1. Förbered Injektionsnålar Förbered borosilikatglas mikrokapillär injektionsnålar (Harvard Apparatus, 300.038, 1 mm OD x 0,78 mm ID) med en mikropipett avdragare enhet (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brun p-97 med följande inställningar för en längre tips: lufttrycket 400; värme 610, pull 40, hastigheten 50, tiden 30 och med följande inställningar för en kortare tips: Lufttrycket 500, värme 510, pull 100, hastigheten 200, tid 60). Bryt av nålspetsen med fina pincett för att få en diameter spets öppning av 5-10 nm. Det är tillrådligt att avfasningen nålspetsen öppningen vid 45 graders vinkel med en microgrinder (Narishige Inc., EG-400) för att ge en skarpare spets. Detta kommer att underlätta punktera epidermal lagret och därmed resultera i fler reproducerbara injektioner med mindre vävnadsskador än med trubbiga nålar. Längre spets nålar är föredragna för kaudalvenen (steg 5) och kanalen hos Cuvier (steg 6.1) injektioner och kortare spets nålarföredras för de andra injektion-protokoll (steg 6.2-6.6). 2. Framställ S. typhimurium Inokulat Plate ut S. typhimurium från en -80 ° C glycerolförråd på LB-agarplattor (med lämpliga antibiotika för att selektera för fluorescens expressionsvektorer) och inkubera över natten vid 37 ° C. Plocka enskilda fluorescerande positiva kolonier och återsuspendera dem till den önskade koncentrationen (se protokollen 5 och 6) i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), eventuellt innehållande 0,085% (volym / volym) fenol röd (Sigma-Aldrich) för att underlätta visualisering av injektionsprocessen. Direkt använda färsk suspension för injektion eller förbereda glycerolstamlösningar. För att framställa glycerolstamlösningar, centrifugera ner den nygjorda injektion lager med önskad koncentration av bakterier och koncentrera mälden genom att återsuspendera pelleten i halva volymen med början i steril 20% (volym / volym) glycerol (Sigma-Aldrich) i PBS. Förvara glycerol beståndet vid -80 ° C. Späd 1:1-glycerolförråd (volym / volym) före injektion i steril PBS, eventuellt innehållande 0,17% fenolrött. Vortex bakteriesuspensionen väl för att undvika klumpbildning. Fyll på inokulatet i mikrokapillär nålen med hjälp av en microloader spets (Eppendorf, 5242956,003). Grund av den relativt stora storleken hos S. typhimurium bakterier och deras ljusa Ds-RED fluorescens när du använder pGMDs3 expressionsvektom 3 (stam fås på begäran), kan enskilda bakterieceller lätt räknas med en fluorescens stereomikroskop för att ställa injektionen dosen. För detta ändamål, injicera 1 nL in i en droppe PBS på en agarplatta, räkna fluorescerande bakterier och beräkna injektionsvolymen som krävs för att uppnå den önskade bakteriella dosen (helst hålla injektionsvolymen mellan 1-2 NL). Injicera embryona med S. typhimurium via den valda rutten (se protokoll 5 och 6). 3. Framställ <em> M. marinum Inokulat Håll M. Marinum stam växer på Difco Middlebrook 7H10-agar (BD och bolag) kompletterat med 10% oljesyra-albumin-dextros-katalas (OADC, BD och bolag), 0,5% glycerol och med lämpliga antibiotika för att selektera för fluorescens expressionsvektorer (stammar tillgängliga på begäran 9), så finns det alltid en nygjord stamlösning. Välj en koloni av M. Marinum och återsuspendera det i Difco Middlebrook 7H9 buljong (BD och bolag) kompletterat med 10% albumin-dextros-katalas (ADC, BD och bolag) och 0,05% Tween 80 (Sigma-Aldrich) och lämpliga antibiotika. Kontrollera att den optiska densiteten (OD) vid 600 nm är 0,2 – 0,3 och låta det växa statiskt natt vid 28,5 ° C. Den generation tid M. Marinum är cirka 4-6 h, varierar beroende på stammen. Mäta OD vid 600 nm på nytt på samma dag som injektioner. En OD600 på 1 motsvarar cirka 10 8 M. marinum / ml(Detta kan