אימון סיבולת פרוטוקול מבחני ביצועים ארוכי טווח עבור תסיסנית melanogaster

Summary

אנו מתארים את פרוטוקול 1 אימון סיבולת של זן חשובים מודל גנטי,

Abstract

אחת הבעיות הדחופות ביותר העומדות בפני חוקרים רפואיים מודרניים הוא רמות הגואה של השמנת יתר, עם גידול עקב בהפרעות נלוות כגון סוכרת ומחלות לב וכלי דם ^1-3. הנושא החשוב של מחקר אלה בעיות בריאות הקשורות כרוך התפקיד של פעילות אירובית כמו התערבות מועילה.

אימון פעילות גופנית היא זולה, לא פולשנית התערבות עם תוצאות חיוביות, ביניהן ירידה בגוף עודף שומן ^4, עלתה הרגישות לאינסולין בשריר השלד ^5, עלתה תגובות אנטי דלקתיות antioxidative ^6, ויכולת משופרת כויץ cardiomyocytes ^7. פעילות גופנית בעצימות נמוכה ידוע להגביר את הפעילות biogenesis המיטוכונדריה ו ⁸ בבני אדם ועכברים, עם coactivator תעתיק PGC1-α כמו ביניים חשוב ^9,10.

Despiטה את החשיבות של פעילות גופנית ככלי למאבק כמה חשובים מחלות הקשורות לגיל, נרחבים מחקרים גנטיים האורך כבר הקשתה על ידי היעדר פרוטוקול אימון סיבולת כמה קצרי חיים מינים מודל גנטיות. מגוון של כלים גנטיים הזמינים לשימוש עם תסיסנית, תוך שמירה תוחלת החיים קצרה וזולה שלו, להפוך אותו מושך מודל למחקר נוסף של אלה מנגנונים גנטיים. לאור זאת פיתחנו מנגנון רומן, המכונה מגדל כוח, בקנה מידה גדול עבור פעילות גופנית, אימון תסיסנית melanogaster ^11. מגדל כוח מנצל geotaxis התנהגות שלילית האינסטינקטיבית של זבובים שוב ושוב כדי לגרום טיפוס מהיר. בכל פעם מרים את המכשיר, ולאחר מכן יורד, הפלטפורמה של הזבובים, הזבובים הם המושרה לטפס. זבובים להמשיך להגיב, כל עוד המכשיר הוא במבצע או עד שהם הופכים עייף מכדי להגיב. לכן, החוקר יכול להשתמש במכונה כדי לספק שלאימון imultaneous למספר גדול של זבובים לגיל בהתאמה ו זהים מבחינה גנטית. בנוסף, אנו מתארים מבחני שימושיות הקשורים לעקוב אחר ההתקדמות האורך של הקבוצות לטוס במהלך אימון.

Protocol

1. מגדל כוח התקנה מבצע

1. מגדל כוח ממוקם על פיסת דיקט, כי הוא הידק לטבלה. 4.5 סל"ד המנוע בהילוך מ Grainger מונח על גבי ארבעה 2 "X6" לוחות 1 ¾ אינץ' לוח דיקט. המנוע, בקרת AC / DC מהירות, הפתיל, מתג הפעלה / כיבוי מחווטים יחד לתוך תיבת צומת.
2. כדי לקרר את המנוע, חור בקוטר 3 אינץ' הוא חתך לתוך חתיכת אנכי ½ ס"מ של דיקט. מצד אחד, מאוורר 3 אינץ' מצורף דיקט, ומצד שני, 3 אינץ' מתכת גליל בקוטר מצורף.
3. הזרוע מחוייט מסתובבת עם רולר רכוב על סוף מחובר למנוע. המנוע והזרוע המצורפת לסובב בכיוון השעון, דוחף כלפי מטה צד אחד של המניות כפופה ¾ אינץ' מרובע צינור המחובר דיקט עם ציר הדלת. גלגל מחובר בצד העליון של המניה צינור מתחת הפלטפורמה כדי לאפשר לו להתגלגל על ​​הבמה, כי הוא דירectly מעליו.
4. הזרוע דוחף את בקצה אחד של מניות צינור ומרים סוף ההפוך, העלאת פלטפורמה שתי רמות (1D איור). כאשר הרים את היד מנקה את המניות צינור זה מאפשר הזרוע לחזור למצב ההתחלתי, שומטת את הפלטפורמה למטה (איור 1F).
5. פלטפורמות אלה כוללים מתלים אשר ממוקמות על גבי דיקט ומאובטחת על ידי חבלי בנג'י, כי הם מחוברים אל העיניים בורג. הרציפים להחליק למעלה ולמטה לאורך המחוונים מגירה המצורפים דיקט עם סוגריים.
6. צלוחיות ממוקמות אל המדפים ומאובטחת על ידי מסך רשת רבוע המתקיים במקום עם חבלי בנג'י.
7. כרית קלקר ממוקם מתחת פלטפורמת לשכך את ההלם של ירידה.
8. הכוח של המנוע מותאם כך זמן הסיבוב המלא הוא 15 שניות ארוכות.

