Protocolo de treinamento de resistência e Ensaios de desempenho longitudinal para Drosophila melanogaster

Summary

Nós descrevemos o protocolo primeiro treinamento de resistência para um importante modelo genético de espécies,

Abstract

Um dos problemas mais prementes das modernas pesquisas médicas são os níveis de afluência de obesidade, com o conseqüente aumento nas doenças associadas, como diabetes e doenças cardiovasculares ^1-3. Um tópico importante de investigação sobre esses problemas de saúde associados envolve o papel do exercício de endurance como uma intervenção benéfica.

O exercício físico é um barato, a intervenção não-invasiva com vários resultados benéficos, incluindo redução no excesso de gordura corporal ^4, aumento da sensibilidade à insulina em músculo esquelético ^5, aumentou respostas anti-inflamatórias e antioxidantes ⁶ e capacidade contrátil melhor em cardiomiócitos ^7. Exercício de baixa intensidade é conhecido por aumentar a actividade mitocondrial e biogénese em humanos e ratinhos ^8, com a coativador transcricional PGC1-α como um intermediário importante ^9,10.

Despite a importância do exercício como um instrumento para combater a vários importantes doenças relacionadas à idade, extensivos estudos longitudinais genéticas têm sido dificultado pela falta de um protocolo de treinamento de resistência por algumas espécies de vida curta modelo genético. A variedade de ferramentas genéticas disponíveis para uso com Drosophila, juntamente com a sua manutenção e vida útil curta barata, torná-lo um modelo atraente para um estudo mais aprofundado destes mecanismos genéticos. Com isto em mente, desenvolvemos um novo aparelho, conhecido como a torre de energia, em larga escala exercício de treinamento em Drosophila melanogaster ^11. A torre de energia utiliza o comportamento das moscas geotaxis instintivo negativo para induzir repetidamente escalada rápida. Cada vez que os elevadores da máquina, em seguida, cai, a plataforma de moscas, as moscas são induzidos a subir. Moscas continuar a responder, enquanto a máquina está em funcionamento ou até que se tornem demasiado fatigado para responder. Assim, o pesquisador pode utilizar essa máquina para fornecer streinamento imultaneous a um grande número de moscas pareados por idade e geneticamente idênticas. Além disso, descrevemos ensaios associados úteis para acompanhar o progresso longitudinal das coortes mosca durante o treinamento.

Protocol

1. Instalação e Operação Power Tower

1. A torre de energia é colocado sobre uma peça rectangular de contraplacado que é fixada a uma tabela. A 4,5 engrenagem rpm do motor de Grainger repousa em cima de quatro 2 "x6" tábuas e uma placa de madeira compensada de ¾ de polegada. O motor, um controle de velocidade AC / DC, um fusível e uma chave liga / desliga estão ligados entre si em uma caixa de junção.
2. Para resfriar o motor, um buraco de 3 polegadas de diâmetro é cortado em uma peça vertical ½ polegada de madeira compensada. Por um lado, um ventilador de 3 polegadas está ligado ao contraplacado, e por outro lado, um de 3 polegadas de diâmetro do cilindro de metal está ligado.
3. Um braço feito por medida com um rolo rotativo montado na extremidade está ligada ao motor. O motor eo braço ligado girar no sentido horário, empurrando de um lado de um estoque de tubo dobrado ¾ polegada quadrada que está ligado à madeira compensada com uma dobradiça de porta. Uma roda está ligado ao lado de topo do material do tubo abaixo da plataforma para permitir que ele rolo contra a plataforma que é dirrectamente acima dela.
4. O braço empurra para baixo sobre uma extremidade do tubo de estoque e levanta a extremidade oposta, levantando uma plataforma de dois níveis (Figura 1D). Quando o rolo sobre o braço limpa o estoque tubo que permite o retorno do braço para a posição de partida, soltando a plataforma de volta para baixo (Figura 1F).
5. As plataformas consistem em racks que são colocados no topo de madeira compensada e fixado por cabos elásticos que são enganchadas olhos de parafuso. As plataformas de deslizar para cima e para baixo ao longo sliders gaveta que estão ligados à madeira compensada com colchetes.
6. Os frascos são colocados nas prateleiras e protegido por uma tela grade quadrada que é realizada no local com cordas elásticas.
7. Uma almofada de isopor é colocado embaixo da plataforma para amortecer o choque da queda.
8. A potência do motor é ajustada de tal modo que um período total de rotação é de 15 segundos de duração.

