידית של חיידקים לתוך יום אחד עוברים הישנים לביים את העוברים על 28 hpf 11 על ידי בדיקת זרימת הדם עולה בקנה אחד, לתחילת פיגמנטציה בעיניים, זנב ישר, הלב להיות ממוקם רק ventrally לעין. להרדים את העוברים, ראה שלב 4.5. טען את מחט עם הבידוד חיידקי באמצעות עצה microloader. הר מחט הועמסו על micromanipulator (כלי סאטר, MM-33) המחובר לעמוד (מכשירי דיוק העולם, מעמד מגנטי M10L) ומקם אותה תחת מיקרוסקופ סטריאופוני (לייקה M50, achromat 1x 0,15 אובייקטיבי NA, בסיס אור מסור TL ST). קבע את הזמן כדי הזרקה של 0.2 והלחץ פיצויים 15 hPa (Eppendorf, Femtojet). התאם את הלחץ הזרקת בין 700 לבין 900 hPa להשיג נפח הזריקה הנכונה מחטבשימוש. להתאים את גודל טיפה כדי להתאים את הקוטר הרצוי בעזרת סרגל קנה המידה על שקופיות מיקרוסקופ או עינית. לקביעת גודל טיפה יהיה ניתן להזריק לתוך שמן מינרלי בשקופית מיקרוסקופ, או את גודל ניתן להעריך על ידי הזרקת באוויר, מה שמשאיר את הירידה תלויה על קצה המחט. רדיוס ירידה של 1 NL הוא 0.062 מ"מ (V = 4/3 π r 3). הגדר את micromanipulator עם מחט טעון אל המיקום הנכון לפני הזרקת (כלומר כ בזווית של ° 45 ביחס לפני השטח את הצלחת הזריקה) ורק להעביר אותו קדימה ואחורה כדי להזריק. עוברים את הרדים הם pipetted על צלחת שטוחה agarose 1% הזרקת מים ביצה עודף מוסר, המאפשר מתח הפנים לקיים את העוברים במקום במהלך זריקות. שימוש בלולאה שיער הכלי (איור 2) כדי ליישר את העוברים. אוריינט הצלחת הזריקה ביד במהלך זריקות למקם את העוברים לתנוחה המועדפת inserting, כלומר המחט עם זנבותיהם והצביע לעבר קצה המחט. הנח את קצה המחט מעל קרוב וריד הזנב לפתיחת המין ודרכי השתן (איור 1 א '), פירס periderm עם קצה המחט להזריק את המינון הרצוי של חיידקים, אנו משתמשים CA. 250 CFU ש ' typhimurium בטבע סוג (WT) מתח SL1027, המכיל את הביטוי DS-RED וקטור pGMDs3, ו CA. 120 CFU של מ ' marinum זן Mma20. ההשעיה חיידקי מוזרק יעברו את זרימת הדם דרך וריד הזנב לכיוון הלב. לפקח אם הזריקה בוצעה כראוי על ידי בדיקת היקף הרחבת מערכת כלי הדם מיד לאחר הדופק 2. עבור מנה תגובה ניסויים, 2-3 זריקות רצופות יכול להתבצע ללא חילוץ המחט. לעתים קרובות לבדוק את עוצמת הזריקה נשאר זהה במהלך הניסוי. כדי לספק שליטה על עקביות של זריקות במהלך הניסוי, מזריקים DROעמ 'של חיידקים ישירות ירידה PBS סטרילית על מצע התפתחות חיידקים לאחר ההזרקה כל העובר כ 30 ה. צלחת את זה טיפה ולספור את מושבות חיידקים לאחר הדגירה כדי לקבוע את יחידות המושבה להרכיב (CFU) בנפח ההזרקה. השתמש סטראו הקרינה (פרוטוקול 7) לצפות הפרט ניאון ס תאים typhimurium במחזור הדם מיד לאחר ההזרקה, וזורקים עוברים שלא מוזרקים כמו שצריך. הפרט ניאון מ ' חיידקים marinum לא ניתן לראות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו מיד לאחר זריקות, אבל אגרגטים ניאון של תאים נגועים צריך להיות גלוי על ידי זיהום ימים 2 הודעה (dpi) לגדול עם הזמן. 6. דרכים חלופיות של זיהום צינור של הזרקת קיביה: בשורה עוברים הרדים (2-3 DPF) על צלחת