2. תרגיל פרוטוקול

1. זבובים הם שוכנו 25 מעלות צלזיוס עם לחות בחממה 50% ו 12 שעות אור / דהRK מחזור. גם פעילות גופנית אימון והערכה של היכולת הגופנית נערכים בחדר 25 ° C בטמפרטורה מבוקרת.
2. זבובים נאספים גיל בהתאמה, בתוך 1-2 ימים זה מזה. מינימום של 240 זבובים נדרש ניטור האורך של geotaxis סיבולת ושליליות (טיפוס) היכולת, שני אינדיקטורים פיזיולוגיים המשקפים את ההשפעות של אימון התעמלות. ניטור האורך מאפשר בידוד השינוי המושרה ביחס ערכי המוצא עבור כל קבוצה, ללא תופעות של בלבול בין קבוצות שונות. זבובים על ניסויים נוספים יש לאסוף לפי הצורך.
3. לאחר איסוף, זבובים מחולקים 120 זבובים הניסוי, אשר יהיה נתון למשטר פעילות גופנית, 120 זבובים הביקורת, אשר לא ניתנות למימוש. הזבובים מאוחסנים בקבוקונים של 20 טס כל אחד. את צלוחיות של זבובים הניסוי מחוברים עם תאית המשרד Flugs אצטט ואת צלוחיות השליטה (אינם יודעים תנועה) זבובים מחוברים עם spo רכהnge פקקים, אשר יכול להידחף למטה כדי לשתק את הזבובים בעת מגדל כוח. הספוג משמש immobilization בגלל הגודל שלה אדפטיבית מאפשר מיקום קל בחלק התחתון של בקבוקון. החומר ספוג רך גם מפחית פציעות שנגרמו על ידי Flugs מוצקים יותר.
4. זבובים על מגדל כוח מאוחסנים שבוצעו בקבוקונים המכילים 5 מ"ל של מזון, אשר מספק להם נחיתה רכה יותר זבובים, כי הם שבוצעו ב בקבוקונים ריקים. המזון מורכב בדרך כלל סוכרוז של 10%, שמרים 10%, ו 2% אגר במים, למרות שאנחנו לא שומרים זבובים לאכול לעיתים קרובות במהלך אימון. אם בקבוקונים ריקים משמשים במהלך האימון, אחוז של זבובים הסובלים מפציעות הוא גדל באופן דרמטי.
5. מגדל כוח מופעל בחדר בטמפרטורה מבוקרת שמתוחזק על 25 ° C. זבובים ניסיוני ממוקמות על מגדל כוח ועשה לטפס. זבובים בקרה ממוקמות גם על מגדל כוח, אבל הפקק ספוג הוא pusheD לתוך בקבוקון כ 3 מ"מ מעל זבובים על מנת להגביל את התנועה. קבוצה זו מהווה שליטה על תופעות של מגדל כוח שאינן קשורות לממש. אמנם עדיין קיים באיזה חדר לזבובים אלה לתמרן, ראינו שוב ושוב כי זבובים בתנאים אלה להפעיל מעט מאוד ולא להפגין התגובה הפיזיולוגית לממש. זה יכול להיות גם רצוי לכלול קבוצת ביקורת נוספת לא מושם על מגדל כוח בכלל.
6. זבובים ימומשו חמישה ימים רצופים בכל שבוע, תוך ניצול לוח הזמנים ramped (איור 2). במהלך שבוע אחד הזבובים ימומשו במשך 2 שעות בכל הפעלה, שבועיים של 2.5 שעות בכל הפעלה, ובשבוע 3 במשך 3 שעות בכל הפעלה. למרות משטרי אחרות נבדקו, פרוטוקול זה מייצר תוצאות עקביות ברחבי גנוטיפים ובתנאים שונות. פרוטוקול זה הוא, לעומת זאת, בכפוף מגוון רחב של וריאציות אפשריות שעשויות להתאים הניסוי בפרט.

