Udholdenhedstræning protokollen og Langsgående ydeevne Analyser for Drosophila melanogaster

Summary

Vi beskriver den første udholdenhedstræning protokol for en vigtig genetisk model arter,

Abstract

Et af de mest presserende problemer moderne medicinske forskere er den kraftigt stigende niveauer af fedme, med den deraf følgende stigning i associerede lidelser som diabetes og hjerte-kar-sygdom ^1-3. Et vigtigt emne for forskning i disse tilknyttede sundhedsproblemer indebærer rolle udholdenhedstræning som en gavnlig intervention.

Træning er en billig, non-invasive indgreb med flere gavnlige resultater, herunder reduktion i overskydende kropsfedt ^4, øget insulinfølsomhed i skeletmuskulatur ^5, øget anti-inflammatoriske og antioxidative reaktioner ^6, og forbedret kontraktile kapacitet i cardiomyocytes ^7. Lav intensitet øvelse vides at forøge mitokondrielle aktivitet og biogenese i mennesker ⁸ og mus med transkriptions-coaktivator PGC1-α som et vigtigt mellemprodukt ^9,10.

Despite vigtigheden af ​​motion som et redskab til bekæmpelse af flere vigtige aldersrelaterede sygdomme, har omfattende langsgående genetiske undersøgelser blevet hæmmet af manglen på en udholdenhedstræning protokol for en kort levetid genetiske model arter. De mange forskellige genetiske værktøjer til rådighed til brug med Drosophila og sammen med sin korte levetid og billig vedligeholdelse, gør det til en attraktiv model for yderligere undersøgelse af disse genetiske mekanismer. Med dette i tankerne har vi udviklet et nyt apparat, kendt som Power Tower, til stor skala motion-uddannelse i Drosophila melanogaster ^11. Power Tower udnytter fluers instinktive negativ geotaxis adfærd gentagne inducere hurtig klatring. Hver gang maskinen elevatorer, og derefter falder, den platform af fluer, er fluerne induceres til at klatre. Fluer fortsætte med at reagere, så længe maskinen er i drift, eller indtil de bliver for trætte til at reagere. Således kan forskeren bruge denne maskine til at give simultaneous uddannelse til et stort antal af samme alderskategori og genetisk identiske fluer. Derudover beskriver vi tilknyttede analyser nyttige at spore langsgående forløb flyve kohorter under træningen.

Protocol

1. Power Tower opsætning og betjening

1. Power Tower er placeret på et rektangulært stykke krydsfiner, der er fastspændt på et bord. En 4,5 rpm gear motor fra Grainger hviler på toppen af ​​fire 2 "x6" bestyrelser og en ¾ tomme krydsfiner. Den motor, en AC / DC hastighedskontrol, en lunte, og en on / off-kontakt er koblet sammen i et tidspunkt kasse.
2. At afkøle motoren, er der et hul 3 inches i diameter skåret i en vertikal ½ inch stykke krydsfiner. På den ene side er en 3 inch ventilator fastgjort til krydsfiner, og på den anden side en 3 inch diameter metalcylinder fastgjort.
3. En specialfremstillet roterende arm med en rulle monteret på enden er forbundet til motoren. Motoren og fastgjort arm roterer i retning med uret, presser ned ene side af en bøjet ¾ inch kvadratisk rør lager, der er fastgjort til krydsfiner med en dør hængsel. Et hjul er fastgjort til oversiden af ​​det rørformede materiale under platformen for at gøre det muligt at rulle mod platformen, der er directly ovenover.
4. Armen presser ned på den ene ende af det rørformede materiale og løfter den modsatte ende, hæve en to-niveau platform (figur 1D). Når valsen på armen rydder røret bestand den tillader armen at vende tilbage til startpositionen, falder platformen ned (fig. 1F).
5. Platformene består af stativer, der er placeret på toppen af ​​krydsfiner og sikret ved bungee snore, der hægtes på skrue øjne. De platforme glide op og ned langs skuffe skydere, der er knyttet til krydsfiner med beslag.
6. Hætteglas anbringes i stativerne og sikret ved et kvadrat gitter skærm, der holdes på plads med bungee snore.
7. En Styrofoam pude er placeret under platformen til at dæmpe stød af dråben.
8. Effekten af ​​motoren indstilles således, at en fuld tidsenhed er 15 sekunder lange.