שטוחה agarose 1% הזרקת זריקות כמו וריד הזנב (ראה 5.6). אוריינט להזריקיון צלחת ביד במהלך זריקות למקם את העוברים לתנוחה המועדפת עבור החדרת המחט, כלומר באלכסון תחת 45 מעלות זווית כך את צינור של קיביה ניתן לגשת על ידי קצה המחט מהצד הגבי של העובר (איור 1 ב) . הכנס את המחט לנקודת ההתחלה של צינור של קיביה הגבי רק למיקום בו צינור מתחיל להרחיב את שק החלמון ואת להזרים 100-200 חיידקים (NL 1-3). הזריקה היא נכונה אם נפח בתוך צינור מתרחב מיד לאחר הדופק ואת שק החלמון לא מקרע. לגבי הזרקות וריד הזנב (ראו 5.7), זריקות רצופות יכול להתבצע ללא חילוץ המחט. החדר הזרקת למוח האחורי: בשורה עוברים הרדים (32 hpf) על צלחת שטוחה agarose 1% הזרקת כך את עוברי ממוקמים בצד הגבי שלהם לכיוון קצה המחט. הכנס את המחט אל תוך החדר למוח האחורי מהעמדה הקדמית בלי לגעת neuroepithelium (איור 1 ג) ו – 20-100 להזריק חיידקים (0.5-1 NL). כדי לתרגל את הנוהל, השתמש צבע פלואורסצנטי (כמו טקסס אדום dextran) כפי שמוצג במאמר אחר וידאו 13. שרירים הזרקת זנב: עוברים עמדה הרדים (1-2 DPF) באשר זריקות וריד הזנב (ראה 5.6). התאם micromanipulator עם מחט טעון לזווית של כ 65 מעלות ביחס לפני השטח את הצלחת ההזרקה. להזריק תרחיף חיידקי (0.5-1 NL) המכיל 20-50 CFU לתוך השריר מעל לפתח המין ודרכי השתן (איור 1D) ללא גרימת נזק notochord או כלי דם. הזרקת שלפוחית Otic: עוברים עמדה הרדים (2-3 DPF) כמו זריקות וריד הזנב (ראה 5.6). התאם micromanipulator עם מחט טעון לזווית של כ 65 מעלות ביחס לפני השטח את הצלחת ההזרקה. להזריק כ 20 חיידקים (0.5 NL) לתוך שלפוחית otic (איור 1E) עם לחץ נמוךיור למנוע קרע ברקמה המקומית. הזרקת Notochord: בשורה עוברים הרדים (1-2 DPF) על צלחת שטוחה agarose 1% הזרקת כך את עוברי מוצבים עם הזנב שלהם מצביע הרחק בקצה המחט. הכנס את המחט דרך רקמת השריר לתוך הזנב notochord (איור 1F) ו להזריק כ 20-50 חיידקים (מקסימלי 0.5 NL). יש להיזהר לא להזריק נפח גדול מדי, כדי למנוע קרע notochord. חלמון הזרקה: מיקום ביצים המכילות עוברים בשלב 16-1000 התא על צלחת agarose 1% הזרקת עם ערוצי מלבניים או בצורת V עשה עם עובש ערוץ 12 או באופן מקוון http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . פירס את המחט דרך סיסית למרכז חלמון (איור 1G) ו להזריק חיידקים 20-40 (1-2 NL). השימוש בפתרון PVP40 המוביל 2% עבור ההשעיה חיידקי (ראה שלב 3.5)חשוב למנוע התפשטות חיידקים מוקדם לעובר. 7. הדמיה סטריאו הזיהום להרדים את בעוברים נגועים ב 1% צלחת פטרי agarose שכבות מכוסה מים הביצה המכיל Tricaine (ראה 4.5). יישר את העוברים במקום הנכון הדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו עם כלי השיער לולאה (איור 2). לפני בשלפוחית השחייה לא מנופחים (1-5 DPF), העוברים יהיה לשכב על צדם המאפשר הדמיה תצוגה לרוחב. אם עמדה שונה צפה לרוחב הנדרש, לעלות את העוברים על מתיל תאית 1.5%. לתפעל את העובר לתנוחה הרצויה עם כלי השיער לולאה (איור 2). להחזיר את העוברים למים ביצה לאחר ההדמיה. 