Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Infektion av zebrafiskembryon med intracellulära mängden sjukdomsalstrande bakterier

Published: March 15, 2012 doi: 10.3791/3781
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Molecular Cell Biology, Institute of Biology, Leiden University, 2Department of Medical Microbiology and Infection Control, VU University Medical Center, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

Transparenta zebrafiskembryon har visat sig användbara modeller värdar att visualisera och funktionellt samspel studie mellan medfödda immunceller och intracellulära bakteriella patogener, såsom

Abstract

Zebrafisk (Danio rerio) embryon används alltmer som en modell för att studera funktionen av ryggradsdjur medfödda immunförsvaret i värd-patogen interaktioner 1. De huvudsakliga celltyper av det medfödda immunförsvaret, makrofager och neutrofiler, utvecklas under de första dagarna av embryogenes före mognad av lymfocyter som krävs för adaptiva immunsvar. Den lätthet att erhålla ett stort antal embryon, deras tillgänglighet på grund av yttre utveckling, optisk transparens av embryonala och larvstadierna, ett brett utbud av genetiska verktyg, omfattande mutant resurser och samlingar av transgena reporter linjer, lägga allt till mångsidigheten hos zebrafisk modell. Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) och Mycobacterium marinum kan finnas intracellulärt i makrofager och används ofta för att studera värd-patogen interaktioner i zebrafiskembryon. Infektionen processer hos dessa tvåbakteriella patogener är intressanta att jämföra eftersom S. typhimurium infektion är akut och dödlig inom ett dygn, medan M. Marinum infektion är kronisk och kan avbildas upp till larvstadiet 2, 3. Platsen för mikro-injektion av bakterier i embryot (Figur 1) avgör om infektionen snabbt kommer att bli systemisk eller kommer inledningsvis bli lokaliserad. En snabb systemisk infektion kan fastställas genom mikro-injicera bakterier direkt i blodcirkulationen via kaudalvenen vid bakre blodet ön eller via kanalen i Cuvier, en bred spridning kanal på gulesäcken ansluter hjärtat till stammen kärlsystemet. Vid 1 dpf, är när embryon i detta skede har phagocytically aktiva makrofager, men neutrofiler har ännu inte mognat, injicera i blodet ön föredra. För injektioner med 2-3 dpf när embryon har också utvecklat funktionella (myeloperoxidas-producerande) neutrofiler, kanalen för Cuvier är att föredra som tHan injektionsstället. För att studera riktad migration av myeloida celler mot lokala infektioner, kan bakterier injiceras i svansen muskel, otisk vesikel, eller bakhjäman ventrikeln 4-6. Dessutom notokorden, en struktur som verkar vara normalt otillgängligt för myeloida celler, är mycket känslig för lokal infektion 7. Ett användbart alternativ för high throughput tillämpningar är injektion av bakterier in i gulan av embryon inom de första timmarna efter befruktningen 8. Kombinera fluorescerande bakterier och transgena linjer zebrafisk med fluorescerande makrofager eller neutrofiler skapar idealiska förhållanden för multi-color avbildning av värd-patogen interaktioner. Denna video artikel kommer att beskriva detaljerade protokoll för intravenös och lokal infektion av zebrafiskembryon med S. typhimurium eller M. marinum bakterier och för efterföljande fluorescens avbildning av interaktionen med celler från det medfödda immunförsvaret.

Protocol

1. Förbered Injektionsnålar

  1. Förbered borosilikatglas mikrokapillär injektionsnålar (Harvard Apparatus, 300.038, 1 mm OD x 0,78 mm ID) med en mikropipett avdragare enhet (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brun p-97 med följande inställningar för en längre tips: lufttrycket 400; värme 610, pull 40, hastigheten 50, tiden 30 och med följande inställningar för en kortare tips: Lufttrycket 500, värme 510, pull 100, hastigheten 200, tid 60).
  2. Bryt av nålspetsen med fina pincett för att få en diameter spets öppning av 5-10 nm. Det är tillrådligt att avfasningen nålspetsen öppningen vid 45 graders vinkel med en microgrinder (Narishige Inc., EG-400) för att ge en skarpare spets. Detta kommer att underlätta punktera epidermal lagret och därmed resultera i fler reproducerbara injektioner med mindre vävnadsskador än med trubbiga nålar. Längre spets nålar är föredragna för kaudalvenen (steg 5) och kanalen hos Cuvier (steg 6.1) injektioner och kortare spets nålarföredras för de andra injektion-protokoll (steg 6.2-6.6).