1. הגיע הזמן עייפות במהלך פעילות אירובית היא אינדיקטור פיזיולוגי שימושי כדי לאשר ו / או לכמת את היכולת הגופנית של קבוצה נתונה. מבחני עייפות ניתן לבצע longitudinally על קבוצות אשר ישמשו בניסויים אימונים. מבחני יכול להתבצע גם לפני אימון, אחרי סיום פרוטוקול אימון, או שניהם. אחרים נקודות זמן ביניים ניתן להוסיף אם תרשימים התקדמות הדרגתית במהלך האימון הרצוי. Assay עייפות יכולה לשמש גם כדי למדוד את סיבולת גופנית כתגובה לטיפולים אחרים מאשר פרוטוקול אימון, כמו שינוי בתזונה (איור 3 ב).
2. מבחני עייפות צריכה להתנהל ביום שבו האימון לא מתקיים. זבובים הן ניסיוניות ובקרה מונחות על מגדל הכוח בקבוקונים של 20 גרם כל אחד לטפס עד עייף. עייפות מוכרת כישלון להגיב לגירוי geotaxis שלילית עם הטיפוס להיותהודעה פרטית אל AkaMoL. התנהגות עייפות הוא הבקיע ידי תצפית ויזואלית.
3. בקבוקון של זבובים נחשב "עייף", כאשר 5 או פחות זבובים מצליחים לטפס גבוה יותר מ -2 אינץ' ארבע טיפות רצופים. צלוחיות עייף יוסרו מגדל כוח בזמן שהוא עדיין פועל, ואת השעה של הסרת נרשם. הזמנים של הסרת ניתן להתוות כמו היסטוגרמה מקוננת, או מזימה "זמן היציאה כישלון". דוגמה הנתונים להתוות כמו "זמן היציאה כישלון" העלילה מוצגת באיור 3 ב.
4. צלוחיות מנוטרים ב 10 דקות intervals לתקופה מקסימלית של 10 שעות (איור 3 ב).

4. פעילות גופנית, גיל, יכולת של תנועה

1. מאז זה פרוטוקול אימון מסתמך על התנהגות מפעיל המושרה, assay העיקרי quantitating ההשפעות של אימון היא longitudinally למדוד שינוי הממוצע לרוץ במהירות במהלך אימון. במהלך האימון, 120-fly קבוצות של זבובים אינם יודעים תנועה שבוצעו ו נבדקים מדי יום על תגובתם geotaxis שלילית שלtimulus. הטכניקה טבעת המתואר Gargano et al. (2005) משמש כדי למדוד יכולת טיפוס של ¹² זבובים. בקצרה, טכניקה זו מודדת גובה הממוצע עלה ב בקבוקון של זבובים בתקופה מוגדרת לאחר גיוס של geotaxis שליליות. גובה טיפס במהלך הזמן המוגדר שווה לטפס במהירות. המדידות מבוצעות לפני הצבת זבובים במחשב לאימונים מדי יום, כדי למנוע סיבוכים מעייפות אחרי ריצה של יום.
2. בפרוטוקול הסטנדרטי שלנו, זבובים ימומשו עבור סכום כולל של שלושה שבועות ויכולת טיפוס נבחן עבור סכום כולל של חמישה שבועות: שלושה שבועות במהלך אימון כושר, שבועיים לאחר הפסקת פעילות גופנית (איור 2). זה מאפשר הניסוי להתוות אם ההשפעות של פעילות גופנית על ניידות נמשכות לאחר הפסקת התוכנית.
3. ארבע תמונות של ביצועים טבעת היומי של כל קבוצה משמשים לניתוח טיפוס היכולת. שש צלוחיות כלולים כל צילום. גרם שליליeotaxis מושרה, ושימוש במצלמה מתוזמן, צילום נלקח לאחר מספר מוגדר של שניות. אנו משתמשים בדרך כלל שתי שניות, אם כי זה יכול להיות מגוונים בהתאם לתנאי הניסוי. עבור כל תמונה, כל בקבוקון מחולק לארבעה רבעים של גובה שווים, תוכנת עיבוד התמונה משמש להקצות לכל זבוב ציון על סמך ברבע הגיע בתוך פרק הזמן המוקצב. זבובים לטפס ברבע העליון שקיבל ציון של 4, עף ברבע הגבוה ביותר הבא לקבל 3, עפה ברבע השני הגבוה ביותר לקבל 2, וזבובים ברבע הנמוך ביותר לקבל 1. זבובים לא לטפס מעל לתחתית כלל מקבלים ציון של 0.
4. עבור כל בקבוקון בצילום נתון, "המדד לטפס" נוצר על ידי חישוב ממוצע הציונים של כל הזבובים בבקבוקון זה. המדדים של כל הצנצנת מתוך ארבעת התצלומים הם ממוצעים ואז לתת מדד טיפוס הסופית לאותו היום.
5. כל הניסויים נערכים geotaxis שליליות longitudinally. התוצאות מנורמל כדי ציון הראשוני "לפני פעילות גופנית" על מנת לצמצם את ההשפעה של השינוי קבוצה בטיפוס היכולת לסמן את שינוי האורך היחסי ביכולת טיפוס של המחזור כתוצאה של אימון התעמלות. ציון הראשוני נקבע על ידי הממוצע של מדדי המטפסים הראשונים שלושה ימים מקבל ערך של 1. בניסויים הבאים באים לידי ביטוי אז כאחוז המדד הראשוני.