8. הדמיה confocal הזיהום מניחים ירידה של טמפ 'התכה נמוכה agarose (Lonza בע"מ, 1.5% (W / V) במים ביצה) בתחתית כוסWillCo, צלחת (WillCo וולס, GWSt-5040) אם מיקרוסקופ confocal הפוכה נעשה שימוש, או על שקופית אחת דיכאון חלל (אגר מדעי, L4090) אם מיקרוסקופ confocal זקוף משמש. מניחים את העובר הרדים את הירידה agarose עם כמות מוגבלת של מים ביצה ולטפל עובר למצב עם כלי השיער לולאה (איור 2). בעת שימוש במיקרוסקופ הפוכה חשוב באזור של העובר עניין היא שטוחה על קרקעית כוס צלחת הדמיה. מיקרוסקופ זקוף יכול לשמש בשילוב עם טבילה במים או מטרות למרחקים ארוכים ויבשים העובר יש למקם כך את האזור של עניין הוא קרוב למטרה ככל האפשר. בואו agarose לגבש לצלול ירידה agarose במים הביצה המכיל Tricaine (ראה 4.5). אם מיקרוסקופ זקוף משמש, הצב מכסה זכוכית להחליק על גבי חלל דיכאון (לא מאפשרים ליצור בועות אוויר). ברצף לרכוש שפעתorescence ותמונות הילוכים. מוציאים בזהירות את agarose מעובר עם פינצטה דקים ומניחים את העובר חזרה למים ביצה, אם יש צורך בניסויים נוספים. 9. נציג תוצאות הזרקה של סלמונלה או typhimurium Mycobacterium חיידקים marinum אל האי דם של עוברים ב 1 תוצאות DPF ב phagocytosis מהירה של מקרופאגים. הגן MPEG1 לאחרונה זוהה הסמן נאמן של מקרופאגים עובריים, colocalizing עם ומבוססת מקרופאג סמן csf1r (FMS) ולא חופפים עם סמנים נויטרופילים כמו MPX (MPO) ו lyz 4, 14. הדמיה חיה של phagocytosis חיידקי השתמשנו בקווים מהונדס שבו היזם MPEG1 כונני ביטוי חלבון פלואורסצנטי ב מקרופאגים 14. שורות אלה מהונדס או שיש F MPEG1 האמרגןבשימוש ישירות בגן ה-GFP, או מעסיקים מערכת דו רכיבי שבו היזם MPEG1 מניע ביטוי של גורם שעתוק Gal4 שמרים המפעיל transgene 2 עם רצף ההכרה Gal4 (כטב"מ, במעלה הזרם הפעלת רצף) התמזגו לגן קאךה. כאשר האי הזרקת דם (פרוטוקול 5, איור 1 א) נעשה בצורה נכונה, החיידקים מיד לזרום דרך מחזור הדם להתפשט בכל העובר. הפצת גדול יחסית בהיר ניאון DS-RED ס שכותרתו חיידקים typhimurium ניתן הדמיה ישירות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו (איור 3 א), הדמיה confocal ב 2 הופעות HPI כי חיידקים רבים phagocytosed ידי מקרופאגים ניאון (איור 3 ב-C). הזרקת CFU קטנה כמו 25 מסוג ס בר חיידקים typhimurium תגרום לזיהום קטלני, בעוד מנה דומה של חיידקים של של לא אליםהרכבת, כמו Ra, ניתן לפנות על ידי 3 מערכת החיסון העוברי. מינון הזרקת 250 CFU שימש כדי לקבוע התגובות תעתיק את ס ' זיהום typhimurium העובר דג הזברה, והמחיש את הגיוס של תגובה חזקה הגן הפרו דלקתי ביטוי 15. לעומת זאת, הזרקה תוך ורידית של מ ' marinum חיידקים לא לעורר תגובה חריפה הפרו דלקתי, אך מובילה לזיהום מתמשך שבו מקרופאגים נגועים ליצור אגרגטים צפופים שנחשבים בשלבים הראשונים של גרנולומות, שהן סימן ההיכר של שחפת 2. הדמיה confocal של צבירה כגון גרנולומה כמו ב Tg (MPEG1: EGFP) gl22 קו 14 בשעה 5 dpi מראה צמיחה תאיים של mCherry שכותרתו מ ' חיידקים marinum בתוך מקרופאגים פלואורסצנטי ירוק (איור 3D-E). OTהמסלולים