2. Protocolo de exercício

1. As moscas são alojados em um 25 ° C incubadora com 50% de humidade e uma luz de 12 horas / daciclo rk. Tanto o treinamento físico e avaliação da capacidade de exercício são realizadas em uma sala de 25 ° C com temperatura controlada.
2. As moscas são recolhidos e idade combinados dentro de 1-2 dias de cada outro. Um mínimo de 240 moscas é necessária para o acompanhamento longitudinal de geotaxis resistência e negativos (subida) de habilidade, dois indicadores fisiológicos que refletem os efeitos do treinamento físico. Acompanhamento longitudinal permite o isolamento de mudança induzida em relação aos valores iniciais para cada coorte, sem efeitos de confusão de variação entre as coortes. Moscas para experimentos adicionais devem ser recolhidos, conforme necessário.
3. Após a recolha, as moscas são divididos em 120 moscas experimentais, os quais serão submetidos ao regime de exercício, e 120 moscas de controlo, que não vai ser exercida. As moscas são armazenadas em frascos de 20 moscas cada. Os frascos de moscas experimentais estão conectados com Flugs empresa de acetato de celulose e os frascos de controle (unexercised) moscas estão conectados com spo maciorolhas ESL, os quais podem ser empurradas para baixo para imobilizar as moscas, enquanto na torre de energia. Esponja é usado para a imobilização, porque o seu tamanho adaptativa permite uma fácil colocação perto do fundo do frasco. O material mais macio esponja também reduz os danos causados ​​pelas Flugs mais sólidos.
4. Moscas sobre a torre de energia são armazenadas e exercido em frascos que contêm 5 mL do alimento, que lhes proporciona um suave pouso de moscas que são exercidas em frascos vazios. O alimento é tipicamente composto por sacarose a 10%, 10% de levedura, e agar a 2% em água, embora não se observa moscas para comer, muitas vezes durante o curso de uma sessão de treino. Se frascos vazios são utilizados durante a formação, a percentagem de moscas que sofrem de lesões é dramaticamente aumentada.
5. A torre de energia é operado numa sala com temperatura controlada que é mantida a 25 ° C. Moscas experimentais são colocados sobre a torre de energia e fez subir. Moscas de controle também são colocados na torre de energia, mas a rolha de esponja é pushed para baixo para dentro do frasco de aproximadamente 3 mm acima das moscas, a fim de limitar o movimento. Este grupo serve como um controle para todos os efeitos da torre de energia que não estão relacionados ao exercício. Apesar de algum espaço ainda existe para estas moscas de manobra, temos observado repetidamente que as moscas sob estas condições executar muito pouco e não demonstram uma resposta fisiológica ao exercício. Pode também ser desejável incluir um grupo de controlo adicional que não é colocada sobre a torre de energia de todo.
6. As moscas são exercidos cinco dias consecutivos cada semana, utilizando uma programação em rampa (Figura 2). Durante uma semana as moscas são exercidas por 2 horas por sessão por semana, dois para 2,5 horas por sessão, e três semanas para 3 horas por sessão. Embora outros regimes foram testados, este protocolo produz resultados consistentes em genótipos e sob condições diferentes. Este protocolo é, no entanto, sujeitas a uma ampla gama de variações possíveis que possam atender uma experiência particular.

1. Hora de fadiga durante o exercício de resistência é um indicador útil fisiológico para confirmar e / ou quantificar a capacidade de exercício de uma determinada coorte. Os ensaios de fadiga pode ser realizada longitudinalmente sobre coortes que serão utilizados em experiências de formação. Ensaios podem ser realizados, quer antes da formação, após a conclusão do protocolo de formação, ou ambos. Outros momentos intermediários podem ser adicionados se traçar o progresso incremental durante o treinamento é desejada. O ensaio de fadiga pode também ser usado para medir a resistência do exercício como uma resposta a outros tratamentos do que o protocolo de formação, tais como alteração dieta (Figura 3B).
2. Ensaios de fadiga deve ser conduzida em um dia quando o treinamento não está ocorrendo. Tanto o moscas experimentais e de controlo são colocados sobre a torre de energia em frascos de 20 cada um e feito subir até desgastado. A fadiga é reconhecida como a falta de resposta a um estímulo negativo com a escalada geotaxis sercomportamento. Comportamento à fadiga é pontuada pela observação visual.
3. Um frasco de moscas é considerado "cansado" quando 5 ou menos moscas são capazes de subir mais de 2 centímetros por quatro quedas consecutivas. Frascos fadiga são removidos da torre de energia ao mesmo tempo que ainda está em funcionamento, eo tempo de remoção é gravado. Tempos de remoção podem ser representados como um histograma aninhada, ou como um "tempo até a falha" enredo. Um exemplo dos dados plotados como um "tempo até a falha" trama é mostrada na Figura 3B.
4. Os frascos são monitorizados a intervalos de 10 minutos para um máximo de 10 horas (Figura 3B).