2. Framställ S. typhimurium Inokulat

  1. Plate ut S. typhimurium från en -80 ° C glycerolförråd på LB-agarplattor (med lämpliga antibiotika för att selektera för fluorescens expressionsvektorer) och inkubera över natten vid 37 ° C.
  2. Plocka enskilda fluorescerande positiva kolonier och återsuspendera dem till den önskade koncentrationen (se protokollen 5 och 6) i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), eventuellt innehållande 0,085% (volym / volym) fenol röd (Sigma-Aldrich) för att underlätta visualisering av injektionsprocessen. Direkt använda färsk suspension för injektion eller förbereda glycerolstamlösningar. För att framställa glycerolstamlösningar, centrifugera ner den nygjorda injektion lager med önskad koncentration av bakterier och koncentrera mälden genom att återsuspendera pelleten i halva volymen med början i steril 20% (volym / volym) glycerol (Sigma-Aldrich) i PBS. Förvara glycerol beståndet vid -80 ° C. Späd 1:1-glycerolförråd (volym / volym) före injektion i steril PBS, eventuellt innehållande 0,17% fenolrött.
  3. Vortex bakteriesuspensionen väl för att undvika klumpbildning.
  4. Fyll på inokulatet i mikrokapillär nålen med hjälp av en microloader spets (Eppendorf, 5242956,003).
  5. Grund av den relativt stora storleken hos S. typhimurium bakterier och deras ljusa Ds-RED fluorescens när du använder pGMDs3 expressionsvektom 3 (stam fås på begäran), kan enskilda bakterieceller lätt räknas med en fluorescens stereomikroskop för att ställa injektionen dosen. För detta ändamål, injicera 1 nL in i en droppe PBS på en agarplatta, räkna fluorescerande bakterier och beräkna injektionsvolymen som krävs för att uppnå den önskade bakteriella dosen (helst hålla injektionsvolymen mellan 1-2 NL). Injicera embryona med S. typhimurium via den valda rutten (se protokoll 5 och 6).

3. Framställ

  1. Håll M. Marinum stam växer på Difco Middlebrook 7H10-agar (BD och bolag) kompletterat med 10% oljesyra-albumin-dextros-katalas (OADC, BD och bolag), 0,5% glycerol och med lämpliga antibiotika för att selektera för fluorescens expressionsvektorer (stammar tillgängliga på begäran 9), så finns det alltid en nygjord stamlösning.
  2. Välj en koloni av M. Marinum och återsuspendera det i Difco Middlebrook 7H9 buljong (BD och bolag) kompletterat med 10% albumin-dextros-katalas (ADC, BD och bolag) och 0,05% Tween 80 (Sigma-Aldrich) och lämpliga antibiotika. Kontrollera att den optiska densiteten (OD) vid 600 nm är 0,2 - 0,3 och låta det växa statiskt natt vid 28,5 ° C. Den generation tid M. Marinum är cirka 4-6 h, varierar beroende på stammen.
  3. Mäta OD vid 600 nm på nytt på samma dag som injektioner. En OD600 på 1 motsvarar cirka 10 8 M. marinum / ml(Detta kan variera beroende på den bakteriella stammen som används och således bör baseras på en tillväxtkurva för den speciella stam).
  4. Skörda bakterierna när de är i logaritmisk fas (låt inte OD600 överstiger 1,00) genom centrifugering och tvätta dem tre gånger i sterilt PBS.
  5. Mäta OD600 igen av den bakteriella suspensionen i PBS, centrifugera ner, och återsuspendera bakterier till den önskade koncentrationen (se protokollen 5 och 6) i PBS eller i 2% polyvinylpyrrolidon (PVP40) i PBS (vikt / volym), vilket förbättrar homogeniteten av den bakteriella suspensionen. Fenolrött (Sigma-Aldrich) kan tillsättas till en koncentration av 0,085% för att hjälpa till visualisering av insprutningsprocessen. Direkt använda färsk suspension för injektion eller förbereda glycerolstamlösningar. För att framställa glycerolstamlösningar spinna ned nygjord injektion lager med önskad koncentration av bakterier och koncentrera mälden genom att återsuspendera pelleten i halva volymen med början i steril 20% glycerol i PBS. Förvara GlycErol lager vid -80 ° C. Späd 1:1-glycerolförråd (volym / volym) i sterilt PBS, eventuellt innehållande 4% PVP40 och / eller 0,17% fenolrött.

4. Förbered zebrafiskembryon för injektionsvätskor

  1. Ställ in zebrafisk häckande par och samla embryon som visas i en annan video artikel 10. Hålla embryon i en petriskål fylld med ägg vatten (60 | ig / ml havssalter;. Ca 60 embryon per skål) och inkubera vid 28,5 ° C.
  2. Om så erfordras, tillsätt 0,003% N-fenyltiokarbamid (PTU, Sigma-Aldrich) till ägget vatten när embryona är ungefär 12 hpf att förhindra melaninnivå.
  3. Runt 24 timmar efter befruktning (HPF), dechorionate embryona med fina pincetter (Fine Science Tools Inc., Dumont # 5 Tång - Inox biologi.
  4. Hålla embryona i en petriskål fylld med ägg vatten och med ett skikt av 1% agaros i botten för att förhindra embryon från att fastna vid plastytan.
  5. Bedöva embryona med 200 pg / ml buffrad 3-Aminobensoesyra (trikain, Sigma-Aldrich) ca 10 min före injektion.