variera beroende på den bakteriella stammen som används och således bör baseras på en tillväxtkurva för den speciella stam). Skörda bakterierna när de är i logaritmisk fas (låt inte OD600 överstiger 1,00) genom centrifugering och tvätta dem tre gånger i sterilt PBS. Mäta OD600 igen av den bakteriella suspensionen i PBS, centrifugera ner, och återsuspendera bakterier till den önskade koncentrationen (se protokollen 5 och 6) i PBS eller i 2% polyvinylpyrrolidon (PVP40) i PBS (vikt / volym), vilket förbättrar homogeniteten av den bakteriella suspensionen. Fenolrött (Sigma-Aldrich) kan tillsättas till en koncentration av 0,085% för att hjälpa till visualisering av insprutningsprocessen. Direkt använda färsk suspension för injektion eller förbereda glycerolstamlösningar. För att framställa glycerolstamlösningar spinna ned nygjord injektion lager med önskad koncentration av bakterier och koncentrera mälden genom att återsuspendera pelleten i halva volymen med början i steril 20% glycerol i PBS. Förvara GlycErol lager vid -80 ° C. Späd 1:1-glycerolförråd (volym / volym) i sterilt PBS, eventuellt innehållande 4% PVP40 och / eller 0,17% fenolrött. 4. Förbered zebrafiskembryon för injektionsvätskor Ställ in zebrafisk häckande par och samla embryon som visas i en annan video artikel 10. Hålla embryon i en petriskål fylld med ägg vatten (60 | ig / ml havssalter;. Ca 60 embryon per skål) och inkubera vid 28,5 ° C. Om så erfordras, tillsätt 0,003% N-fenyltiokarbamid (PTU, Sigma-Aldrich) till ägget vatten när embryona är ungefär 12 hpf att förhindra melaninnivå. Runt 24 timmar efter befruktning (HPF), dechorionate embryona med fina pincetter (Fine Science Tools Inc., Dumont # 5 Tång – Inox biologi. Hålla embryona i en petriskål fylld med ägg vatten och med ett skikt av 1% agaros i botten för att förhindra embryon från att fastna vid plastytan. Bedöva embryona med 200 pg / ml buffrad 3-Aminobensoesyra (trikain, Sigma-Aldrich) ca 10 min före injektion. 5. Intravenös injektion av bakterier in i en dag gamla embryon Steg embryona vid 28 HPF 11 genom att kontrollera för konsekvent blodcirkulation, i början av pigmentering i ögat, en rak svans, och hjärtat är placerad precis ventralt för ögat. Bedöva embryona, se steg 4,5. Ladda nålen med den bakteriella inokulum med användning av en microloader spets. Montera den laddade nålen på en mikromanipulator (Sutter Instrument, MM-33) är ansluten till en monter (World precisionsinstrument, M10L magnetiska stativ) och placera den under ett stereomikroskop (Leica M50, akromat 1x mål 0,15 NA, genomlysningsbas TL ST). Ställ in insprutningstiden till 0,2 s och den ersättning trycket till 15 hPa (Eppendorf, Femtojet). Justera insprutningstrycket mellan 700 och 900 hPa att erhålla den korrekta injektionsvolym för nålenanvändas. Justera droppstorlek för att matcha den önskade diametern med hjälp av en skala bar på ett objektglas eller i den okulära. För bestämning av storlek nedgången kan injiceras i mineralolja på ett objektglas, eller storlek kan uppskattas genom att injicera i luften, som lämnar droppen hänger på nålspetsen. Radien hos en droppe av en nL är 0,062 mm (V = 4/3 π r 3). Ställ in mikromanipulator med den laddade nålen i rätt läge före injektion (dvs. ungefär i 45 ° vinkel i förhållande till injektionen plåtytan) och bara flytta den fram och tillbaka för att injicera. De sövda embryon pipetteras på en platt 1% agaros injicering plattan och överskott ägg vatten avlägsnas, så att ytspänningen för att hålla de embryon på plats under injektioner. Använd ett verktyg håret slinga (figur 2) att rada upp embryon. Orientera injektion plattan för hand under injektioner för att placera embryona in den föredragna positionen för inserting nålen, dvs med svansen