4. Da capacidade de exercício, à Idade e Locomotor

1. Uma vez que este protocolo de treinamento se baseia no comportamento executando induzido, um ensaio preliminar para quantificar efeitos do treinamento é longitudinalmente medir a mudança na velocidade média de corrida durante o treino. Durante o curso de formação, 120-mosca coortes de moscas exercitados e unexercised são testados diariamente para a sua resposta a um negativo geotaxis stimulus. A técnica descrita no ANEL Gargano et al. (2005) é usado para medir a capacidade das moscas escalar ^12. Resumidamente, esta técnica mede a altura média escalada por um frasco de moscas durante um tempo definido após a indução da geotaxis negativos. A altura subiu durante um tempo definido é equivalente a escalada de velocidade. As medições são realizadas antes de colocar na máquina de moscas para a formação diária, de modo a evitar as complicações de fadiga após longo do dia.
2. No nosso protocolo padrão, as moscas são exercidas por um total de três semanas e capacidade de escalada é examinada para um total de cinco semanas: três semanas durante o exercício de formação e de duas semanas após a cessação do exercício (Figura 2). Isto permite que o experimentador para traçar se os efeitos de exercício sobre a mobilidade persistir após a cessação do programa.
3. Quatro fotografias de desempenho de cada coorte ANEL diariamente são usados ​​para a análise da capacidade de escalada. Seis frascos são incluídos em cada fotografia. G Negativoeotaxis é induzida, e usando uma câmara temporizado, uma fotografia é tirada após um número definido de segundos. Nós normalmente usam dois segundos, embora este possa ser variado dependendo das condições experimentais. Para cada fotografia, cada frasco é dividido em quatro quadrantes de igual altura, e software de processamento de imagem é usada para atribuir a cada mosca uma pontuação baseada no quadrante chegou dentro do prazo estipulado. Moscas que sobem para o quadrante superior recebem uma pontuação de 4, voa no quadrante mais elevado seguinte recebe a 3, voa no quadrante segundo maior receberá a 2, e as moscas no menor quadrante receber um 1. As moscas que não escalar fora do fundo em todos recebem uma pontuação de 0.
4. Para cada frasco em uma dada fotografia, um "índice de escalada" é gerado pela média das pontuações de todas as moscas nesse frasco. Índices de cada frasco a partir dos quatro fotografias se então a média para dar um índice de escalada final para esse dia.
5. Todos os experimentos são conduzidos geotaxis negativos longitudinaldinally. Os resultados são normalizados para a inicial "pré-exercício" pontuação a fim de reduzir o efeito da variação na capacidade de escalada coorte e realçar a mudança relativa longitudinal da capacidade de escalada de uma coorte como o resultado da formação de exercício. A pontuação inicial é determinada pela média dos índices os três primeiros dias de escalada e é atribuído um valor de 1. Ensaios subsequentes são então expressos como uma percentagem do índice inicial.

5. Os resultados representativos

Tipo selvagem moscas responder a um protocolo de resistência com uma diminuição relacionada com a idade reduzida em capacidade de escalada, que persiste após o fim do treinamento, como refletido nos ensaios ANEL longitudinal ao longo de cinco semanas de idade (Figura 3A). Esta descida retardada em geotaxis negativos é um padrão de resposta fenotípica que pode servir como um controlo positivo para assegurar que a resposta de tipo selvagem exercício está ocorrendo normalmente. Este conjunto de dados é apresentado como um exemplo de como oindução de exercício pelo programa torre de energia pode ser utilizada como uma entrada comportamental. A capacidade de vários factores genéticos ou ambientais que modulam este efeito pode então ser avaliado.

Inversamente, a torre de energia pode também ser usado como uma saída em vários modelos experimentais. Por exemplo, a dieta do genótipo, ou outras condições pode ser variada. Em seguida, o efeito destas variações na fisiologia do exercício pode ser testado usando o torre de energia. Aqui, vamos mostrar um exemplo desta abordagem. Quando as moscas com uma percentagem variando de sacarose nas suas dietas foram testadas para o tempo para a fadiga teor de sacarose, aumento correlacionada com a capacidade de resistência aumentada (Figura 3B).

Figura 1. Operação da torre de energia. (AC) O braço curvado motorizado com rolo acoplado gira no sentido horário, até que entra em contacto com o tubo dobrado quadrado. (D, E) Abraço empurra para baixo sobre o tubo dobrado quadrado, fazendo com que a plataforma que é carregado com frascos de moscas para levantar. (F) À medida que o braço limpa o tubo a plataforma é deixado cair de volta para baixo, forçando as moscas para retornar para o fundo do frasco.

Figura 2. Sugerida protocolo de exercício. Voa submetido ao protocolo de formação são feitas para exercer durante cinco dias por semana sob um regime de três semanas longo rampa que aumenta progressivamente a duração do exercício das inicial de 2 horas por 30 minutos em cada semana. Análises padrão incluem ensaios de fadiga antes e após o programa de exercícios e ensaios de ANEL de semana de 1 a 5 semanas. Todos os ensaios são realizados em duplicado em um número igual de moscas não exercidas como um controlo negativo. Outros vários testes fisiológicos ou bioquímica pode ser conduzida como determinado pelo investigador.