5. Intravenös injektion av bakterier in i en dag gamla embryon

  1. Steg embryona vid 28 HPF 11 genom att kontrollera för konsekvent blodcirkulation, i början av pigmentering i ögat, en rak svans, och hjärtat är placerad precis ventralt för ögat.
  2. Bedöva embryona, se steg 4,5.
  3. Ladda nålen med den bakteriella inokulum med användning av en microloader spets.
  4. Montera den laddade nålen på en mikromanipulator (Sutter Instrument, MM-33) är ansluten till en monter (World precisionsinstrument, M10L magnetiska stativ) och placera den under ett stereomikroskop (Leica M50, akromat 1x mål 0,15 NA, genomlysningsbas TL ST). Ställ in insprutningstiden till 0,2 s och den ersättning trycket till 15 hPa (Eppendorf, Femtojet). Justera insprutningstrycket mellan 700 och 900 hPa att erhålla den korrekta injektionsvolym för nålenanvändas. Justera droppstorlek för att matcha den önskade diametern med hjälp av en skala bar på ett objektglas eller i den okulära. För bestämning av storlek nedgången kan injiceras i mineralolja på ett objektglas, eller storlek kan uppskattas genom att injicera i luften, som lämnar droppen hänger på nålspetsen. Radien hos en droppe av en nL är 0,062 mm (V = 4/3 π r 3).
  5. Ställ in mikromanipulator med den laddade nålen i rätt läge före injektion (dvs. ungefär i 45 ° vinkel i förhållande till injektionen plåtytan) och bara flytta den fram och tillbaka för att injicera.
  6. De sövda embryon pipetteras på en platt 1% agaros injicering plattan och överskott ägg vatten avlägsnas, så att ytspänningen för att hålla de embryon på plats under injektioner. Använd ett verktyg håret slinga (figur 2) att rada upp embryon. Orientera injektion plattan för hand under injektioner för att placera embryona in den föredragna positionen för inserting nålen, dvs med svansen pekar mot nålspetsen.
  7. Placera nålspetsen precis ovanför den kaudala venen nära det urogenitala öppningen (figur 1 A), genomtränga periderm med nålspetsen och injicera den önskade dosen av bakterier, vi använder ca. 250 CFU S. typhimurium av vildtyp (wt)-stam SL1027, som innehåller Ds-RED expressionsvektor pGMDs3, och ca. 120 cfu av M. marinum-stam Mma20. Det injicerade bakteriesuspension följer blodflödet genom den kaudala venen mot hjärtat. Övervaka om injektionen utfördes korrekt, genom att kontrollera en expanderande volym av det vaskulära systemet direkt efter pulsen 2. För dos-respons försök kan 2-3 på varandra följande injektioner utföras utan att extrahera nålen.
  8. Ofta kontrollera att injektionen volymen förblir densamma under försöket. För att ge en kontroll för konsistens injektionerna under hela experimentet, injicera en DROp av bakterier direkt i en steril PBS droppe på bakterietillväxt mediet efter ungefär var 30: e embryo injektion. Plate ut denna droppe och räkna bakteriella kolonier efter inkubation för att bestämma kolonibildande enheter (cfu) i injektionsvolymen.
  9. Använd en fluorescens stereomikroskop (protokoll 7) att observera enskilda fluorescerande S. typhimurium-celler som cirkulerar i blodbanan direkt efter injektion, och kassera embryon som inte är ordentligt injiceras. Individuella fluorescerande M. marinum bakterier kan inte observeras med stereo fluorescensmikroskopi direkt efter injektioner, men fluorescerande aggregat av infekterade celler bör kunna synas med 2 dagar efter infektion (dpi) och växa sig större med tiden.