5. נציג תוצאות

Wild-type זבובים להגיב פרוטוקול סיבולת עם ירידה הקשורה לגיל פחתה בטיפוס היכולת כי נמשכת לאחר סיום האימון, כפי שהיא משתקפת מבחני טבעת האורך על פני חמישה שבועות בגיל (איור 3 א). ירידה זו מאוחרת ב geotaxis שליליות היא תגובה פנוטיפי הרגיל יכול לשמש בקרה חיובית על מנת להבטיח כי wild-type בתגובה התרגיל מתרחש בדרך כלל. סט נתונים זה מוצג כדוגמה כיצדאינדוקציה של פעילות גופנית על ידי תוכנית מגדל כוח יכול לשמש כקלט התנהגותי. היכולת של גורמים גנטיים או סביבתיים שונים על מנת לווסת את האפקט הזה אז יכול להיות מוערך.

לעומת זאת, מגדל חשמל יכול לשמש גם פלט בעיצובים ניסיוניים שונים. כך, למשל, גנוטיפ דיאטה, או תנאים אחרים יכולים להיות מגוונים. אם כן, ההשפעה של אלה וריאציות על פעילות גופנית ופיזיולוגיה ניתן לבדוק באמצעות מגדל כוח. כאן, אנו מציגים דוגמה של גישה זו. כאשר טס עם אחוז שונה של סוכרוז בדיאטה שלהם נבדקו בפעם לתוכן, עייפות מוגברת סוכרוז בקורלציה עם כושר סיבולת גבוה (איור 3 ב).

באיור 1. מבצע של מגדל כוח. (AC) הזרוע כפוף ממונע עם רולר המצורפת מסתובב עם כיוון השעון עד שהוא בא במגע עם צינור מכופף מרובע. (D, E)הזרוע דוחף על צינור מרובע כפוף, גורם פלטפורמה עמוס צלוחיות של זבובים להרים. (F) כזרוע מנקה את הצינור פלטפורמת מותר לרדת למטה, מה שאילץ הזבובים לחזור לתחתית בקבוקון.

איור 2. הציע פרוטוקול פעילות גופנית. עף נתון פרוטוקול אימון עשויים לממש במשך חמישה ימים בכל שבוע תחת משטר של שלושה שבועות ramped ארוך מגדיל בהדרגה את משך הזמן של פעילות גופנית מ 2 שעות הראשונות של 30 דקות מדי שבוע. ניתוחים רגילים כוללים מבחני עייפות לפני ואחרי תוכנית האימון מבחני הטבעת שבוע 1 עד שבוע 5. מבחני כל מבוצעות בשני עותקים על מספר שווה של זבובים אינם יודעים תנועה כביקורת שלילית. אחרים בדיקות פיזיולוגיות או ביוכימי שונים ניתן לבצע כפי שנקבע על ידי החוקר.