שלה זיהום שימושיים למטרות שונות. חיידקים ניתן להזריק לתוך החדר למוח האחורי ב 32 hpf (איור 1 ג), שהוא תא ללא מקרופאגים. זריקה של 20-100 mCherry שכותרתו מ ' חיידקים marinum לתוך תא זה מוביל חדירה מהירה של מקרופאגים כי phagocytose את החיידקים (איור 4 א). שיטה נוספת ללמוד הגירה מכוונת של תאים חיסוניים מולדים היא הזרקה של חיידקים לתוך השריר הזנב (1D איור). עם זאת, זריקות זנב שרירים גם לגרום נזק לרקמות זה כשלעצמו מעורר כמה המשיכה של כדוריות דם לבנות. תגובה כזו פציעה ניתן להימנע כאשר בזהירות הזרקת נפח קטן (0.5-1 NL) לתוך שלפוחית otic (איור 1E). כפי שמוצג כאן על ידי שימוש Tg (MPX: EGFP) i114 קו 16, הזרקה של CFU כ 20 ש ' typhimurium לתוך שלפוחית otic גורם משיכה של נויטרופילים ב 3 HPI ( <strong> איור 4D), ואילו את התגובה הזאת לא נצפתה PBS השליטה זריקות (4E איור). Notochord, אשר נראה עמיד בפני חדירה של כדוריות דם לבנות, הוא תא מתירנית לצמיחה של מ ' marinum מוטציות כי הם נחלש מאוד כאשר הוא מוזרק ברקמות אחרות: 7 (איור 4F). לבסוף, הזרקת מוקדם של מ ' marinum בחלמון של עוברים מספק שיטה חלופית להשיג זיהום מערכתי. בדרך כלל אנחנו מבצעים את זריקות סביב הבמה 16 תאים (איור 1G), אבל זריקות חיידקים לתוך החלמון יכולה גם להתבצע בשלבים מאוחרים יותר (עד 1000 בשלב התא), או מוקדם יותר (1-8 בשלב התא) על שיתוף זריקות עם morpholinos 8. החלמון בעקבות הזרקת מינון של CFU 20-40, מ ' חיידקים marinum על פני מספר ימים לתוך הרקמות עובריים גרנולומה כמו אגרגטים טפסים דומים לאלה שנצפו על קונבנציונליתהזרקה תוך ורידית שיטה 8: (4G איור). שיטת הזרקת החלמון אינו מתאים ש זיהום typhimurium, כי הצמיחה המהירה שלה החלמון גורם הקטלניות מוקדם. שיטת ההדבקה חלמון של מ ' זיהום marinum יהיה שימושי עבור תפוקה גבוהה יישומים שכן הוא יכול להיות אוטומטי באמצעות רובוט הזרקת 8. באיור 1. זריקות תוך ורידי סקירה כללית של שיטות הזרקת המשמשים לקביעת זיהומים סיסטמיים או מקומיים עוברי דג הזברה. (AB) לקביעת זיהום מערכתי מהיר מבוצעות לווריד הזנב לאי הדם האחורי ב DPF 1 (א) או לתוך צינור של קיביה ב 2-3 DPF (ב '). (CE) זריקות מקומיות ללימוד מקרופאג ו chemotaxis נויטרופילים מבוצעים לתוך החדר למוח האחורי ב DPF 1 (ג), שרירי הזנב ב DPF 1-2 (D) או שלפוחית otic ב DPF 2-3 (ה). (ו) זריקות כדי ליצור זיהום נגיש ככל הנראה phagocytes מבוצעות תוך notochord ב DPF 1-2. (ז) זריקות כדי ליצור זיהום מערכתי מוקדם עם חיידקים הגדלים לאט, כמו מ ' marinum יכול להתבצע לתוך החלמון בשלב 16-1000 התא. כל התמונות צולמו עם M165C לייקה, PLANAPO 1.0x מחוברת המצלמה Leica DFC420 (לייקה 10446307 0.8x). איור 2. לולאת שיער הכלי. חתיכה של שיער אדם מוכנס כמו לולאה לתוך הפתח של פיפטה פסטר קבוע במקום עם דבק סופר או עם טיפ-Ex. זה מספק כלי נוח לתמרן בעדינות עוברי דג הזברה שבירים. איור 3. זריקות תוך ורידי שלאדום ניאון סלמונלה typhimurium ו Mycobacterium marinum. DS-RED-שכותרתו ס typhimurium SL1027 חיידקים (AC) ו-mCherry שכותרתו מ ' marinum Mma20 חיידקים (DE) הוזרקו האי דם Tg (MPEG1: Gal4-VP16) gl24, Tg (כטב"מ-E1b: קאךה) s1999t (AC) או Tg (MPEG1: EGFP) gl22 (DE) עוברי דג הזברה ב 28 hpf. () שכבה של תמונה סטריאו פלואורסצנציה ובהיר שדה מראה הפצת ס typhimurium במחזור הדם 2 HPI (לייקה מיקרוסקופ MZ16FA עם לייקה DFC420C המצלמה). (לפני הספירה) confocal Z-מחסנית התחזיות מראה אדום ס חיידקים typhimurium phagocytosed ידי מקרופאגים ירוקים ב 2 HPI (לייקה TCS SPE, HCX המטרה APO 40X 0.8 NA). חיידקים, כי הם עדיין תאי יכול להיות גם ציין. (ד) Confocal Z-מחסנית התחזית מראה המצרפי גרנולומה דמוי המכיל מ marinum מקרופאגים Mma20-נגועים נגוע ב 5 dpi (לייקה TCS SPE, HCX APO 40X0.8 NA). מקרופאגים בירוק וחיידקים באדום. (ה) Confocal Z-מחסנית השלכה של מקרופאג הפרט (ירוק) עם מ 'תאיים marinum חיידקים (אדום). השטח המתואר על ידי D מלבן לבן צילמו במטרה בהגדלה גבוהה יותר (לייקה TCS SPE, HCX PL APO 63x 1.2 NA). Scalebars: 20 מיקרומטר. באיור 4. מסלולים חלופיים עבור זיהום של עוברי דג הזברה. () MCherry שכותרתו יג marinum Mma20 חיידקים הוזרקו החדר למוח האחורי ב hpf 32. הקרינה ואת כיסוי שידור התמונה מראה חיידקים mCherry שכותרתו phagocytosed ידי מקרופאגים ב 5 HPI (לייקה TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0.7 NA). (ב) ס typhimurium שהוזרק לתוך השריר הזנב ב DPF 1. משיכה של תאים מיאלואידית באתר ההזרקה (לבן מעגל) מוצג ב 3 HPI על ידי Fluorescent ב הכלאה באתרו 4, (ג) ואילו עוברים uninjected יש בדרך כלל לא התאים מיאלואידית באתר זה מורפולוגי. למרות העוברים אינם מכילים נויטרופילים בשלים בשלב זה, שתי אוכלוסיות של תאים מיאלואידית ניתן להבחין, אחד להביע את הסמן מקרופאג mfap4 (אדום) ואחד להביע את הסמן נויטרופילים MPX (ירוק) (לייקה TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10.0x 0.3 NA). הקרינה של החיידק אובד אחרי בהליך ההכלאה באתרה. (ד) DS-RED-שכותרתו ש ' חיידקים typhimurium הוזרקו שלפוחית otic של Tg (MPX: EGFP) i114 דג הזברה ב DPF 2. התמונות כיסוי סטריאו פלואורסצנציה ובהיר שדה עולה כי MPX: EGFP התאים המסומנים נויטרופילים נמשכים שלפוחית otic נגוע (אליפסה מנוקד) בשעה 3 HPI, (E) ואילו הזרקת השליטה PBS לתוך שלפוחית otic של Tg (MPX: EGFP ) i114 דג הזברה לא מראה משיכה של נויטרופילים ל יש otic נגועsicle (אליפסה מנוקד) (לייקה MZ16FA עם מצלמה DFC420C לייקה). (ו) mCherry שכותרתו מ ' חיידקים marinum של E11 נחלש eccCb1 :: TN זן מוטנטי 17 הוזרקו notochord ב DPF 1. ריבוי בתוך notochord היה צילמו בשעה 5 dpi (לייקה מיקרוסקופ MZ16FA עם מצלמה DC500). (ז) mCherry שכותרתו מ ' marinum חיידקים E11 הוזרקו חלמון של 16 תאים דג הזברה עוברים שלב של Tg (fli1a: EGFP) קו המבטא GFP בתאים אנדותל של כלי הדם, הלימפה. היווצרות גרנולומה כמו אגרגטים של תאים נגועים באזור הזנב הוא ציין ב 5 dpi (מיקרוסקופ MZ16FA לייקה עם מצלמה DFC420C Leica, תמונה 8).