6. Alternativa smittvägar

  1. Kanal för Cuvier injektion: line up sövda embryon (2-3 DPF) på en plan 1% agaros injicera plattan som för kaudalvenen injektioner (se 5,6). Rikta in injicerajon plattan för hand under injektioner att placera embryona till önskad position för att föra in nålen, dvs diagonalt under en 45 ° vinkel så att kanalen för Cuvier kan kontaktas av nålspetsen från den dorsala sidan av embryot (Figur 1B) . Stick in nålen i utgångspunkten av kanalen i Cuvier precis dorsal till den plats där kanalen börjar bredda över gulesäcken och injicera 100-200 bakterier (1-3 NL). Injektionen är riktig om volymen i kanalen expanderar direkt efter pulsen och gulesäcken är inte brustit. När det gäller kaudalvenen injektioner (se 5,7), kan flera på varandra följande injektioner kan utföras utan att extrahera nålen.
  2. Bakhjäman kammare injektion: line up sövda embryon (32 HPF) på en plan 1% agarosgel injicera plattan så att embryona placeras med sina rygg-sida mot nålspetsen. Sätt nålen i bakhjäman kammaren från ett anterior position utan att röra neuroepithelium (Figur 1C) och injicera 20-100 bakterier (0.5-1 NL). För att öva förfarandet använder en fluorescerande färgämne (såsom Texas-Red dextran) som visas i en annan video artikel 13.
  3. Svans muskler injektion: ställning sövda embryon (1-2 DPF) som för kaudalvenen injektioner (se 5,6). Justera mikromanipulator med den laddade nålen till en vinkel av ungefär 65 ° med avseende på injektionen plåtytan. Injicera en bakteriesuspension (0.5-1 nL) innehållande från 20 till 50 ^ cfu i muskeln ovanför urogenitala öppningen (figur 1D) utan att orsaka skada på notokord eller blodkärl.
  4. Öron vesikelns injektion: ställning sövda embryon (2-3 DPF) som för kaudalvenen injektioner (se 5,6). Justera mikromanipulator med den laddade nålen till en vinkel av ungefär 65 ° med avseende på injektionen plåtytan. Injicera ca 20 bakterier (0,5 nL) i örat vesikeln (Figur 1E) med lågt tryckure att undvika lokal vävnad bristning.
  5. Notochord injektion: line up sövda embryon (1-2 DPF) på en plan 1% agarosgel injicera plattan så att embryona placeras med svansen pekar bort från nålspetsen. För in nålen genom svansen muskelvävnaden i notochord (Figur 1F) och injicera ca 20-50 bakterier (maximal 0,5 nL). Var noga med att inte injicera för mycket volym för att undvika bristningar i notochord.
  6. Gula injektion: ställning ägg innehåller embryon vid 16 till 1000 cellstadiet på en 1% agarosgel injicera platta med rektangulära eller V-formade kanaler görs med en kanal form 12 eller online på http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Stick hål på nålen genom chorion i mitten av äggulan (Figur 1G) och injicera 20-40 bakterier (1-2 NL). Användning av 2% PVP40 bärarlösning för den bakteriella suspensionen (se steg 3,5)är viktigt att förhindra tidigt bakteriell spridning i embryot.

7. Stereo Imaging av infektionen

  1. Bedöva de infekterade embryona i en 1% agarosgel lager Petriskål täckt med ägg vatten innehållande trikain (se 4,5).
  2. Rikta in embryon i rätt läge för avbildning under ett fluorescens stereo mikroskop med ett hårstrå loop verktyg (Figur 2). Innan simblåsan har uppblåsta (1-5 dpf) kommer embryona ligga platt på sina sidor så att sidovy avbildning.
  3. Om en annan position än den laterala uppfattning krävs montera embryon i 1,5% metylcellulosa. Manipulera embryot till önskad position med ett hårstrå loop verktyg (Figur 2).
  4. Återgå de embryon som ägg vatten efter avbildning.

8. Konfokal avbildning av infektionen

  1. Placera en droppe av agaros med låg smältpunkt (Lonza Inc., 1,5% (vikt / volym) i ägg vatten) på glaset botten av enWillCo-skålen (WillCo Wells, GWSt-5040) om ett inverterat konfokalmikroskop används, eller på ett enda hålrum depression bild (Agar Scientific, L4090) om en upprätt konfokalmikroskop används.
  2. Placera sövd embryot till agarosen droppe med begränsad mängd av ägg vatten och manipulera embryot på plats med ett hårstrå loop verktyg (Figur 2). Vid användning av ett inverterat mikroskop är det viktigt att embryots regionen av intresse är platt mot glaset botten av det bildgivande skålen. En upprätt mikroskop kan användas i kombination med nedsänkning i vatten eller långa avstånd torra mål och embryot bör placeras så att regionen av intresse är så nära målet som möjligt.
  3. Låt agarosen stelna och doppa agarosen nedgången i ägg vatten innehållande trikain (se 4,5). Om en upprättstående mikroskop används, placera en slip täckglas ovanpå depression kaviteten (inte tillåta luftbubblor att bildas).
  4. Sekventiellt förvärva influensaorescence och bilder för överföring.
  5. Försiktigt bort agaros från embryot med fina pincett och placera embryot tillbaka till ägget vatten om det behövs för ytterligare experiment.