איור 3. פעילות אירובית משנה היבטים רבים של ניידות. (א) ביצעו מבחני טבעת longitudinally פני הדורות בזוג אחד של גברים-Y ^{1 וואט 67C23} הקבוצות. גיל בהתאמה, זהים מבחינה גנטית למימוש וזבובים שליטה אינם יודעים תנועה נמדדו מדי יום עבור מהירות טיפוס ממוצעת. התוצאות באות לידי ביטוי במונחים של המדד לטפס, כי הוא תקין לגובה הטיפוס הממוצע על פני שלושת הימים הראשונים של המדידה. תרגיל מאומנים זבובים להציג ירידה מצומצמת הקשורות לגיל ביכולת geotaxis שלילית בהשוואה לגיל בהתאמה אחים אינם יודעים תנועה ברחבי הגילאים (2-way ANOVA, p <0.005). (ב) מבחני עייפות שנערך במשך 8 שעות גיל בהתאמה זבובים נקבה S השוויצרים מראים השפעה משמעותית של תוכן סוכרוז תזונתיים בזמן עייפות (Log-דרגה, p <0.0001). לפני הניסוי, זבובים הואכלו בדיאטה שמרים / סוכרוז / אגר, עם משקל של 10% / נפח yeaריכוז רחוב, ואחוז משתנה של סוכרוז תזונתיים. חמישה בקבוקונים של 20 זבובים כל אחד נבדקו עבור כל דיאטה. הגרף מציג כמה צלוחיות רבות עדיין יש חמישה או יותר זבובים פועל בנקודת זמן נתונה. תוצאות אלו ניתן לטפל סטטיסטית וגם מבחינה גרפית כמו הישרדות (או זמן אי) עקום, עם "אי" של הבקבוקון להיות מוגדר כנקודה בזמן שבה פחות מחמש זבובים להמשיך להגיב לגירוי geotaxis שלילית. שים לב, הרבה עיצובים אחרים המחקר האפשריים וטיפולים סטטיסטיים אפשריים, ונתונים טיפול ומדידה צריך להיות מותאם כך שיתאים לצרכים האישיים.

Discussion

פרוטוקול הכללי שהוצג הצליחה לתעד השפעות פיזיולוגיות לאחר אימון. עם זאת, בכמה תחומים בפרוטוקול זה, כפופים לשינוי כדי שיתאים לצרכים ניסיוניים מסוימים. לדוגמה, אורך האימון ומספר התקפי עלול להיות מגוונים כדי להפוך את התוכנית פחות או יותר מאתגר, לפי הצורך. גובה של מיכל שבו היכולת geotaxis שלילית נמדדת אפשר לשנות כדי להגדיל את השטח המיועד לשיפור להיות מתועד. שיטות שונות של אוטומציה quantitation של טיפוס מהיר יכול להיות גם ישים. בעיקרון, כל תוכנית תוכנה המסוגלת להבחין זבוב מרקע ניתן להשתמש כדי להאיץ את תהליך איסוף הנתונים.

היבטים מסוימים של הפרוטוקול צריך להיות שונה רק בזהירות רבה, עם זאת. כך, למשל, ניסויים ראשוניים מצביעים על כך בתוקף לפחות יום אחד של מנוחה בשבוע נוטה להקל הופעות גדול יותרovement יותר פעילות גופנית מדי יום בלתי נלאה. בנוסף, קצב היממה וטמפרטורה ידועים משפיעים על תנועת בעלי חיים בעלי דם קר. זמן של יום האימונים יתקיים יכולים להיות מגוונים, אבל תמיד צריך להיות עקבי בתוך קבוצות מסוימות תחת השוואה, על מנת למנוע את האפשרות של תופעות בלבול של מקצבים היממה. בקרת טמפרטורה היא גם חיונית, ומומלץ חדר ייעודי בטמפרטורה קבועה לציוד תרגיל הבית. לבסוף, זכרים ונקבות יש גודלו נמדד בנפרד, כדי למנוע את הפוטנציאל של תופעות של בלבול ההבדלים פריון ומין של היכולת הגופנית.

יישומים אפשריים של מתודולוגיה זו מוגבלת רק על ידי הדמיון של החוקר. בעבודה ראשונית, יש לנו שימוש במתודולוגיה זו בשלושה יישומים רחב:

1. כדי למדוד את ההשפעה של פעילות אירובית על היבטים שונים של הביולוגיה סוג פרועה ברחבי הגילאים.
2. Tהו למדוד את ההשפעה של פעילות אירובית על פנוטיפים מוטנטים ספציפיים.
3. למסך עבור גורמים גנטיים הדרושים לבצע את היתרונות של פעילות גופנית

כל היישומים הללו מקיף מגוון רחב של אפשרויות מסוימות. בהתבסס על הניסיון הראשוני שלנו, פנוטיפים מוטנטים נוטים להשתנות עם רמת פעילות גופנית כמה שהם משתנים עם דיאטה. השימוש בדגמים חסרי חוליות כדי להבין טוב יותר את הקשר בין פעילות גופנית דיאטה, ופיזיולוגיה ההזדקנות הוא אולי היישום הכללי החשוב ביותר של פרוטוקול זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dayton Gearmotor	Grainger	1LRA6A
Raco Electrical Box	Grainger	5A052
Raco Cover	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Fuse	Grainger	6F043
Cooper Bussmann Fuse Holder	Grainger	1DD33
Carling Technologies Switch	Grainger	2X464
Dayton Control, AC/DC Speed	Grainger	4X796
Flugs for Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102