2. Motion protokol

1. Fluer er anbragt i et 25 ° C inkubator med 50% fugtighed og 12 timers lys / mørke-cyklus. Both træning og vurdering af motion kapacitet foregår på en 25 ° C temperatur-kontrolleret rum.
2. Fluer indsamles og alder-matchede indenfor 1-2 dage efter hinanden. Et minimum af 240 fluer er nødvendig for langsgående overvågning af udholdenhed og negativ geotaxis (klatring) evne, to fysiologiske indikatorer, som afspejler effekten af ​​træning. Langsgående overvågning giver mulighed for isolering af induceret ændring i forhold til startværdier for hver kohorte, uden forstyrrende effekter fra variation mellem kohorter. Fluer til yderligere forsøg bør indsamles efter behov.
3. Efter opsamlingen, er fluer opdelt i 120 eksperimentelle fluer, der vil blive udsat for den øvelse regime, og 120 kontrol fluer, som ikke vil blive udnyttet. De fluer gemmes i hætteglas af 20 flyver hver. De hætteglas med eksperimentelle fluer er sluttet med faste celluloseacetat Flugs og hætteglas af kontrol (Uudnyttede) fluer er tilsluttet med blød svamp propper, wVILKEN kan skubbes ned til immobilisere fluer mens de er på Power Tower. Svamp anvendes til immobilisering, fordi dens adaptive størrelse tillader let anbringelse i nærheden af ​​bunden af ​​hætteglasset. Den blødere svamp materiale reducerer også skader forårsaget af de mere solide Flugs.
4. Fluer på Power Tower gemmes og udøves i hætteglas, der indeholder 5 ml af mad, der giver dem en blødere landing end fluer, der udøves i tomme hætteglas. Maden er typisk sammensat af 10% saccharose, 10% gær, og 2% agar i vand, selvom vi ikke overholder fluer at spise ofte i løbet af en træningssession. Hvis tomme hætteglas anvendes under træningen, er den procentdel af fluer, der lider skader steget voldsomt.
5. Power Tower drives i et temperaturstyret rum, der holdes ved 25 ° C. Eksperimentelle fluer er placeret på Power Tower, og gjort at klatre. Kontrol fluer er også placeret på Power Tower, men svampen proppen skubbes ned i vial cirka 3 mm over fluerne for at begrænse bevægelse. Denne gruppe fungerer som en kontrol for eventuelle effekter af Power Tower, som er relateret til at udøve. Selv om nogle plads eksisterer stadig for disse fluer til at manøvrere, har vi gentagne gange observeret, at fluer under disse betingelser køre meget lidt og ikke har godtgjort en fysiologisk reaktion på træning. Det kan også være ønskeligt at inkludere en ekstra kontrolgruppe, der ikke er placeret på Power Tower overhovedet.
6. Fluer udøves fem på hinanden følgende dage hver uge under anvendelse af en skrånende plan (fig. 2). I løbet af ugen en fluerne udøves i 2 timer per session, uge ​​to i 2,5 timer per session, og uge tre i 3 timer per session. Selv om andre regimer er blevet testet, denne protokol giver ensartede resultater over hele genotyper og under forskellige forhold. Denne protokol er dog underlagt en bred vifte af mulige variationer, der kan passe til et bestemt eksperiment.

3. Motion og Bevægelsesaktivitet Træthed

1. Tid til træthed under udholdenhedstræning er en nyttig fysiologisk indikator for at bekræfte og / eller kvantificere arbejdskapacitet af en given kohorte. Træthed assays kan udføres i længderetningen på grupper, der anvendes i træning forsøg. Assays kan udføres enten forud for træning, efter færdiggørelse af træning protokol, eller begge dele. Andre mellemliggende tidspunkter kan tilføjes, hvis kortlægge større fremskridt under træningen ønskes. Den træthed Assayet kan også anvendes til at måle udøvelsen udholdenhed som reaktion på behandling bortset fra træning protokol, såsom diæt ændring (figur 3B).
2. Træthed analyser bør gennemføres på en dag, hvor uddannelsen ikke finder sted. Både eksperimentelle og kontrol fluer er placeret på Power Tower i hætteglas af 20 hver og gjorde at klatre indtil trætte. Træthed er anerkendt som den manglende reaktion på en negativ geotaxis stimulus med klatring adfærd. Træthed behavior er evalueret ved visuel observation.
3. Et hætteglas af fluer anses for at være "trætte", når 5 eller færre fluer er i stand til at klatre højere end 2 inches i fire på hinanden følgende dråber. Trætte hætteglas fjernes fra Power tårnet, medens den stadig er i drift, og tidspunktet for fjernelsen registreres. Gange til fjernelse kan afbildes som en indlejret histogram, eller som en "tid-til-svigt" plot. Et eksempel på data afbildet som en "tid-til-svigt" plot er vist i figur 3B.
4. Hætteglas overvåges med 10 minutters intervaller i en maksimalt 10 timer (fig. 3B).