9. Representativa resultat

Injektion av Salmonella typhimurium eller Mycobacterium marinum bakterier i blodet ö embryon vid 1 dpf resulterar i snabb fagocytos genom makrofager. Den MPEG1 genen har nyligen identifierats som en trogen markör för embryonala makrofager, colocalizing med den väl etablerade makrofag markör csf1r (FMS) och inte överlappar neutrofila markörer som mpx (MPO) och LYZ 4, 14. För levande avbildning av bakteriell fagocytos använde vi transgena linjer i vilka MPEG1-promotorn driver fluorescerande protein-expression i makrofager 14. Dessa transgena linjer har antingen MPEG1 promotorn fanvändas direkt för att GFP-genen, eller använda en två-komponent-system där MPEG1-promotorn driver uttrycket av jäst-Gal4-transkriptionsfaktorn som aktiverar en andra transgen med Gal4-igenkänningssekvensen (UAS, uppströms aktiverande sekvens) fuserad till Kaede genen. När blodet ön injektionen (protokoll 5, figur 1A) utförs korrekt, kommer bakterierna flöda omedelbart genom blodcirkulationen och spred sig över hela embryot. Spridning av den relativt stora och ljusa fluorescerande märkta Ds-RED S. typhimurium bakterier kan avbildas direkt med en stereo fluorescensmikroskop (figur 3A), och konfokal avbildning vid 2 HPI visar att många bakterier fagocyteras av fluorescerande makrofager (Fig. 3B-C). Injektion av så lite som 25 ^ ^ cfu av vildtyp S. typhimurium bakterier kommer att resultera i en letal infektion, medan en liknande dos av bakterier av en avirulent ståget, såsom Ra, kan godkännas av den embryonala immunsystemet 3. En injektion dos av 250 cfu användes för att bestämma transkriptionella svar på S. typhimurium-infektion i den zebrafisk embryot och visade att induktion av en stark pro-inflammatorisk genexpression respons 15. I motsats härtill den intravenösa injektionen av M. Marinum bakterier inte framkallar inte en stark pro-inflammatoriskt svar, men leder till en ihållande infektion där infekterade makrofagerna bilda täta aggregat som anses vara de första stadierna av granulom, som är kännetecknande för tuberkulos 2. Konfokala avbildning av en sådan granulom-liknande aggregat i Tg (MPEG1: EGFP) gl22 linje 14 vid 5 dpi visar intracellulära tillväxten av mCherry-märkt M. marinum bakterier inuti de gröna fluorescerande makrofager (fig 3D-E).

Othennes smittvägar är användbara för olika ändamål. Bakterier kan sprutas in i bakhjäman ventrikeln vid 32 HPF (figur 1C), som är en avdelning saknar makrofager. Injektion av 20-100 mCherry-märkt M. marinum bakterier i detta utrymme leder till snabb infiltration av makrofager som fagocyterar bakterier (Figur 4A). En annan metod för att studera den riktade migreringen av medfödda immunceller är injektion av bakterier in i svansen muskeln (Figur 1D). Men svans muskel injektioner kan också orsaka vävnadsskada som i sig framkallar viss attraktion av leukocyter. Sådan sårbildning svar kan undvikas när noggrant injicera en liten volym (0.5-1 nL) i otisk vesikel (Figur 1E). Som visas här med hjälp av Tg (mpx: EGFP) i114 linje 16, injektion av ca 20 cfu av S. typhimurium i örat vesikeln leder till attraktion av neutrofiler vid 3 HPI ( (Figur 4E). Notokorden, som tycks vara resistenta mot infiltration av leukocyter, är en permissiv fack för tillväxt av M. marinum mutanter som är starkt försvagat när de injiceras i andra vävnader 7, (Figur 4F). Slutligen, tidig insprutning av M. marinum i gulan av embryon tillhandahåller en alternativ metod för att uppnå en systemisk infektion. Vi generellt utföra dessa injektioner runt 16 cellstadiet (Figur 1G), men bakteriella injektioner i gulan kan även utföras i senare skeden (upp till 1000 cellstadiet), eller tidigare (1 till 8-cell stadium) för samarbete injektioner med morpholinos 8. Efter gulan injektion av en dos av 20-40 cfu, M. marinum bakterier sprids över flera dagar i embryonala vävnader och bildar granulom-liknande aggregat liknande dem som observerats på konventionellaintravenös injektion metod 8; (figur 4G). Gulan injektion metod är inte lämplig för S. typhimurium infektion, eftersom dess snabba tillväxt i gulan orsakar tidigt dödlighet. Äggulan infektionen metoden för M. Marinum infektioner kommer att vara användbart för high-throughput applikationer eftersom det kan automatiseras med hjälp av en injektion robot 8.