Figura 3. Exercícios de resistência altera vários aspectos da mobilidade. (A) DE ANEL ensaios realizados longitudinalmente em idades em um único par de anos Masculino ¹ W ^67C23 coortes. Pareados por idade, geneticamente idênticos exercido e moscas de controle não exercidas foram medidos diariamente para a velocidade escalar média. Os resultados são expressos em termos de um índice de escalada que é normalizado para a altura média subir através dos primeiros três dias de medição. Exercício treinados moscas exibido um declínio age-related diminuição na capacidade geotaxis negativo em comparação com pareados por idade irmãos exercitada em toda as idades (2-way ANOVA, p <0,005). (B) os ensaios de fadiga realizados por 8 horas sobre a idade-pareado moscas fêmeas Canton S mostram um efeito significativo do teor de sacarose na dieta sobre o tempo de fadiga (Log-rank, p <0,0001). Antes da experiência, as moscas foram alimentados com uma dieta de levedura sacarose / / ágar, com 10% do peso / volume simconcentração r, e uma percentagem variando de sacarose dietética. Cinco frascos de 20 moscas cada foram testados para cada dieta. Gráfico mostra quantos frascos ainda tem cinco ou mais moscas rodando em um ponto determinado momento. Estes resultados podem ser tratados estatisticamente e graficamente como uma sobrevivência (ou tempo até a falha) curva, com o "fracasso" de um frasco a ser definido como um momento em que menos de cinco moscas continuam a responder a estímulos geotaxis negativo. Note-se que muitos outros desenhos de estudo possíveis e tratamentos estatísticos são possíveis, e tratamento de dados e de medição devem ser adaptados para atender objetivos individuais.

Discussion

O protocolo geral aqui apresentado tem sido bem sucedida em documentar efeitos fisiológicos após o treinamento. No entanto, diversas áreas deste protocolo estão sujeitos a modificações para se adequar às necessidades particulares experimentais. Por exemplo, o comprimento de formação eo número de ataques poderia potencialmente ser variado para tornar o programa mais ou menos exigente, como desejado. A altura do recipiente no qual a capacidade geotaxis negativo é medido pode ser alterado para aumentar a área disponível para a melhoria a ser documentada. Vários métodos de automatizar a quantificação da escalada de velocidade pode também ser aplicável. Em princípio, qualquer programa de software capaz de distinguir uma mosca de fundo pode ser usado para acelerar o processo de coleta de dados.

Alguns aspectos do protocolo deve ser modificado apenas com muita cautela, no entanto. Por exemplo, experiências preliminares indicam fortemente que pelo menos um dia de descanso por semana tende a facilitar uma maior improvement de exercício diário incansável. Além disso, os ritmos circadianos ea temperatura são conhecidos por afetar o movimento de animais de sangue frio. O tempo do dia em que ocorre a formação pode ser variado, mas deve sempre ser consistente dentro de determinados grupos sob comparação, a fim de evitar a possibilidade de efeitos de confusão dos ritmos circadianos. O controle da temperatura também é essencial, e recomendamos uma sala dedicada a uma temperatura constante para a casa de equipamentos de exercício. Finalmente, os machos e fêmeas devem ser criados e medidos separadamente, a fim de evitar o potencial de efeitos de confusão de fertilidade e sexo diferenças na capacidade de exercício.

As aplicações potenciais desta metodologia são limitadas apenas pela imaginação do pesquisador. Em trabalho preliminar, que têm utilizado esta metodologia em três amplas aplicações:

1. Para medir o efeito do exercício de endurance sobre vários aspectos da biologia de tipo selvagem de toda as idades.
2. Tó medir o efeito do exercício de endurance sobre específicas fenótipos mutantes.
3. Para filtrar por fatores genéticos, que são necessárias para executar os benefícios do exercício

Cada uma destas aplicações abrange uma grande variedade de possibilidades específicas. Com base em nossa experiência preliminar, fenótipos mutantes tendem a variar com o nível de exercício, tanto como eles variam com a dieta. O uso de modelos invertebrados para entender melhor a relação entre dieta, exercício e fisiologia do envelhecimento é talvez a mais importante aplicação geral do presente protocolo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dayton Gearmotor	Grainger	1LRA6A
Raco Electrical Box	Grainger	5A052
Raco Cover	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Fuse	Grainger	6F043
Cooper Bussmann Fuse Holder	Grainger	1DD33
Carling Technologies Switch	Grainger	2X464
Dayton Control, AC/DC Speed	Grainger	4X796
Flugs for Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102