4. Motion, alder og Lokomotorisk Evne

1. Da denne uddannelse protokol bygger på inducerede køreadfærd, en primær analyse til kvantificering af effekten af ​​træning er at langs måle ændring i den gennemsnitlige hastighed under træning. I løbet af uddannelsen, er 120-fly kohorter af udnyttede og Uudnyttede fluer testet dagligt i deres reaktion på en negativ geotaxis stimulus. RING teknik described i Gargano et al. (2005) anvendes til at måle fluers stigeevne ^12. Kort fortalt denne teknik måler gennemsnitlige højde steg med et hætteglas af fluer under et defineret tidspunkt efter induktion af negative geotaxis. Højden steg i løbet af en defineret tid svarer til klatring hastighed. Målinger udføres før placere fluer på maskinen til daglig træning for at undgå komplikationer fra træthed efter dagens løb.
2. I vores standard-protokol, der er fluer udøves i alt tre uger og klatring evne er undersøgt for i alt fem uger: tre uger under træning, træning og to uger efter ophør af motion (figur 2). Dette tillader forsøgslederen for at kortlægge, om virkningerne af motion på mobilitet fortsætter efter ophør af programmet.
3. Fire fotografier af hver kohorte daglige RING ydelse anvendes til analyse af stigeevne. Seks hætteglas er inkluderet i hvert fotografi. Negativ geotaxis induceres, og ved hjælp af entimet kamera, et fotografi er taget efter et defineret antal sekunder. Vi anvender typisk to sekunder, selv om dette kan varieres afhængigt af forsøgsbetingelser. For hver fotografi, er hvert hætteglas opdelt i fire kvadranter af samme højde, og billedbehandling software bruges til at tildele hvert fly en score baseret på kvadranten nåede inden for den tilladte periode. Fluer at stige til den øverste kvadrant modtage en score på 4, flyver i næste højeste kvadranten modtage en 3, flyver i den næsthøjeste kvadrant får en 2, og fluer i den laveste kvadrant modtage en 1. Fluer, der ikke kravle ud af bunden overhovedet får en score på 0.
4. For hvert hætteglas i en given fotografi, er en "klatring index" frembringes ved at midle de scorer for alle de fluer, der hætteglas. Hvert hætteglas s indekser fra de fire fotografier midles da til at give en endelig klatring indeks for den pågældende dag.
5. Alle negative geotaxis eksperimenter udført i længderetningen. Resultater normaliseres to den indledende "pre-øvelse" score for at reducere effekten af ​​kohorten variation i klatring evne og fremhæve den relative langsgående ændring i en kohorte sin klatring kapacitet som følge af træning. Den første score bestemmes af gennemsnittet af de første tre dages klatring indekser og tildeles en værdi på 1. Efterfølgende forsøg derefter udtrykt som en procentdel af den oprindelige indeks.

5. Repræsentative resultater

Vildtype-fluer reagere på en udholdenhed protokol med en formindsket aldersrelateret fald i stigeevne, der varer ved efter afslutningen af ​​uddannelsen, som afspejlet i langsgående RING analyser på tværs af fem ugers alderen (figur 3A). Denne forsinkede fald i negative geotaxis er en standard fænotypisk reaktion, der kan tjene som en positiv kontrol for at sikre, at vildtype-øvelse reaktion sker normalt. Dette datasæt er præsenteret som et eksempel på hvordan induktion af udøvelse af Power Tejs program kan anvendes som en adfærdsmæssig input. Evnen af ​​forskellige genetiske eller miljømæssige faktorer til at modulere denne virkning kan derefter vurderes.

Omvendt kan Power tårnet også anvendes som et udgangssignal i forskellige eksperimentelle design. For eksempel kan genotype, kost, eller andre betingelser ændres. Derefter kan effekten af ​​disse variationer på træningsfysiologi testes ved hjælp af Power Tower. Her viser vi et eksempel på denne fremgangsmåde. Når flyver med en varierende procentdel af saccharose i deres kost blev testet for tiden til træthed, forøget saccharose korreleret med øget holdbarhed kapacitet (figur 3B).

Figur 1. Betjening af Power Tower. (Ac) motoriseret bøjede arm med påsat valse roterer med uret, indtil den kommer i kontakt med den bøjede firkantede rør. (D, E) armen presser ned på den bukkede firkantrøret , Forårsager den platform, der er lastet med hætteglas fluer at løfte. (F) som armen rydder røret platformen tillades at falde ned, hvilket tvinger fluerne til at vende tilbage til bunden af hætteglasset.

Figur 2. Foreslået Motion protokollen. Fluer udsat for uddannelsen protokollen er lavet til at udøve i fem dage hver uge under et tre uger langt ramped regime, der gradvist øger varigheden af ​​øvelsen fra de første 2 timer med 30 minutter hver uge. Standard analyser omfatter træthed analyser før og efter træningsprogrammet og RING analyser fra uge 1 til uge 5. Alle assays udføres in duplo på et lige antal udestående fluer som en negativ kontrol. Forskellige andre fysiologiske eller biokemiske tests kan udføres som bestemt af forskeren.