Figur 1
Figur 1. Översikt över injektion metoder som används för att fastställa systemiska eller lokala infektioner i zebrafiskembryon. (AB) Intravenösa injektioner för att etablera en snabb systemisk infektion utförs i kaudalvenen vid bakre blodet ön vid 1 dpf (A) eller i kanalen för Cuvier på 2-3 dpf (B). (CE) Lokala injektioner för att studera makrofager och neutrofiler kemotaxi utförs i bakhjäman kammaren vid 1 dpf (C), Svansen muskeln vid 1-2 dpf (D) eller otisk vesikel vid 2-3 dpf (E). (F) Injektioner för att skapa en infektion synes oåtkomliga för fagocyter utförs i notochord med 1-2 dpf. (G) Injektioner för att skapa en tidig systemisk infektion med långsamt växande bakterier såsom M. marinum kan utföras i äggulan vid 16-1000 cellstadiet. Alla bilder togs med en Leica M165C, PLANAPO 1.0x ansluten till en Leica DFC420 kamera (Leica 10.446.307 0,8 x).

Figur 2
Figur 2. Hair loop verktyg. En bit av människohår infogas som en slinga i öppningen av en Pasteur-pipett och fixeras på plats med super lim eller med Tipp-Ex. Detta ger ett bekvämt verktyg för att lätt manipulera ömtåliga zebrafiskembryon.

Figur 3
Figur 3. Intravenösa injektioner avröda fluorescerande Salmonella typhimurium och Mycobacterium Marinum. Ds-RED-märkta S. typhimurium SL1027 bakterier (AC) och mCherry-märkt M. marinum Mma20 bakterier (DE) injicerades in i blodet ö Tg (MPEG1: Gal4-VP16) gl24; Tg (UAS-E1b: Kaede) s1999t (AC) eller Tg (MPEG1: EGFP) gl22 (DE) zebrafiskembryon vid 28 HPF. (A) Stereo-fluorescens och ljus-fältet överlägg bild som visar spridningen av S. typhimurium i blodcirkulationen vid 2 HPI (Leica MZ16FA mikroskop med Leica DFC420C kamera). (BC) Konfokala z-stack prognoser visar rött S. typhimurium bakterier fagocyteras av gröna makrofager vid 2 HPI (Leica TCS SPE, HCx APO objektiv 40x 0,8 NA). Bakterier som fortfarande är extracellulär kan också observeras. (D) Confocal z-stack projektion visar en granulom-liknande aggregat som innehåller M. marinum Mma20-infekterade och oinfekterade makrofager vid 5 dpi (Leica TCS SPE, HCx APO 40x0,8 NA). Makrofager i grönt och bakterier i rött. (E) Confocal z-stack projektion av en enskild makrofag (grön) med intracellulär M. marinum bakterier (röd). Området visas i D genom den vita rektangeln avbildades med en högre förstoring mål (Leica TCS SPE, HCx PL APO 63x 1,2 NA). Scalebars: 20 ^ m.

Figur 4
Figur 4. Alternativa vägar för infektion av zebrafiskembryon. (A) mCherry-märkt M. marinum Mma20 bakterier injicerades i bakhjäman ventrikeln vid 32 hpf. Fluorescens och transmission överlägg bild som visar mCherry-märkta bakterier fagocyteras av makrofager vid 5 HPI (Leica TCS SPE, HCx PL FLUO TAR 40.0x 0,7 NA). (B) S. typhimurium injicerades i svansen muskeln vid 1 dpf. Attraktion av myeloida celler till injektionsstället (vit cirkel) visas vid 3 HPI av fluorescent in situ hybridisering 4, (C) medan oinjicerade embryon finns normalt inga myeloida celler på denna morfologiska webbplats. Även om embryon som inte innehåller mogna neutrofiler i detta skede, kan två populationer av myeloida celler urskiljas, ett uttryck för makrofag markören mfap4 (röd) och en uttrycker neutrofila markören MPX (grön) (Leica TCS SPE, HC PL Fluotar 10.0x 0,3 NA). Fluorescens hos bakterierna förloras efter hybridisering in situ förfarande. (D) Ds-RED-märkta S. typhimurium bakterier injicerades i otisk vesikel för Tg (MPX: EGFP) i114 zebrafisk vid 2 dpf. Stereo-fluorescens och ljus-fältet overlay bilder visar att mpx: EGFP märkta neutrofiler cellerna dras till den infekterade örat vesikeln (prickad ellipsen) vid 3 HPI, (E) medan kontroll injektion av PBS i örat vesikeln av Tg (MPX: EGFP ) i114 zebrafisk visar inte attraktion av neutrofiler till oinfekterade örat vesicle (prickad ellipsen) (Leica MZ16FA med Leica DFC420C kamera). (F) mCherry-märkt M. marinum bakterier av det attenuerade E11 eccCb1 :: tn mutantstam 17 injicerades i notokord vid en dpf. Proliferation inuti notochord avbildades vid 5 dpi (Leica MZ16FA mikroskop med DC500 kamera). (G) mCherry-märkt M. marinum E11 bakterier injicerades i gulan av 16-cellembryon steg zebrafisk enligt Tg (fli1a: EGFP) linje som uttrycker GFP i endotelceller i blod och lymfkärl. Bildning av granulom-liknande aggregat av infekterade celler i svansen regionen observeras vid 5 dpi (Leica MZ16FA mikroskop med Leica DFC420C kamera, bild från 8).