pekar mot nålspetsen. Placera nålspetsen precis ovanför den kaudala venen nära det urogenitala öppningen (figur 1 A), genomtränga periderm med nålspetsen och injicera den önskade dosen av bakterier, vi använder ca. 250 CFU S. typhimurium av vildtyp (wt)-stam SL1027, som innehåller Ds-RED expressionsvektor pGMDs3, och ca. 120 cfu av M. marinum-stam Mma20. Det injicerade bakteriesuspension följer blodflödet genom den kaudala venen mot hjärtat. Övervaka om injektionen utfördes korrekt, genom att kontrollera en expanderande volym av det vaskulära systemet direkt efter pulsen 2. För dos-respons försök kan 2-3 på varandra följande injektioner utföras utan att extrahera nålen. Ofta kontrollera att injektionen volymen förblir densamma under försöket. För att ge en kontroll för konsistens injektionerna under hela experimentet, injicera en DROp av bakterier direkt i en steril PBS droppe på bakterietillväxt mediet efter ungefär var 30: e embryo injektion. Plate ut denna droppe och räkna bakteriella kolonier efter inkubation för att bestämma kolonibildande enheter (cfu) i injektionsvolymen. Använd en fluorescens stereomikroskop (protokoll 7) att observera enskilda fluorescerande S. typhimurium-celler som cirkulerar i blodbanan direkt efter injektion, och kassera embryon som inte är ordentligt injiceras. Individuella fluorescerande M. marinum bakterier kan inte observeras med stereo fluorescensmikroskopi direkt efter injektioner, men fluorescerande aggregat av infekterade celler bör kunna synas med 2 dagar efter infektion (dpi) och växa sig större med tiden. 6. Alternativa smittvägar Kanal för Cuvier injektion: line up sövda embryon (2-3 DPF) på en plan 1% agaros injicera plattan som för kaudalvenen injektioner (se 5,6). Rikta in injicerajon plattan för hand under injektioner att placera embryona till önskad position för att föra in nålen, dvs diagonalt under en 45 ° vinkel så att kanalen för Cuvier kan kontaktas av nålspetsen från den dorsala sidan av embryot (Figur 1B) . Stick in nålen i utgångspunkten av kanalen i Cuvier precis dorsal till den plats där kanalen börjar bredda över gulesäcken och injicera 100-200 bakterier (1-3 NL). Injektionen är riktig om volymen i kanalen expanderar direkt efter pulsen och gulesäcken är inte brustit. När det gäller kaudalvenen injektioner (se 5,7), kan flera på varandra följande injektioner kan utföras utan att extrahera nålen. Bakhjäman kammare injektion: line up sövda embryon (32 HPF) på en plan 1% agarosgel injicera plattan så att embryona placeras med sina rygg-sida mot nålspetsen. Sätt nålen i bakhjäman kammaren från ett anterior position utan att röra neuroepithelium (Figur 1C) och injicera 20-100 bakterier (0.5-1 NL). För att öva förfarandet använder en fluorescerande färgämne (såsom Texas-Red dextran) som visas i en annan video artikel 13. Svans muskler injektion: ställning sövda embryon (1-2 DPF) som för kaudalvenen injektioner (se 5,6). Justera mikromanipulator med den laddade nålen till en vinkel av ungefär 65 ° med avseende på injektionen plåtytan. Injicera en bakteriesuspension (0.5-1 nL) innehållande från 20 till 50 ^ cfu i muskeln ovanför urogenitala öppningen (figur 1D) utan att orsaka skada på notokord eller blodkärl. Öron vesikelns injektion: ställning sövda embryon (2-3 DPF) som för kaudalvenen injektioner (se 5,6). Justera mikromanipulator med den laddade nålen till en vinkel av ungefär 65 ° med avseende på injektionen plåtytan. Injicera ca 20 bakterier (0,5 nL) i örat vesikeln (Figur 1E) med lågt tryckure att undvika lokal vävnad bristning. Notochord injektion: line up sövda embryon (1-2 DPF) på en plan 1% agarosgel injicera plattan så att embryona placeras med svansen pekar bort från nålspetsen. För in nålen genom svansen