3786fig3.jpg "/>
Figur 3. Udholdenhedstræning ændrer flere aspekter af mobilitet. (A) RING analyser udført på langs på tværs af aldre i et enkelt par af mandlige Y ¹ W ^67C23 årgange. Age-matchede, genetisk identiske udøves, og udnyttede kontrol fluer blev målt dagligt i gennemsnit klatring hastighed. Resultaterne er udtrykt i form af en klatring indeks, der er normaliseret til det gennemsnitlige klatring højde på tværs af de første tre dage måling. Motion-uddannede fluer vises en formindsket aldersrelaterede fald i negativ geotaxis evne i forhold til alder-matchede udnyttede søskende på tværs af aldre (2-vejs ANOVA, p <0,005). (B) Træthed analyser udført i 8 timer om alder-matchede kvindelige Canton S fluer viser en signifikant effekt af kosten saccharose indhold på tide at træthed (log-rank p <0,0001). Forud for forsøget blev fluer fodret med en gær / saccharose / agar diæt med 10% vægt / volumen gær koncentration, og en varierende procentdelaf kosten saccharose. Fem hætteglas på 20 fluer hver blev undersøgt for hver diæt. Graf viser, hvor mange medicinflasker stadig har fem eller flere fluer, der kører på et givet tidspunkt. Disse resultater kan behandles statistisk og grafisk som en overlevelse (eller tid til at mislykkes) kurve, med "fiasko" for et hætteglas, der defineres som et punkt i tid, hvor mindre end fem fluer fortsætte med at reagere på negative geotaxis stimulus. Bemærk, at mange andre mulige forsøgsdesign og statistiske behandlinger er mulige, og data behandling og måling skal tilpasses til at passe de enkelte formål.

Discussion

Den almindelige protokol præsenteres her har været en succes at dokumentere fysiologiske effekt efter træning. Men flere områder i denne protokol er genstand for ændringer til at passe særlige eksperimentelle behov. For eksempel kan længden af ​​træning og antallet af anfald potentielt varieres for at gøre programmet mere eller mindre udfordrende, som ønsket. Højden af ​​beholderen, i hvilken negativ geotaxis evne måles kan ændres for at øge det tilgængelige område for forbedringer skal dokumenteres. Forskellige metoder til at automatisere kvantificering af klatring hastighed kan også være anvendelig. I princippet kan enhver software program, der kan skelne en flue fra baggrunden bruges til at fremskynde dataindsamlingen processen.

Nogle aspekter af protokollen bør ændres kun med stor forsigtighed, dog. For eksempel, stærkt indledende forsøg indikerer, at mindst én hviledag om ugen har tendens til at fremme større Visnovement end ubarmhjertige daglig motion. Derudover er cirkadiske rytmer og temperatur som vides at påvirke bevægelsen af ​​koldblodede dyr. Den tid på dagen, at uddannelse finder sted kan varieres, men bør altid være konsistente inden for særlige grupper, der sammenlignes, for at undgå muligheden for forstyrrende virkninger af døgnrytmen. Temperaturkontrol er også vigtigt, og vi anbefaler en dedikeret rum ved konstant temperatur hus træningsmaskiner. Endelig skal mænd og kvinder kan opdrættes og måles separat med henblik på at undgå potentielle forstyrrende virkninger af fertilitet og køn forskelle i den fysiske kapacitet.

Potentielle anvendelser af denne metode er kun begrænset af fantasien hos forskeren. I indledende arbejde, har vi brugt denne metode i tre brede programmer:

1. For at måle effekten af ​​udholdenhedstræning på forskellige aspekter af vildtype biologi på tværs af aldre.
2. To måle effekten af ​​udholdenhedstræning på specifikke mutant-fænotyper.
3. At screene for genetiske faktorer, der er nødvendige for at udføre fordelene ved motion

Hver af disse applikationer omfatter en lang række specifikke muligheder. Baseret på vores foreløbige erfaringer, har en tendens mutant fænotyper at variere med motion niveau så meget som de varierer med kost. Brugen af ​​hvirvelløse modeller til bedre at forstå sammenhængen mellem kost, motion, og aldring fysiologi er måske den vigtigste generelle anvendelse af denne protokol.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dayton Gearmotor	Grainger	1LRA6A
Raco Electrical Box	Grainger	5A052
Raco Cover	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Fuse	Grainger	6F043
Cooper Bussmann Fuse Holder	Grainger	1DD33
Carling Technologies Switch	Grainger	2X464
Dayton Control, AC/DC Speed	Grainger	4X796
Flugs for Narrow Plastic Vials	Genesee Scientific	49-102