Discussion

Infektionen metoder som beskrivs i denna artikel används ofta för att studera funktionen av värdens medfödda immunitet gener eller bakteriella gener virulens 1. De intravenösa mikroinjektion metoder (protokoll 5 och 6.1) används oftast för sådana studier. Kaudalvenen på bakre blodet ön är den mest lämplig plats för intravenös injektion av 1-dagar gamla embryon. Såsom kaudalvenen blir svårare att penetrera vid senare stadier, föredrar vi kanalen hos Cuvier som intravenös injektion ställe för embryon vid 2-3 dpf. I samtliga fall är det viktigt att injicera de embryon med konsekventa antal bakterier, som bör kontrolleras av plätering injektion ympning cfu räkning. Följande aspekter måste beaktas för att uppnå reproducerbara injektioner. För det första är det viktigt att ha hög kvalitet glas mikrokapillär injektionsnålar. Om nålspetsen är för stor, kommer den injektion skapa en punktering hål tillräckligt stor för blödningen att inträffa ochde injicerade bakterier kommer att strömma ut ur blodomloppet. För det andra måste bakterier injiceras direkt in i blodomloppet. Om nålen tips är att inte inne i venen eller om sprids injektionsvätska till gulesäcken förlängningen måste embryot kasseras från experimentet. För det tredje, med användning av PVP40 som en bärare för injicering M. Marinum kommer att bidra till att förhindra bakterier från att sjunka i glaset nålen. PVP40 förbättrar homogenitet suspensionen, vilket resulterar i mer reproducerbar ympning under hela injektioner. PVP40 kan också användas för S. typhimurium injektioner, men här är det mindre viktigt eftersom den större storleken och stark fluorescens av bakterierna kan en visuell kontroll över injektionsstället inokulum under experimenten. För att öva injektionerna rekommenderar vi användning av fenol rött färgämne (1% v / v) eller 1 m fluorescerande sfärer finns i olika färger (Invitrogen). När tekniken behärskar, tar det ca 30 minutes att injicera 50-100 embryon, inklusive den tid som behövs för att justera de embryon på agarosplattor och justera den bakteriella injektionsvolymen.

Medan intravenösa injektioner i blodet ön (protokoll 5) eller i kanalen för Cuvier (protokoll 6,1) är vanligast, har de alternativa smittvägar beskrivs i den här videon artikeln visat sig vara användbara för att studera makrofager och neutrofiler kemotaxi (protokoll 6,2, 6,3 och 6,4), för att studera tillväxt av försvagade bakteriestammar (protokoll 6,5), och för att anpassa zebrafisk infektionen modell för hög kapacitet applikationer (protokoll 6,6) 4-8. De beskrivna mikroinjektion metoder kan också tillämpas för injektioner av virus 18, 19, svampsporer 14, 20 eller protozoiska parasiter (Maria Forlenza, personlig kommunikation). Ett bra komplement till de injektion förfaranden som beskrivs i den här videon artikel är en nyligen beskriven procedur för subkutan injektion av bakterier i zebrafish embryon 21. Detta förfarande tillämpas för att studera fagocytos av bakterier genom neutrofiler, vilka befanns effektivt tränger bakterier på vävnadsytor, men i motsats till makrofager, var praktiskt taget inte att fagocytera bakterier vid injektion i blodet eller i vätskefyllda kroppshåligheter. För subkutana injektioner embryon är placerade samma som för svansen muskel injektionerna som beskrivs i denna video artikel, men nålen sätts in strax under huden för att injicera bakterierna under en somit.

Det är viktigt att beakta att mikroinjektion är huvudsakligen artificiell väg för infektion. Emellertid tidiga embryon är mycket motståndskraftiga mot yttre exponering för bakteriella patogener. I själva verket nedsänkning analyser, då embryona som badar i en bakteriesuspension, är inte reproducerbara i våra händer 22. Medan vissa embryon kan bli infekterade vid nedsänkning, har vi observerat en stor variation i dödlighet och i det uttryckligajon av inflammatoriska markörgener mellan individuella embryon i sådana analyser. De mikroinjektion metoder som beskrivs i denna artikel uppnå reproducerbara infektioner och är särskilt användbara för att studera bakteriella interaktioner med värdens medfödda immunceller. Ett effektivt sätt att kvantifiera bakteriell infektion i enskilda embryon är att analysera de fluorescerande bilder av infekterade embryon med skräddarsydd, dedikerad pixel kvantifiering mjukvara 17, 23. Detta tillvägagångssätt har visat sig korrelera väl med resultaten av cfu räknas efter utstrykning av infekterade embryon. På samma sätt har relativa förändringarna i leukocyt nummer per embryo kvantifierats av digital bildanalys i transgena reporter leukocyt fluoroforenheter linjer; detta tillvägagångssätt skulle kunna tillämpas på kvantifiera värden leukopoietic svar på infektion 24.