muskelvävnaden i notochord (Figur 1F) och injicera ca 20-50 bakterier (maximal 0,5 nL). Var noga med att inte injicera för mycket volym för att undvika bristningar i notochord. Gula injektion: ställning ägg innehåller embryon vid 16 till 1000 cellstadiet på en 1% agarosgel injicera platta med rektangulära eller V-formade kanaler görs med en kanal form 12 eller online på http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Stick hål på nålen genom chorion i mitten av äggulan (Figur 1G) och injicera 20-40 bakterier (1-2 NL). Användning av 2% PVP40 bärarlösning för den bakteriella suspensionen (se steg 3,5)är viktigt att förhindra tidigt bakteriell spridning i embryot. 7. Stereo Imaging av infektionen Bedöva de infekterade embryona i en 1% agarosgel lager Petriskål täckt med ägg vatten innehållande trikain (se 4,5). Rikta in embryon i rätt läge för avbildning under ett fluorescens stereo mikroskop med ett hårstrå loop verktyg (Figur 2). Innan simblåsan har uppblåsta (1-5 dpf) kommer embryona ligga platt på sina sidor så att sidovy avbildning. Om en annan position än den laterala uppfattning krävs montera embryon i 1,5% metylcellulosa. Manipulera embryot till önskad position med ett hårstrå loop verktyg (Figur 2). Återgå de embryon som ägg vatten efter avbildning. 8. Konfokal avbildning av infektionen Placera en droppe av agaros med låg smältpunkt (Lonza Inc., 1,5% (vikt / volym) i ägg vatten) på glaset botten av enWillCo-skålen (WillCo Wells, GWSt-5040) om ett inverterat konfokalmikroskop används, eller på ett enda hålrum depression bild (Agar Scientific, L4090) om en upprätt konfokalmikroskop används. Placera sövd embryot till agarosen droppe med begränsad mängd av ägg vatten och manipulera embryot på plats med ett hårstrå loop verktyg (Figur 2). Vid användning av ett inverterat mikroskop är det viktigt att embryots regionen av intresse är platt mot glaset botten av det bildgivande skålen. En upprätt mikroskop kan användas i kombination med nedsänkning i vatten eller långa avstånd torra mål och embryot bör placeras så att regionen av intresse är så nära målet som möjligt. Låt agarosen stelna och doppa agarosen nedgången i ägg vatten innehållande trikain (se 4,5). Om en upprättstående mikroskop används, placera en slip täckglas ovanpå depression kaviteten (inte tillåta luftbubblor att bildas). Sekventiellt förvärva influensaorescence och bilder för överföring. Försiktigt bort agaros från embryot med fina pincett och placera embryot tillbaka till ägget vatten om det behövs för ytterligare experiment. 9. Representativa resultat Injektion av Salmonella typhimurium eller Mycobacterium marinum bakterier i blodet ö embryon vid 1 dpf resulterar i snabb fagocytos genom makrofager. Den MPEG1 genen har nyligen identifierats som en trogen markör för embryonala makrofager, colocalizing med den väl etablerade makrofag markör csf1r (FMS) och inte överlappar neutrofila markörer som mpx (MPO) och LYZ 4, 14. För levande avbildning av bakteriell fagocytos använde vi transgena linjer i vilka MPEG1-promotorn driver fluorescerande protein-expression i makrofager 14. Dessa transgena linjer har antingen MPEG1 promotorn fanvändas direkt för att GFP-genen, eller använda en två-komponent-system där MPEG1-promotorn driver uttrycket av jäst-Gal4-transkriptionsfaktorn som aktiverar en andra transgen med Gal4-igenkänningssekvensen (UAS, uppströms aktiverande sekvens) fuserad till Kaede genen. När blodet ön injektionen (protokoll 5, figur 1A) utförs korrekt, kommer bakterierna flöda omedelbart genom blodcirkulationen och spred sig över hela embryot. Spridning av den relativt stora och ljusa fluorescerande märkta Ds-RED S. typhimurium bakterier kan avbildas direkt med en stereo fluorescensmikroskop (figur 3A), och konfokal avbildning vid 2 HPI visar att många bakterier fagocyteras av fluorescerande makrofager (Fig. 3B-C). Injektion av så lite som 25 ^ ^ cfu av vildtyp S. typhimurium bakterier kommer att resultera i en letal infektion, medan en liknande dos av bakterier av en avirulent ståget, såsom Ra, kan godkännas av den embryonala immunsystemet 3. En injektion dos av 250 cfu användes för att bestämma transkriptionella svar på S. typhimurium-infektion i den zebrafisk embryot och visade att induktion av en stark pro-inflammatorisk genexpression respons 15. I motsats härtill den intravenösa injektionen av M. Marinum bakterier inte framkallar inte en stark pro-inflammatoriskt svar, men leder till en ihållande infektion där infekterade makrofagerna bilda täta aggregat som anses vara de första stadierna av granulom, som är kännetecknande för tuberkulos 2. Konfokala avbildning av en sådan granulom-liknande aggregat i Tg (MPEG1: EGFP) gl22 linje 14 vid 5 dpi visar intracellulära tillväxten av mCherry-märkt M. marinum bakterier inuti de gröna fluorescerande makrofager (fig 3D-E). Othennes smittvägar är användbara för olika ändamål. Bakterier kan sprutas in i bakhjäman ventrikeln vid 32 HPF (figur 1C), som är en avdelning saknar makrofager. Injektion av 20-100 mCherry-märkt M. marinum bakterier i detta utrymme leder till snabb infiltration av makrofager som fagocyterar bakterier (Figur 4A). En annan metod för att studera den riktade migreringen av medfödda immunceller är injektion av bakterier in i svansen muskeln (Figur 1D). Men svans muskel injektioner kan också orsaka vävnadsskada som i sig framkallar viss attraktion av leukocyter. Sådan sårbildning svar kan undvikas när noggrant injicera en liten volym (0.5-1 nL) i otisk vesikel (Figur 1E). Som visas här med hjälp av Tg (mpx: EGFP) i114 linje 16, injektion av ca 20 cfu av S. typhimurium i örat vesikeln leder till attraktion av neutrofiler vid 3 HPI ( <stRong> Figur 4D), medan detta svar inte observeras i PBS-kontroll injektioner (Figur 4E). Notokorden, som tycks vara resistenta mot infiltration av leukocyter, är en permissiv fack för tillväxt av M. marinum mutanter som är starkt försvagat när de injiceras i andra vävnader 7, (Figur 4F). Slutligen, tidig insprutning av M. marinum i gulan av embryon tillhandahåller en alternativ metod för att uppnå en systemisk infektion. Vi generellt utföra dessa injektioner runt 16 cellstadiet (Figur 1G), men bakteriella injektioner i gulan kan även utföras i senare skeden (upp till 1000 cellstadiet), eller tidigare (1 till 8-cell stadium) för samarbete injektioner med morpholinos 8. Efter gulan injektion av en dos av 20-40 cfu, M. marinum bakterier sprids över flera dagar i embryonala vävnader och bildar granulom-liknande aggregat liknande dem som observerats på konventionellaintravenös injektion metod 8; (figur 4G). Gulan injektion metod är inte lämplig för S. typhimurium infektion, eftersom dess snabba tillväxt i gulan orsakar tidigt dödlighet. Äggulan infektionen metoden för M. Marinum infektioner kommer att vara användbart för high-throughput applikationer eftersom det kan automatiseras med hjälp av en injektion robot 8. Figur 1. Översikt över injektion metoder som används för att fastställa systemiska eller lokala infektioner i zebrafiskembryon. (AB) Intravenösa injektioner för att etablera en snabb systemisk infektion utförs i kaudalvenen vid bakre blodet ön vid 1 dpf (A) eller i kanalen för Cuvier på 2-3 dpf (B). (CE) Lokala injektioner för att studera makrofager och neutrofiler kemotaxi utförs i bakhjäman kammaren vid 1 dpf (C), Svansen muskeln vid 1-2 dpf (D) eller otisk vesikel vid 2-3 dpf (E). (F) Injektioner för att skapa en infektion synes oåtkomliga för fagocyter utförs i notochord med 1-2 dpf. (G) Injektioner för att skapa en tidig systemisk infektion med långsamt växande bakterier såsom M. marinum kan utföras i äggulan vid 16-1000 cellstadiet. Alla bilder togs med en Leica M165C, PLANAPO 1.0x ansluten till en Leica DFC420 kamera (Leica 10.446.307 0,8 x). Figur 2. Hair loop verktyg. En bit av människohår infogas som en slinga i öppningen av en Pasteur-pipett och fixeras på plats med super lim eller med Tipp-Ex. Detta ger ett bekvämt verktyg för att lätt manipulera ömtåliga zebrafiskembryon. Figur 3. Intravenösa injektioner avröda fluorescerande Salmonella typhimurium och Mycobacterium Marinum. Ds-RED-märkta S. typhimurium SL1027 bakterier (AC) och mCherry-märkt M. marinum Mma20 bakterier (DE) injicerades in i blodet ö Tg (MPEG1: Gal4-VP16) gl24; Tg (UAS-E1b: Kaede) s1999t (AC) eller Tg (MPEG1: EGFP) gl22 (DE) zebrafiskembryon vid 28 HPF. (A) Stereo-fluorescens och ljus-fältet överlägg bild som visar spridningen av S. typhimurium i blodcirkulationen vid 2 HPI (Leica MZ16FA mikroskop med Leica DFC420C kamera). (BC) Konfokala z-stack prognoser visar rött S. typhimurium bakterier fagocyteras av gröna makrofager vid 2 HPI (Leica TCS SPE, HCx APO objektiv 40x 0,8 NA). Bakterier som fortfarande är extracellulär kan också observeras. (D) Confocal z-stack projektion visar en granulom-liknande aggregat som innehåller M. marinum Mma20-infekterade och oinfekterade makrofager vid 5 dpi (Leica TCS SPE, HCx APO 40×0,8 NA). Makrofager i grönt och bakterier i rött. (E) Confocal z-stack projektion av en enskild makrofag (grön) med intracellulär M. marinum bakterier (röd). Området visas i D genom den vita rektangeln avbildades med en högre förstoring mål (Leica TCS SPE, HCx PL APO 63x 1,2 NA). Scalebars: 20 ^ m. Figur 4. Alternativa vägar för infektion av zebrafiskembryon. (A) mCherry-märkt M. marinum Mma20 bakterier injicerades i bakhjäman ventrikeln vid 32 hpf. Fluorescens och transmission överlägg bild som visar mCherry-märkta bakterier fagocyteras av makrofager vid 5 HPI (Leica TCS SPE, HCx PL FLUO TAR 40.0x 0,7 NA). (B) S. typhimurium injicerades i svansen muskeln vid 1 dpf. Attraktion av myeloida celler till injektionsstället (vit cirkel) visas vid 3 HPI av fluorescent in situ hybridisering 4, (C) medan oinjicerade embryon finns normalt inga myeloida celler på denna morfologiska webbplats. Även om embryon som inte innehåller mogna neutrofiler i detta skede, kan två populationer av myeloida celler urskiljas, ett uttryck för makrofag markören mfap4 (röd) och en uttrycker neutrofila markören MPX (grön) (Leica TCS SPE, HC PL Fluotar 10.0x 0,3 NA). Fluorescens hos bakterierna förloras efter hybridisering in situ förfarande. (D) Ds-RED-märkta S. typhimurium bakterier injicerades i otisk vesikel för Tg (MPX: EGFP) i114 zebrafisk vid 2 dpf. Stereo-fluorescens och ljus-fältet overlay bilder visar att mpx: EGFP märkta neutrofiler cellerna dras till den infekterade örat vesikeln (prickad ellipsen) vid 3 HPI, (E) medan kontroll injektion av PBS i örat vesikeln av Tg (MPX: EGFP ) i114 zebrafisk visar inte attraktion av neutrofiler till oinfekterade örat vesicle (prickad ellipsen) (Leica MZ16FA med Leica DFC420C kamera). (F) mCherry-märkt M. marinum bakterier av det attenuerade E11 eccCb1 :: tn mutantstam 17 injicerades i notokord vid en dpf. Proliferation inuti notochord avbildades vid 5 dpi (Leica MZ16FA mikroskop med DC500 kamera). (G) mCherry-märkt M. marinum E11 bakterier injicerades i gulan av 16-cellembryon steg zebrafisk enligt Tg (fli1a: EGFP) linje som uttrycker GFP i endotelceller i blod och lymfkärl. Bildning av granulom-liknande aggregat av infekterade celler i svansen regionen observeras vid 5 dpi (Leica MZ16FA mikroskop med Leica DFC420C kamera, bild från 8).