Funktionen hos värdens medfödda immunförsvaret gener kan undersökas effektivt in vivo genom att kombinera de beskrivna infektionsmodellermed morfolino knockdown. Morpholinos är syntetiska antisens-oligonukleotider som är riktade specifika RNA och minska uttrycket av de genprodukter när de injiceras i 1-cellembryon steg zebrafisk som visas i andra video artiklar i denna tidskrift 10, 25. I morfolino knockdown studier är det av stor vikt att alla embryon grupper som skall jämföras är iscensatt rätt innan de bakteriella injektioner. Detta är särskilt viktigt eftersom embryon har en utvecklingen av immunsystemet som blir allt kompetent tiden.

Det finns flera transgena linjer reportergrupper för närvarande tillgängliga för att särskilja de stora medfödda immunförsvaret underuppsättningar, makrofager och neutrofiler, i zebrafiskembryon. MPX och LYZ promotorer har använts för att generera neutrofila reportergrupper linjer 16, 26, 27, och den csf1r (FMS) och MPEG1 promotorer har använts för att framställa makrofager reportrar 14, 28. Medan CSF1R (FMS) dessutom uttrycks i xanthophores är MPEG1 uttryck enbart i makrofager. Som visas i denna video artikeln, nyligen utvecklade MPEG1 reporter linjer är mycket användbara för avbildning bakteriell fagocytos av makrofager.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Chao Cui, Floor de Kort, Esther Stoop och Ralph Carvalho för bilder i Figur 4, Ulrike Nehrdich och Davy de Witt för fisk vård, och andra medlemmar Lab för hjälpsamma diskussioner. Detta arbete stöds av Smart Mix Program det nederländska ekonomiministeriet och ministeriet för utbildning, kultur och vetenskap, Europeiska kommissionen 7:e ramprojekt ZF-HÄLSA (HEALTH-F4-2010 till 242.048), Europeiska Marie Curie- Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011 till 289.209) och genom den australiska NHMRC (637.394). Den australiska regenerativ medicin Institute stöds med bidrag från delstatsregeringen i Victoria och den australiska regeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenol Red Sigma-Aldrich P0290
Glycerol Sigma-Aldrich 228210
Difco Middlebrook 7H10 agar BD Biosciences 262710
BBL Middlebrook OADC Enrichment BD Biosciences 211886
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
BBL Middlebrook ADC Enrichment BD Biosciences 211887
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Polyvinylpyrrolidone (PVP40) Calbiochem 529504
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387
SeaPlaque Agarose (low melting point agarose) Lonza Inc. 50100
FluoSpheres (1.0 μm, red fluorescent (580/605)) Invitrogen F8821
FluoSpheres (1.0 μm, yellow-green fluorescent (505/515)) Invitrogen F8823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
  2. Davis, J. M. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
  3. vander Sar, A. M. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
  4. Zakrzewska, A. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, 1-11 (2010).
  5. Le Guyader, D. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
  7. Alibaud, L. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
  8. Carvalho, R. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, 16779-16779 (2011).
  9. van der Sar, A. M., Spaink, H. P., Zakrzewska, A., Bitter, W., Meijer, A. H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
  10. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115-e1115 (2009).
  11. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). , The University of Oregon Press. Eugene. (1993).
  13. Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218-e1218 (2009).
  14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, 49-56 (2011).
  15. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
  16. Renshaw, S. A. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
  17. Stoop, E. J. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
  18. Levraud, J. P. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
  19. Levraud, J. P., Colucci-Guyon, E., Redd, M. J., Lutfalla, G., Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
  20. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
  21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
  22. van Soest, J. J. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58-58 (2011).
  23. Adams, K. N. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
  24. Ellett, F. L., Lieschke, G. J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. , (2011).
  25. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113-e1113 (2009).
  26. Mathias, J. R. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
  27. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42-42 (2007).
  28. Gray, C. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

Tags

Immunologi 61 Nummer zebrafisk embryo medfödd immunitet makrofager infektion Salmonella Mycobacterium mikroinjektion fluorescens avbildning,
Infektion av zebrafiskembryon med intracellulära mängden sjukdomsalstrande bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benard, E. L., van der Sar, A. M.,… More

Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter